T-SPOT-TB试剂盒在结核病临床诊断中的应用价值.pdf

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塑3117临床研究TSPOTTB试剂盒在结核病临床诊断中的应用价值李峤珂昊雪琼阳幼荣张俊仙梁建琴王安生张广宇张涛王兰摘要目的：

研究TSPOTTB试剂盒在结核病临床诊断中的应用价值。

方法：

应用TSPOTTB试剂盒检测结核感染组（包括26例临床已确诊结核痛患者和4例PPD强阳性志愿者）和非结核感染组（包括20例PPD阴性的非结核病患者和10例PPD阴性的健康对照者）外周血单个核细胞，观察宽点形成细胞（SFC）的数量。

结果：

30例结核感染组中，28例（933）TSPOTTB检测阳性其中4例PPD强阳性志愿者检测均为阳性；30例非结核感染组中。

仅1例（34）TSPOTTB检测阳性。

TSPOTTB阳性组的SFC显著高于TSPOT11B阴性组。

在29例TSPOTTB阳性者中。

310检测孔A（ESAT6抗原）和B（CFP10抗原）均阳性，448仅检测孔A阳性，242仅检测孔B阳性。

结论：

TSPOTTB试剂盒在检测结核感染、辅助结核病诊断方面具有很高的应用价值。

关键词结核；TSPOTTB试剂盒；酶联免疫斑点法；诊断DiagnosticvalueofTSPOT-TBkitfortuberculosisLIQ洳-ke，WUXue-qiong，MMYou-rong，ZHANGJunxian，LlANG|而nqin，WANGAn-sheng，ZHANGGuang-yuZHANGTao，WANGLanTuberculosisResearchInstitute，the309thHospitalofChinese脱A，Beijing100091。

c矗inaCorrespondingauthor：

WUXueqiongE-mail：

埘nxueqiong263net【Abstract】ObjectiveToinvestigatethediagnosticvalueofTSPOT邢kitfortuberculosisMethods11leperipheralbloodmononuclearcells（PBMC）fromTBinfectiongroup（containing26TBpatientsand4volunteerswithpositivePPDskintest）andnon一1Binfectiongroup（containing20non-rIBpatientsand10healthyvolunteerswithnegativePPDskintest）weredepotedbyTSPOTTBkitmanufacturedbyOxfordlmmunoteeInc，UK111espotformingceils（SFC）wereenumeratedResultsInTBinfectiongroup，933（2830）werepositivebyTSPOTTBdetectionand4volunteerswithpositivePPDskintestwereallpositivebyTSPOTTBdetectionInnon一1Binfectiongroup，onlyl（34）waspositivebyTSPOT-11BdetectionrnleSFCsinpatientswithpositiveTSPOT-TBdetectionweresignificantlyhisherthanthatinpatientswithoutpositiveTSPOT佃detectionOf29ca$eswithpositiveTSPOTTBdetection31OESAT一6peptideantigenandCFP10pepfideantigenwereallpositive，448onlyESAT-6peptideantigenwaspositive，242onlyCFP-10peptideantigenwaspositiveConclusionTheTSPOTTBkitcouldbeusedtodetectTBinfectionandtoassistthediagnosisoftuberculosis【Keywords】Tuberculosis；TsPoT-rIBkit；Enzyme-linkedimmunospotassay；Diagnosis酶联免疫斑点实验（enzymelinkedimmunospotassayELISPOT）技术在近年来得到广泛的关注。

其出色的敏感性和特异性使其不但成为最吸引人的免疫监测候选方法之一，而且可以应用于疫苗的研发、临床诊断以及基础研究等多个方面。

英国OxfordImmunotec公司研制的TSPOTTB试剂盒。

doi：

103969iissn1（）065725201017018基金项目：

国家重大传染病防治科技重大专项基金资助项目（编号：

2008ZXl0003001）；国家自然科学基金资助项目（编号：

30471648）作者单位：

100091北京市，解放军第309医院全军结核病研究所（李峤珂现工作单位：

614000四川省乐山市，武警四川省总队医院内一科）通信作者：

吴雪琼Email：

WUxuecllong263net可检测结核杆菌特异的效应T淋巴细胞。

用于结核杆菌感染的检测和结核病的辅助诊断。

本研究应用26例结核病患者、4例结核感染者、20例非结核病患者和10例健康对照者的血标本评价该试剂盒诊断结核病的临床价值，现将结果报告如下。

l对象与方法11研究对象解放军第309医院心血管内科、消化内科和神经内科住院患者20例。

健康志愿者10例，此30例均无任何结核病临床症状且皮肤PPD实验均为阴性。

作为非结核感染组其中男13例，女17例，年龄1872岁，平均490岁。

全军结核病研究所结核病患者26例，其中肺结核16例、肺结核合并胸膜炎6例、结核性胸膜炎4例12例依据痰涂片抗酸染色阳性、痰培养分枝杆菌阳性确万方数据3118诊14例依据临床症状和胸部x线片确诊；PPD强阳性、无任何结核病临床症状且相关检查结果无异常的志愿者4例，其中l例为2型糖尿病、3例为健康志愿者，此30例作为结核感染组，其中男12例，女18例，年龄1675岁，平均405岁。

12主要试剂和仪器TSPOTTB试剂盒由上海复兴医药股份有限公司惠赠；1640培养液系美国GIBCOBRL公司产品；淋巴细胞分离液系上海恒信化学试剂有限公司产品；酶联免疫斑点分析仪由美国CTL公司中国销售部提供使用。

13方法131外周血T淋巴细胞的分离抽取外周静脉血4mL至肝素钠抗凝的无菌管中，实验前颠倒混匀，避免血液分层，缓缓加入到含等体积的淋巴细胞分层液的无菌离心管中，使两者形成明显界面于l600g离心30min可见外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells，PBMC）存在于云雾层中，用无菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中；用1640培养液洗涤、离心2次：

于显微镜下计数细胞数，将细胞用完全细胞培养液调至25l&mL。

132TSPOTTB检测每个测试样本需要微孔板4孔：

在阴性对照孔内加入细胞培养液50此；在阳性对照孔内加入阳性对照PHA50IxL：

在2个测试孔内分别加入结核杆菌混合多肽A即ESAT6抗原和混合多肽B即CFP10抗原各50“L。

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翅在上述孔内，加入100IxL25l&mL的PBMC。

将微孔板放人（371）oC含5C02培养箱中孵育18h。

洗板4次后，加入新鲜配制的1：

200的标记抗体工作液50斗L，于4孵育60rain。

再次洗板4次，加入底物溶液50斗L，于室温中显色反应7min，用双蒸水洗涤各孑L终止反应。

在孔内可见有深紫色的斑点。

将微孔板避光放在通风环境下或37烘箱中干燥。

应用CTL公司酶联斑点分析仪计数着色的斑点。

14结果判断标准根据TSPOTTB试剂盒使用说明书，如果阴性对照孔斑点形成细胞（SFC）6可判断所测标本为阳性：

如果阴性对照孔SFC6，检测孑LSFC为阴性对照孔2倍，可判断所测标本为阳性。

15统计学方法检测结果以均数标准差表示，用SPSSll0软件计算，计量资料的比较采用成组t检验。

P005表示差异有显著性，P005）；两组阳性对照孔的SFC比较差异有非常显著性（P001）；两组检测孔A和检测孔B的SFC比较差异均有非常显著性（P001）。

见表1。

在29例TSPOTTB阳性者中，9例（310）为检测孔A和检测孔B均阳性，13例（448）为检测孔A阳性、检测孑LB阴性，7例（242）为检测孔A阴性、检测孔B阳性。

3讨论近年来的研究发现。

培养滤液蛋白lo（cFP10）和6kDa早期分泌性抗原靶（ESAT-6）是从结核表1ELISPOT法检测人外周血中分泌IFN的淋巴细胞的斑点数面s分枝杆菌短期培养滤液中分离的两种低分子量蛋白，由RDI区编码，该区只存在于结核分枝杆菌复合群和少数致病性分枝杆菌基因组中，所有卡介苗（scG）菌株及非致病性分支杆菌基因组中均缺乏万方数据塞旦匿堂垒查垫!

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翅该区域。

所以可将ESAT6和CFP10作为结核分枝杆菌感染的特异性T细胞刺激抗原，为结核感染的免疫活性T淋巴细胞识别。

并产生高水平的1一干扰素。

英国OxfordImmunotec公司生产的TSPOTTB试剂盒应用ELISPOT技术检测ESAT一6和CFP10多肽刺激T淋巴细胞所分泌的y一干扰素。

该试剂盒不受BCG和菲结核分枝杆菌的影响在诊断结核分枝杆菌潜伏感染（LIBI）与传统结核菌素皮肤试验（，rsT）相比具有更高的灵敏度和特异性12圳。

由于目前LIBI诊断并无金标准，国外通过检测活动性结核病患者来评价ELISPOT试剂盒的灵敏度可达到90左右（83100）5-s1；通过检测结核病低流行地区接种过BCG的人群表明ELISPOT的特异性可达93左右（85100）s-103。

与本研究结果相似，本研究检测结核病患者和结核感染者的灵敏度为933特异性为966。

另外检测孑LA和检测孔B由于所使用的抗原不同，所引起的细胞免疫反应也不完全一致，ESAT一6抗原的灵敏度高于CFP一10抗原两者具有互补性，两者联合检测显著提高检测的灵敏度。

Jafari等111应用TSPOTTB检测37例结核病患者外周血PBMC分泌IFNy的淋巴细胞，结果显示每20x105个PBMCESAT6检测孔平均叮获得17个斑点，CFP一10检测孔平均可获得245个斑点。

而本实验每25x10s个外周血PBMCESAT6检测孔平均可获得27个斑点，CFP10检测孔平均可获得35个斑点平均斑点数高于Jafafi等J的报道可能是由于感染的结核菌株的差异或人种免疫反应的差异所致。

虽然目前关于TSPOTTB的论文广泛发表，而且世界各国实验室及临床科室都在大量地应用此项技术但是此项技术仍存在不足：

血液标本的采集、运送、技术人员的操作、斑点分析仪的使用，均可影响其精确度。

该试剂盒需合适的实验室以及专门培训技术人员且花费较高。

难以在结核病高流行的发展中国家应用另外，该试剂盒在诊断活动性结核病方面的作用尚待确定目前只能用于检测是否有结核感染。

并不能鉴别活动性结核病和结核潜伏感染123|。

因此。

广泛推广应用有一定的困难，尚需进一步的努力，使各个步骤自动化。

尽可能地简便并标准化。

总之，TSPOTTB试剂盒在检测结核感染、辅助结核病诊断方面具有很高的应用价值，近期的研究表明，新的特异抗原如RV3879c在不减低特3119异性的情况下。

较ESAT6和CFP10有更高的敏感性t引随着该技术的推广应用相信EusPOT方法将会成为结核病诊断和鉴别诊断的一项重要的辅助诊断方法。

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