半番鸭和北京鸭MC1R基因的克隆与序列分析.pdf

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38ChineseAgriculturalScienceBulletinV0124NoII2008Novemberhttp：

llwwwcasborgcn半番鸭和北京鸭MClR基因的克隆与序列分析郑嫩珠1，王安静L2，陈晖1，朱志明1，缪中纬1，李盛霖1，董晓宁1，王光瑛2（-福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福州350013；2福建农林大学动物科学学院，福建，福州350002）摘要：

羽色是半番鸭一个重要的经济性状。

黑素皮质素受体l（melanocortinreceptorl，MClR）基因是控制动物黑色素合成的重要基因。

根据鸡、鹌鹑、雪雁、孔雀等MClR基因同源序列的保守区设计l对引物，以半番鸭、北京鸭总DNA为模板，PCR扩增，克隆测序。

结果，获得了2个长度为900bp的基因片段，并提交GcnBank。

登录号分别为EU877265和EU877264。

经比对，发现北京鸭与半番鸭核苷酸序列存在8个变异位点，其中位于184bp（TA）、229bp（GA）、364bp（AG）、385bp（GA）处的变异导致了氨基酸序列分别在第62位（cs）、77位（EK）、122位（TA）和129位（wt）发生突变。

为进一步研究半番鸭羽色MClR基因单核苷酸多态性（SNP）奠定了基础；通过BLAST进行相似性搜索，结果表明，鸭与黑雁MClR基因的核苷酸序列同源性最高为984，与其他家禽的同源性也保持在928982之间。

可见禽类的MClR基因编码区序列具有高度的保守性；系统进化分析表明，半番鸭、北京鸭与雪雁、黑雁、皇雁亲缘关系相近。

从分子角度验证了它们在动物学分类上的地位。

关键词：

半番鸭；北京鸭；MClR基因；克隆；序列分析中图分类号：

$8133文献标识号：

AMolecularCloningandSequenceAnalysisofMClRGenefromMuleDuckandAnasPlatyrhynchosZhengNenzhul，WangAnjin91乞ChenHuil，ZhuZhimin91，MiaoZhongweil，LiShenglinl，DongXiaonin91，WangGuangyin92（1InstituteofAnimalHusbandryandVeterinary肘ed记i船，rujimAcademyofAgriculturalSciences，Fuzhou350013；2CollegeOfAni,以Science，聊洳AgricultureandForestryUniven魄Fuzhou，Fujian350002）Abstract：

PlumagecolorisaimportanteconomytraitMelanocortin1-receptor（MC1R）geneisakeygeneinmelanogenesisinmammalApairofoligonucleotideprimersweredesignedaccordingtotheconservedregionofMClRgeneofgallus，coturnixjaponiea，ansercaerulescens，andpavocristatusPCRamplifications，cloningandsequencingwereperformedonmaximaDNAofmuleduckandanasplatyrhynchosTheresultsshowedtwofragmentsof900bpwereobtained，whoseaccessionnumberswereEU877265andEU877264intheGenBank，respectivelyThe8mutaionswerefoundinthetwofragmentsThemutationsin184（TA），229（GA），364（AG）and385（GIA）ledtotheaminoacidreplacementat62（CS），77（EK），122（TA）and129（vI）respectivelyTheresultswerethebasicinformationtofurtherstudySNPsofMC1RgeneassociatedwithplumagecoloronmuleduckByusingtheprogramofBlastonGenBank，theresultsindicatedthatduckhadhomologywitll984homology埘thbrantaberniclaatnucleotidelevelofMC1Rgeneand928-982基金项目：

福建省科技厅重点课题。

半番鸭羽色MCIR基因SNP标记的筛查及其在品系选育中的应用”（2006N0024）和福建省科技重大专项课题地方畜禽品种的选育与开发利用”（2006N0003）第一作者简介：

郑嫩珠，女，1972年出生，副研究员，硕士，主要从事动物分子遗传育种研究。

通信地址：

350013福建省福州市晋安区新店埔党福建省农科院畜牧兽医研究所，Emarl：

zhengnz163啪。

通讯作者：

陈晖。

女，研究员，主要从事动物遗传育种研究F-mail：

zhengnz163咖收稿日期：

2008-0814，修回日期：

2008-09-06万方数据中国摹擘c星擅第24卷第11期2008年11月http：

#wwwcasborgCll39homologywitIlotherbirdsTheresultsdemonstratedthatMC1RgeneofbirdwasrelativelyconservedTheresultsofphylogeneticanalysisshowedthatconsanguinityrelationsbetweenmuleduck，ariasplatyrhynehosandbrantabemiela，ansercaerulescens，ansercanagicawerecloseThestatusofthemwasconfirmedonzo-ologylbymeansofmolecularmethodKeywords：

muleduck，ariasplatyrhynchos，MC1Rgene，cloning，sequenceanalysis黑素皮质素受体l（melanocortinlreceptor，MClR）基因，又称促黑素细胞激素受体（Melanocytestimulatinghormonereceptor，MSHR）基因，由毛色扩展位点（Extensionlocus，D编码，为G蛋白耦合受体家族成员，长度一般为310个氨基酸（牛是317个、鸡是314个）11。

MClR基因只有一个外显子，其蛋白有7个跨膜结构域，为最小的G蛋白耦合受体。

MCIR基因主要与黑色素合成有关。

Mountjoy等2】分析证明此受体显然在黑色素细胞与黑色素合成激素（促黑色素细胞激素aMSH，促肾上腺皮质激素ACTH）的互作中起重要的信号传递作用。

杨永升等【3J也证明a-MSH和ACTH是MClR的配体，两者与黑色素细胞膜上的受体（MCl鼬结合时后，激活膜上的环腺苷酸酶系统，产生cAMP，进而激活酪氨酸激酶产生黑色素，它们的结合实现了对动物毛色或羽色的调控。

MClR基因是研究皮毛色素沉积的常用候选基因悯，已经证明MClR基因在鸡羽色性状中是主效基因的可能性61，同时已知鸡、鹌鹑、火鸡等禽类的MClR序列删。

各个不同禽类间MClR基因组结构以及调控机制是否相同还有待于进一步研究，因此获得不同物种间MClR序列信息对研究禽类MClR基因的表达及调控机理具有重要的作用。

研究表明，半番鸭羽色表现起主导作用的是母本家鸭【9】。

目前国内外还没有任何有关半番鸭及家鸭MClR基因的报道，笔者拟通过对半番鸭及北京鸭MCIR基因的克隆和测序，并对其进行了生物信息学分析，一方面为进一步研究半番鸭羽色性状SNP多态性奠定理论基础，另一方面也可以丰富鸭基因物理图谱中基因标记信息，为鸭分子育种提供基因素材。

l材料与方法11试验时间、地点研究田间试验于2007年在福建省龙岩市省农科院白羽半番鸭示范推广基地进行，室内试验在2007年至2008年在福建省农科院畜牧兽医研究所省畜禽分子遗传育种实验室进行。

12材料121试验动物试验鸭来自福建省农科院白羽半番鸭示范推广基地饲养的北京鸭（中国农科院引进）以及北京鸭与公番鸭杂交生产的半番鸭。

122主要试剂EXTaq聚合酶、dNTPs、pMDl8T载体和DNAMarker（DL2000）购自大连宝生物有限公司；离心柱型琼脂糖凝胶回收试剂盒购自德国BBI公司；质粒提取试剂盒购自北京天为时代生物公司。

123引物设计与合成根据GenBank上的鸡、鹌鹑、血雁、孔雀等鸟类MClR基因序列，利用软件Oli9060和PrimerPrimer50软件在它们同源保守区内设计一对引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

引物序列为：

上游引物：

5-GCCAGTGAGGGCAACCAGAG3下游引物：

5-CTACCAGGAGCACAGCACCA3预期扩增出约900bp的PCR条带。

13试验方法131基因组DNA提取分别对半番鸭及其母本北京鸭个体翅静脉采血，EDTA抗凝，20保存。

每个个体各取301上1抗凝血，加禽血红细胞裂解液消化，苯酚氯仿抽提。

检查浓度和纯度，达到试验要求的样品（纯度在1719之间）用TE稀释成50ng斗l，4保存备用。

132PCR扩增利用设计的引物对半番鸭和家鸭基因组DNA进行PCR扩增。

PCR反应体系为：

模板DNAl5斗l，10xbuffers201d，25mMdNTPl61xl，10斗M上下引物各08斗l，EXTaqDNA聚合酶05U，加ddH20至20斗l。

PCR反应条件为：

94预变性5min；94变性30s，64退火30s，72延伸60s，33个循环；72总延伸8min；4。

C保存。

PCR产物用12琼脂糖凝胶电泳检测。

133PCR产物的克隆测序按照回收试剂盒说明回收目的片段，连接TA载体，转化感受态大肠杆菌DH5a，提取质粒DNA，双酶切鉴定后，每个样本挑取23个阳性克隆子送至大连宝生物技术有限公司进行双向测序。

测序结果利用NCBI网站的Blastn和DNASTAR软件进行序列比较分析。

2结果与分析21PCR扩增电泳结果半番鸭及北京鸭基因组DNA经PCR扩增电泳后，得到一条亮度强、前后无非特异性带且大小与预期值吻合的900bp的目的条带（图1）。

据此，初步估计其为半番鸭及北京鸭MClR基因片段。

万方数据40ChineseAgriculturalScienceBulletinV0124No112008Novemberhttp：

wwwcasborgcn图1鸭MClR基因的PCR结果图2鸭MClR基因的质粒酶切电泳结果22重组质粒的酶切鉴定将PCR回收产物插入pMDl8一TVector载体的多克隆位点后获得重组质粒，重组质粒经HindllI和BamHI双酶切电泳后，除了载体和外源基因两条带外，并无其他杂带（图2），说明其为阳性克隆子，可送去测序。

23测序结果分析利用DNASTAR软件对测序结果进行处理后，半番鸭与北京鸭都分别获得了900bp核苷酸序列，共编码299个氨基酸。

这两个核苷酸序列均已成功登录GenBank，登录号分别为：

EU877265和EU877264。

通过比对发现两序列高度相似，其中核苷酸序列在141bp（AG）、162bp（GA）、180bp（C厂r）、184bp（TA）、229bp（GA）、364bp（AG）、385（GA）、399（GA）等8个位点发生突变，且以GA（或AG）转换为主，它们的相似性达991；氨基酸序列在第62位（CS）、77位（E鼢、122位（TA）和129位（VD各有一个突变，相似性为987。

核苷酸和氨基酸序列见图3和图4。

半番鸭GccAG他AGGGCAAccAGAGcAAcGccACGGCCGGGGclAGGOGOcTGGl优cAGGGGcT0队cGT68北京鸭一一二一一半番鸭GcOCAAcGAACTCTTOCTCACGcTGGGGCrGGTGAGOCTBG眦AGAAcCrGcTGGTGG眦ccGCCA136北京鸭一一一半番鸭TCTAAAGAuACAGGAACcTG强CIGOCCATGTAcTACTrcATCTGm0C咖00GTclCGACATG204北京鸭一一卜一一一一A_一卜_A半番鸭CrGGTGAGCGTcAGcAAOCrGGCGGAGAOGcTc眦ATGcTGcTGA懈AGCATGGcGTGCTGGTGAT272北京鸭一_A一一半番鸭OCACGoCAGcATCATOCGCcAcATGGAC从cATCATCGAcA眦，IATCTGCAG饿CGlGTGTcCT340北京鸭一一一一一一一半番鸭0ccTa【cT）C1粥GGGlBATcAccGTGGAccGcTAcATcACCGTclTCrAcG0。

CTGOGcTAccAC408北京鸭一哥一A_一A一半番鸭AGCATCATGAoGCmCAGOGGG00GTGGlACCATGGCCAGOGTCrGGc他GcCAGcACOGTCICAG476北京鸭一一一一一万方数据中国蓐掌通擅第24卷第11期2008年11月http：

llwwwcasborgcn41半番鸭cACCGTc”cATcAccrACrAcOGc从CAAOGCCATOClC1cTGCCrcATOGGc丌CrlcCTCrTcA544北京鸭一一一半番鸭代CTG盯cClATocTGG他CTcTAcATOCAcA研1cGcCcTGGc0CGOCAcC0CTGOGcAGCATc612北京鸭一一一一一一半番鸭1cAGOcAGcAGAAGCAOCCcG00GTCTAcCAOCGCAGOCTGAGGGAGccGTGAcGcTCAccAT680北京鸭一一一一半番鸭0CTGmGG啷cTrcrlATcl优TGGGGG0cCrTcr研1cAccTcAT0cT伽0G1cA0crGcc748北京鸭一一一一一半番鸭0CAcc从cCOCT唧GCACCTGc订cTTOGGCrAcTlMcCTclT0cTCAl_cclATcAT眦Mc816北京鸭一一一一半番鸭1GG懈TcGAC00CCrcATCTATGO叫10GGAGCcAGGAGcTOCGGcGGACGmCGGGAGGrGGT884北京鸭一一一一半番鸭GCTGTGcTccrGGTAG900北京鸭一一图3半番鸭和北京鸭MClR基因核苷酸序列注：

表示核苷酸序列相同-Indicatestheidentityofnuclcotidcs。

半番鸭ASEGNQsNATAGAOGAWCQGLDvPNELFLT帆vSL、ENLLw从ILKN刚sPMYYFIOCLAvSDM68北京鸭一一s半番鸭LvsVs眦AElLF札L姬IG_VLvIHAsII刚岫NID儿IcSs、rvssLsFLGVIT、球Y11、FYALRYH136北京鸭一一-一K一一一AI一半番鸭SI胛LqRAvvTMAs、，lLASTvssTvFITYYRNNAILLcUGFFL雕LIL儿、LY删MFALARH。

RSI204北京鸭一一一一一半番鸭sSQQI伸AvYRTs吼KGAvTLTILLG、FFIcwGPFFFHULTcPTNPFc7IFFGYFNLFLILIICN272北京鸭一一一半番鸭SvvDPLIYAFRsQ也隙1LRE、r、忧SW300北京鸭一一图4半番鸭和北京鸭MClR基因氨基酸序列通过NCBI网站的Blasm进行相似性搜索，结果显示99条序列与两者具有高同源性（90以上），这些序列均为MClR基因，由此可以确定该实验得到了半番鸭和北京鸭的MClR基因序列。

24鸭与其他禽类间MClR基因同源性比较将半番鸭和北京鸭MClR基因的核苷酸序列与已发表的鸡（AB201628，Gallusga船）、鹌鹑（AB201633，Coturnix，aponica）、雪雁（A