细菌内毒素检查新方法进展.pdf

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*通讯作者Tel:

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pyshnifdcorgcn细菌内毒素检查新方法进展裴宇盛，蔡彤，高华*（中国食品药品检定研究院，北京100050）摘要:

细菌内毒素检查法（鲎试验法）作为检验药品、植入医疗器械中细菌内毒素污染的一种经典方法，广泛应用于药品检验、科研工作。

本文综述了该方法的最新方法重组C因子法的相关进展，并且与经典的细菌内毒素检查法、热原检查法和体外热原检查法进行了优缺点比较，并对这种方法的发展做了展望。

关键词:

细菌内毒素检查法;重组C因子法;热原检查法;体外热原检查法;药典综述中图分类号:

917文献标识码:

A文章编号:

02541793（2014）03039204ProgressonnewmethodsofbacterialendotoxintestPEIYusheng，CAITong，GAOHua*（NationalInstitutesforFoodandDrugControl，Beijing100050，China）Abstract:

Thebacterialendotoxintest（limulusamebocytelysatetest）iswidelyusedinthedruginspectionandscientificresearchesisaclassicalmethodtotestcontaminationofendotoxinsondrugsandimplantablemedicalde-vicesThedevelopmentofalatestbacterialendotoxintestmethod，whichwasindicatedastherecombinantfactorCmethod，wassummarizedinthisarticleThemajordifferencesbetweenbacterialendotoxintest，pyrogentestandinvitropyrogentestwerecomparedMoreover，thefutureprospectofthismethodwaspredictedaswellKeywords:

bacterialendotoxintest;recombinantfactorCmethod;pyrogentest;invitropyrogentest;Pharmacopoeiasummary细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断样品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法1，2010年版中国药典收载的用细菌内毒素检查法来控制产品质量的品种已达506种，现行世界各国药典以及国际药典对此方法均有收载27。

鲎试剂被广泛应用于检测注射剂与植入性医疗器械中污染的革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以及临床使用的透析液和血液中的细菌内毒素含量。

鲎试剂是由美洲鲎（Limuluspolyphemus）或东方鲎（Tachypleustri-dentatus）的血液变形细胞溶解物提取而成，其主要包括C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原（或显色基质）以及二价阳离子、缓冲盐等。

目前细菌内毒素检查法按反应原理分可分为凝胶法、浊度法、显色基质法。

经过多年发展，产生了新的重组C因子法。

重组C因子法是使用由圆尾鲎（Carcinoscorpiusrotundicauda）或东方鲎（Tachypleustridentatus）的基因克隆而制成8的重组C因子与内毒素反应，以终点法定量测定荧光底物的单步酶促反应裂解产物来量化细菌内毒素的一种方法。

1重组C因子反应机理与经典鲎试剂反应机理比较传统鲎试剂中，酶的级联反应的基本原理已经被广泛研究913，见图1A。

鲎试剂级联反应的第一部分是C因子（FC），它与内毒素连接而被激活后，再激活其他蛋白酶原1112，14，产生一系列酶的级联反应，最终使凝固蛋白原转化为凝固蛋白，形成凝胶。

在鲎试剂与内毒素的反应中，可检测到内毒素剂量与鲎试剂的依赖性反应。

动态浊度法中，内毒素最终导致凝固蛋白原转化为凝固蛋白，引起浊度的剂量依赖性增加;动态显色法中，酶联反应会使293药物分析杂志ChinJPharmAnal2014，34（3）合成显色底物裂解而产生黄色。

另1条由葡聚糖介导的基于鲎试剂的G因子（FG）通路同样可以引起相似的反应因此产生假阳性结果。

图1细菌内毒素检查法（A）与重组C因子法（B）机理比较Fig1Comparisonofproceduresofthebacterialendotoxintest（A）andtherecombinantfactorCmethod（B）重组C因子法与传统鲎试剂方法最大的区别在于重组C因子法只使用1个单一的蛋白（重组C因子）作为其有效活性成分。

在反应中内毒素激活重组C因子，活化的重组C因子将荧光底物裂解，产生荧光复合物，定量测定荧光复合物来量化细菌内毒素，见图1B，从而有效地避免了葡聚糖产生假阳性的可能性。

由鲎科动物圆尾鲎克隆而成的重组C因子蛋白与美洲鲎天然产生的C因子氨基酸序列有90.5%相同15。

2实验操作方法文献15中提出重组C因子法是以单步终点荧光法测定内毒素。

试验的具体操作为:

将细菌内毒素标准品和样品按要求的浓度进行溶液配制，然后在微孔板中分别加入空白对照溶液、细菌内毒素标准对照溶液以及供试品溶液和供试品对照溶液，加样体积为100L，将微孔板放入荧光酶标仪中，在（371）下预热10min后每孔加入rFC/底物试剂100L，立即读板获得初始数据（激发/发射波长380/440nm），将微孔板在荧光酶标仪中孵育60min，再次读取数据（激发/发射波长380/440nm）。

标准对照和样品的修正荧光值（在60min读取的荧光值减去初始荧光值）用修正空白对照荧光值标准化（normalized），用标准化的标准对照荧光值的对数值与标准内毒素浓度值的对数值作图，以最小二乘法进行线性拟合，所得标准曲线的线性范围为0.0110EUmL1。

再由标准曲线回归得到的公式计算出样品中的内毒素值。

重组C因子法对线性相关系数、阴性对照和样品回收率的要求均与细菌内毒素检查法相同。

实验中所使用的所有相关耗材均应无内毒素。

3方法验证文献15按照USP30NF251225“符合法规的验证程序”分别就重组C因子法的专属性、精密度、准确度、线性范围、定量限进行了验证。

专属性实验分为3个部分。

第一部分是由6个实验室，每个实验室的3个分析人员，对10个品种使用重组C因子法和经典内毒素检查法中动态显色法进行实验比较。

试验的稀释倍数为MVD（最大有效稀释倍数）、MVD/2和MVD/10，供试品溶液阳性对照浓度为0.1EUmL1。

共进行了168次测量，结果为重组C因子法回收率在（10025）%范围内的批次比率为85.7%，较优于动态显色法的75.0%;第二部分是使用重组C因子法、动态显色法和动态浊度法3种方法，对来自Ecoli（大肠杆菌）O113:

H10:

K（）、EcoliO55:

B5、PseudomonasaeruginosaFDType1（绿脓杆菌）、Salmonellamin-nesota595（e）（沙门氏杆菌）4种不同菌株的内毒素进行定量检测，并将检测数值进行比较。

结果重组C因子法的检测值位于动态浊度法和动态显色法的检测值之间;第三部分是分别用重组C因子法和动态显色法对1，3葡聚糖进行检测，结果表明重组C因子法对1，3葡聚糖无响应而动态显色法产生了假阳性结果。

中间精密度的验证是由3个实验室对标准内毒素的高、中、低3个浓度在不同的3d进行试验，与动态显色基质法比较，除高浓度的结果重组C因子法的中间精密度SD值显著低于动态显色法外，其余无显著性差异。

单个结果准确度验证通过对标准内毒素的高、中、低3个浓度，由3个实验室每个实验室3个人，在不同的3d进行测定，测定值在理论真值的25%之内的百分数为指标，比较重组C因子法与动态显色法的准确度差异，结果显示差异无显著性。

线性范围在0.0110EUmL1内线性关系良好。

最低检测限是通过3次独立试验测定的结果确定。

每次试验使用1个批号的试剂和5个批号的内毒素检查用水，将细菌内毒素标准品用检查用水稀释至0.01EUmL1进行测定，将其荧光检测值与检查用水的检测值进行比较，结果0.01EUmL1393药物分析杂志ChinJPharmAnal2014，34（3）浓度的内毒素检测值的99%置信区间和水之间没有重叠，表明在测定中浓度为0.01EUmL1的内毒素和水可以明显地分开。

精密度和准确度实验表明，定量限至少是0.01EUmL1，因此将最低检测限确定为0.01EUmL1。

4重组C因子法与其他热原检测方法的比较目前，用于控制热原的方法主要有传统家兔法（PT）、细菌内毒素检查法（BET）和国际上最新的体外热原检查法（IPT）。

此3种方法各有优缺点。

家兔法基于哺乳动物发热反应，能够检测所有类型的热原物质，并能正确反映外源性热原引起哺乳动物复杂的升温过程。

它存在的缺点有:

灵敏度低;无法定量检测;与人的种属差异大;动物间个体差异大;对于某些放射性药物、毒性大的药物、本身具有降低体温药效的药物等无法进行正确检测;使用动物，不符合3原则;需建立动物房，试验费用高，周期长。

家兔法曾广泛应用于热原控制，随着细菌内毒素检查法的普及，使用热原法的品种逐渐减少，目前主要用于部分中药和不适用于内毒素检查法的少量化学药品以及部分血液制品和疫苗。

细菌内毒素检查法是基于节肢动物防御机制原理，具有高灵敏度，可定量检测，可标准化，试验费用低，试验周期短，操作简便易于推广等优点。

其缺点包括:

只能检测细菌内毒素一种致热物质;与人的种属差异大;使用动物，不符合3原则;无法考察某些含有内源性热原因子的生物制品与内毒素产生的致热协同作用等。

由于其突出的优点，内毒素检查为目前控制热原污染的主要方法，除了对内毒素与鲎试剂强烈干扰的少数制品，以及成分复杂的中药、生物制品外，内毒素检查法应用于绝大部分的化学药品、生物制品、医疗器械的检验。

体外热原检查法是基于人体发热反应而建立，系利用人的血液或各种来源的人源细胞模拟人体，将其与热原共同孵育，通过免疫化学方法如酶联免疫吸附测定法（enzymelinkeimmunosorbentas-say，ELISA）检测孵育体系中相关细胞因子的含量变化，间接反映热原物质存在与否的新方法。

其突出优点为无种属差异，可以检测各类致热物质，可以定量分析，并且不使用动物来源的材料。

2009年该方法被收载于EP6.7，同年FDA认可并接受了5种体外热原检测方法。

该方法的缺点主要包括:

采用的血液或细胞存在不同个体对热原敏感性的差异;无法检测对细胞因子分泌有影响的药物和具有细胞毒性的药物;检验周期长;人血液及细胞获取较困难;检测指标尚未统一;方法还需进一步验证、评价。

重组C因子法是传统细菌内毒素检查法的一种改良方法，具有细菌内毒素检查法的全部优点。

与细菌内毒素检查法比较，还克服了使用动物来源材料这一缺点，实验材料为重组产生，不受鲎资源限制;并且具有更强的抗干扰能力和专属性。

该方法的缺点有:

只能检测细菌内毒素1种致热物质;与人的种属差异大;无法考察某些含有内源性热原因子的生物制品与内毒素产生的致热协同作用等。

重组C因子法作为细菌内毒素检查法的改良补充方法，适合于所有细菌内毒素检查法的制品和对内毒素检查法存在旁路干扰而无法检测的制品。

5FDA与EDQM官方对重组C因子法的认可FDA在2012年发布的“内毒素与热原检测应用指导原则问与答16”的“5.1有关替代方法”中明确说明重组C因子法按USP30NF251225验证后，参照USP30NF2585“细菌内毒素检查法”进行实验，可用于产品申报，在产品放行中可以使用该方法来控制内毒素污染。

EDQM对于该方法的态度为“官方认可方法但药典中未收录”，若使用该方法进行药品检验，需要按照EP6.0中“5.1.10细菌内毒素检查法应用指导原则”第13条“替代方法的验证”进行验证。

目前EDQM已准备将其收录入药典，相关工作已经开展。

6应用重组C因子法主要有以下4种应用:

6.1注射用药品的内毒素控制由于重组C因子法与经典的细菌内毒素检查法应用范围相似，因此重组C因子可用于注射用药品的细菌内毒素检测，如文献17中将重组C因子法应用于纳米技术研制的疫苗以控制细菌内毒素污染。

6.2环境内毒素的检测研究比较经典内毒素检查法和重组C因子法用于检测室内灰尘的内毒素含量1819。

6.3用于医疗器械内毒素污染控制在FDA批准的两类医疗器械的申请材料中，选择了该方法控制细菌内毒素2021。

6.4开发重组C因子试剂盒ELISA法广泛应用于生物分析和诊断，该方法灵敏、可靠。

但是由于内毒素具有两相性，难以研制出对内毒素具有高特异性和高亲和度的抗体22，因此基于ELISA法的内毒素检测一直处于理论状态。

2012年，基于酶标板预包被以及重组C因子技术的一种具有高选择性、高灵敏度的内毒素检测试剂盒终于问世。

由于选用了493药物分析杂志ChinJPharmAnal2014，34（3）对内毒素保守核心区域具有高亲和力和高选择性的噬菌体源受体蛋白22，实现了对内毒素的选择性捕捉。

如同经典的ELISA法，反应的第1步为样品中的内毒素与预包被的酶标板结合，之后将样品基质洗脱，因此消除了样品带来的干扰因素;测定的第2步为内毒素激活重组C因子，活化的重组C因子再与荧光底物作用，产生荧光。

由于采用四参数拟合运算进行数据处理，因此本方法拥有宽泛的检测范围，检测范围为0.05500EUmL122。

这种方法和已有的内毒素检查法有非常好的相关性，15种菌株的内毒素用该方法和细菌内毒素检查法进行检测，数值的相关性2=0.9122。

该方法抗干扰能力强，对高盐强电解质和有机溶液耐受力强，在pH49范围可直接检测，对清洁剂的耐受程度比细菌内毒素检查法高50倍。

对二甲阳离子的反应与细菌内毒素检查法相似，柠檬酸盐和EDTA会对反应产生干扰，需要稀释排除干扰，对于该方法来说，可以外加镁离子来中和EDTA再洗脱22。

7展望重组C因子法能达到USP对于方法的验证要求，与经典的内毒素检查方法相比，具有相似或者更好的专属性、精密度、准确度、线性、范围、定量限。

该方法的突出优点为重组C因子为基因工程产品而非生物来源，这符合实验动物3理论（减少、优化、替代），对保护鲎资源有积极意义。

在反应原理上，重组C因子法无旁路干扰，从根本避免了旁路G因子引起的假阳性的发生，体现出更高的特异性。

而基于ELISA和重组C因子的方法除了上述优点外，显示出固相的ELISA检测优势，可以最大程度地去除样品底物对检测带来的干扰，进一步保障检测的灵敏性和结果的可靠性。

FDA与EDQM与对该方法均表示认可。

综上所述，该方法具有突出的优点并且在检测细菌内毒素方面有着一定的前景。

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