胶原蛋白降解物高效液相色谱／质谱联用分析.pdf
《胶原蛋白降解物高效液相色谱／质谱联用分析.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《胶原蛋白降解物高效液相色谱／质谱联用分析.pdf（7页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
中国生物工程杂志ChinaBiotechnology，2005，25
（2）：
6672胶原蛋白降解物高效液相色谱质谱联用分析*孙爱梅张贵锋倪文苏志国（1北京科技大学土木与环境工程学院北京1000832中国科学院过程工程所生化工程国家重点实验室北京100080）摘要利用高效液相色谱质谱联用技术分析了胶原蛋白II和I经变性和酶解处理得到的多肽混合物，比较研究了两种类型胶原蛋白降解物之间的区别，利用液相色谱质谱连用技术识别出了不同类型胶原蛋白中的特征肽段。
胶原蛋白在50处理3h可溶解于盐溶液，凝胶过滤分析结果表明，热变性的胶原蛋白分子量在10万以上，因此在热变性过程中胶原蛋白的三螺旋结构被破坏但没有明显的随机降解。
利用胰蛋白酶对胶原蛋白进行了酶切处理，在酶用量为2，pH8182，温度37条件下，处理20h后胶原蛋白降解较完全，多肽混合物的平均分子量在1万以下。
利用液质联用技术研究II型和I型胶原蛋白降解物中的多肽，通过多级质谱分析了胶原蛋白降解物多肽的序列。
结果表明，不同类型的胶原蛋白酶解后的多肽混合物中存在特定序列的特征肽段，利用特征肽段进行胶原蛋白类型识别是可行的。
关键词胶原蛋白酶解高效液相色谱质谱胶原蛋白是一种由动物细胞合成的生物高分子，作为细胞外基质中重要的成份几乎存在于所有组织内，约占哺乳动物总蛋白的13。
近年来，研究发现许多疾病与胶原蛋白密切相关，如胶原蛋白的含量、分布、代谢及其动态变化异常会引起骨质疏松、动脉瘤和椎间盘突出等疾病。
因此，建立快速的胶原蛋白分析方法不仅有利于疾病的早期诊断，也有助于认识致病机理等。
另外，胶原蛋白由于良好的生物学特性和弱抗原性在化工、保健品、医学及材料等领域得到广泛应用，不同类型的胶原蛋白应用领域各异，建立快速的胶原蛋白分析方法还有利于胶原类产品的质量控制。
胶原蛋白分子长约300nm、直径约15nm，由3条肽链以平行、右旋的形式缠绕而成，组成胶原蛋白的a肽链自身为左手螺旋结构。
每条肽链的序列特征表现，为每隔两个其它氨基酸残基即有一个甘氨酸，其序列可用GlyXY表示（X常为脯氨酸，Y常为羟脯氨酸或羟赖氨酸）I3。
根据构成其肽链的差异，胶原蛋白可分为多种类型，目前人们在脊椎动物中已鉴别出至少27种大小、序列、组织分收稿13期：
20040910修回13期：
20041207*国家自然科学基金资助项目（20136020）*通讯作者，电子信息：
zgsuhomeipeaccn布、分子组成各异的胶原蛋白。
许多胶原蛋白在常温下难溶于水，因此直接分析存在一定困难。
文献中通常使用特异性的酶或溴化氰部分降解胶原蛋白使其溶解于水溶液。
对于胶原蛋白降解产物的分析，1999年Mikgfk等利用凝胶过滤色谱在SepdexG一15柱上实现了I型胶原a1链、链、V型胶原和I型胶原CNBr肽的分离。
凝胶过滤色谱是级分蛋白质和测定蛋白质分子量分布的良好方法，其缺点是色谱柱峰容量有限，分离度较低，不宜用于分子大小及组成相似或相差很小组分的分离。
其他分析方法包括离子交换色谱、反相色谱、亲和色谱、电泳或毛细管电泳等。
由于不同类型胶原蛋白降解物性质相似、分子量差别不大，因此这些方法存在分辨能力较低、准确性差和重现性不理想等问题，不能对混合物中的不同胶原蛋白同时进行检测。
针对目前胶原蛋白分析方法中存在的不足，本研究旨在探索利用质谱检测特征肽段进行胶原蛋白类型识别的可行性。
实验通过热变性的方法将胶原蛋白进行溶解，利用胰蛋白酶对热变性的胶原蛋白进行了酶切处理。
利用液相色谱质谱联用技术分析胶原蛋白的降解物，比较研究了不同类型胶原蛋白降解物中多肽的区别，结果表明，不同类型胶原蛋白酶解物中存在特征肽段，利用特征肽段进维普资讯http:
/孙爱梅等：
胶原蛋白降解物高效液相色谱质谱联用分析67行胶原蛋白类型识别具有可行性。
l材料与方法11试剂和仪器胶原蛋白II、I均为Sigma公司产品（进V1分装），胰蛋白酶为Amresco公司产品，色谱纯乙腈和三氟乙酸分别购自Fisher公司和Merck公司，考马斯亮蓝G250为Fluka公司产品。
其它试剂均为市售分析纯，实验用水为MiliQ自制纯水。
实验用仪器分别为高效液相色谱Agilent1100，二极管阵列检测器UV6000，蒸发光散射检测器（ELSD）SEDEX75，离子阱质谱（电喷雾离子源，型号LCQDecaXP，美国热电公司），数据采集与分析软件Xcalibur，紫外分光光度计Uhrospec2000（PharmaciaBiotech）。
12变性温度测定称取多份相同质量胶原蛋白悬浮于相同体积TrisHC1（pH81，50mmolL含，1molLNaC1）缓冲液中，在40C到100C不同的温度下加热，每份胶原蛋白在特定的温度下加热3h。
在每个特定的温度下，每隔20min取样，离心后测定上清液中溶解的胶原浓度（考马斯亮蓝染色法）。
测定胶原在不同温度下的初始溶解速率和最大溶解度。
13胶原蛋白酶解将热变性的胶原蛋白溶液（pH81）温度控制在37，加入胰蛋白酶，研究酶用量与降解速率的关系。
14高效液相色谱分析反相色谱：
色谱柱：
VydacC4，流动相：
A：
水（含03TFA），B：
乙腈（含03TFA），流速：
06mlmin；梯度：
020min，515B，2060min，1525B，保持此比例10min；进样量：
50td。
ELSD参数：
漂移管温度40，雾化气体（N2）流速20ldmin。
凝胶过滤：
色谱柱TSK2000SW（75300mm，10tt，TOSOHBIOSEP），流动相为50mmolL磷酸盐缓冲液（pH70含1molLNaC1），流速05mlmin；进样量5td，检测波长230nm。
15液质联用分析色谱流动相经分流阀分流后进入质谱，分流比控制在9：
1（10进入质谱）。
质谱条件：
电喷雾离子源壳气流速40arb，喷雾电压5kV，自加热金属毛细管温度275oC。
扫描模式为全扫描检测，扫描范围mz2002000，精确质量数扫描（zoomscan）和二级质谱（MSMS）的扫描模式为数据依赖型扫描（datadependentscan）。
2结果21胶原蛋白热变性胶原蛋白难直接溶于水，但经热变性处理后其三螺旋结构发生变化，这种热变性的胶原蛋白可以溶于高浓度盐溶液。
如图1所示，40（1T10为319）时几乎不溶解，40至50（1T10为31）之间，胶原蛋白溶解量随温度升高而增大，2至3h溶解量达到最大，之后溶解量基本保持稳定。
凝胶过滤色谱分析结果表明，溶解的胶原蛋白分子量较高（图2），经与分子量标准品对照，溶解的胶原蛋白分子量在10万以上。
据文献报道，温度低于50时，胶原蛋白只发生了三螺旋结构的解离，但单链没有明显的随机降解。
当温度高图1温度对胶原蛋白I溶解度的影响Fig1EffectofTemperatureonheatsolubilisationofcollagentmin图2胶原蛋白I热变性溶液凝胶过滤色谱图Fig2GelfiltrationchromatogramofCollagenIsolution一】I邑一J）暑0一维普资讯http:
/68中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo125No22005于60时（1T10为30），溶解曲线出现转折点，凝胶过滤色谱分析结果表明在温度高于60时，溶液中存在分子量低于10万的组分。
这表明在较高温度下，胶原蛋白不仅会发生三螺旋结构的解离，而且单链会发生明显的随机降解。
因此为控制胶原蛋白只进行三螺旋结构解离而不发生随机降解，变性温度应控制在50。
胶原蛋白溶解经热变性处理后在12000g下离心10min，上清液中的变性胶原蛋白直接进行酶法降解。
22胶原蛋白酶解胰蛋白酶对天然胶原蛋白几乎没有作用，但可以降解变性的胶原蛋白。
影响胶原蛋白酶解的因素主要包括酶用量、酶解时间、pH、水解温度等。
胰蛋白酶水解胶原的最适条件是pH8182、温度37。
在此条件下，实验考察了酶用量和时l0o8O60l皿譬4o髓2OOOl234567tmin图3酶用量和时间与水解度的关系Fig3Effectofquantityofenzymeandtimeonthepercentageofdigestedcollagen23胶原蛋白水解物HPLC分析胶原蛋白经酶解后形成一系列分子量不均一的多肽混合物。
为了比较不同类型胶原蛋白水解物之间的区别，本实验在相同的变性条件和酶解条件得到了胶原蛋白II型、I型酶解液，并利用HPLCELSD对降解产物进行了比较研究。
如图5所示，II型胶原蛋白和I型胶原蛋白经酶解处理12h后降解较为完全，酶解混合物中几乎没有未降解的胶原蛋白，水解物经反相色谱分离后可得到多种组分。
从HPLCELSD色谱图（图5A）可见，胶原蛋白II经水解后其主要组分保留时间集中在1050min，50min后只有少量洗脱物，而胶原间对胶原蛋白降解过程的影响，胶原蛋白的降解度通过凝胶过滤色谱分析。
如图3所示，在胶原蛋白与酶的比例为100：
1（质量比）条件下，3h后胶原蛋白的降解度在75以上，随着酶解时间延长，胶原蛋白的降解速率逐渐降低。
酶解的溶液经凝胶过滤色谱分析，结果表明水解产物的分子量分布范围较宽，水解20h后，胶原蛋白降解物的分子量主要集中在1万以下，明显低于胶原蛋白单链的分子量，几乎被全部水解（图4）。
随着酶用量的增大，胶原蛋白降解反应初始速率增加，在3h内，相同反应时间胶原蛋白降解度随酶用量增加而提高。
通常情况下，在酶促反应中底物浓度比酶浓度高得多，增加酶用量对酶促反应初始速率影响较大，而且速率增加与酶用量成正比，随着底物浓度的降低，酶用量对反应速率的影响逐渐减小。
tmin图4胶原蛋白I水解物凝胶过滤色谱图Fig4ChronmtogramofdigestedcollagenI蛋白I水解物在2060min范围内均有洗脱组分（图5B）。
胶原蛋白II和胶原蛋白I水解物之间的区别主要集中在一3555min。
可见，不同类型的胶原蛋白经酶解处理后得到的肽段存在一定区别。
胶原蛋白的分类主要根据构成其三螺旋结构的单链序列之间的差异，因此，胶原蛋白II和胶原蛋白I经变性和酶解处理后得到肽段之间的差异应与构成该胶原蛋白单链的氨基酸组成及序列有关。
为进一步研究两种类型的胶原蛋白降解物的区别，利用液质联用系统对胶原蛋白降解后的多肽进行了进一步分析。
维普资讯http:
/孙爱梅等：
胶原蛋白降解物高效液相色谱质谱联用分析69B胶原蛋白I3O405O6O7O80102030405060708omlrl“mill图5胶原蛋白酶解HPLC色谱图A：
collagenII；B：
CollagenIFig5ChromatogramoftrypticdigestedmixtureofcoHagenA：
collagenII；B：
CollagenI24胶原蛋白水解物液质联用分析图6为经胰蛋白酶处理的I型胶原蛋白的多肽混合物经液质联用分析得到的总离子流图。
在质谱分析过程中，精确质量数扫描可以确定离子所带电荷数，利用二级质谱得到的碎片离子可识别肽段的序列。
如I型胶原蛋白酶解后的多肽混合物中检测出质荷比为4440的离子，精确质量数扫描表明该离子与其同位素离子之间质量数之差为05，因此该离子带2个正电荷。
二级质谱扫描结果表明该离子的序列为GSEGPQGVR（图7）。
根据该序列计算出的同位素峰之间相对丰度与实验得到的谱图完全一致。
由图10可见，胶原蛋白I的氨基酸序列中含有序列GSEGPQGVR。
因此，可以确定带双电荷的离子mz4440为胶原蛋白I经热变性后酶解得到的肽段。
在总离子流图中部分色谱峰含有较多的离子，表明部分肽段未能得到完全的分离，即使改变梯度条件和降低上样量，这种情况也未能得到改善，可能原因是胶原蛋白经酶解得到的许多肽段具有相近的疏水性。
为尽可能多地识别同一色谱峰中所有的肽段，色谱分离中流动相RTooo706loo18O2喜6o至4o宝2oOGSEGPQGVRl25590371-3051308O的流速降为05mlmin，另外，质谱分析中的动态排除（dynamicexclusion）次数设定为2，动态排除时间降低为2min，部分识别出的肽段列于表1。
表1II型和I型胶原蛋白酶解多肽混合物中部分识别出的肽段Table1PartialpeptidesfoundinthedigestnlLtureofcollagenIIandI囊一：
05l0I5202530354045505560Time（mm）图6I型胶原蛋白酶解物液质联用分析总离子流图Fig6TotalioncurrentofdigestmixtureofcoHagentypeIfrombovine维普资讯http:
/70中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo125No22005利用相同的方法对胶原蛋白II进行了分析，图8为II型胶原蛋白经胰蛋白处理后的多肽混合物经液质联用分析得到的总离子流图，部分识别出的肽段列于表1。
以离子mz4482为例，精确质量数扫描表明该离子带双电荷，二级质谱扫描结果表明其序列为PGEAGLPGAK（图9）。
利用该序列计算出的离子与其同位素峰的相对丰度也和实验得到的图谱结果一致，II型胶原蛋白的氨基酸序列中也存在该肽段（图10），II型胶原蛋白中部分识别出的肽段列于表1。
在I型和II胶原蛋白多肽混合物中存在许多序列相同的肽段，如RGAR等。
为研究本方法的有效性，将II型和I型胶原蛋白混合物利用相同的方法进行了处理，表1中列出的肽段均被检出。
可见II型胶原蛋白和I型胶原20o30040o50o60070o80omz图7离子rrgz4440的二级质谱和精确质量数扫描图谱Fig7ZoomscanandMSMSspectraoftheionmz444Time（rain）图8型胶原蛋白酶解物液质联用分析总离子流图Fig8TotalioncurrentofdigestmixtureofcollagentypeIfrombovine1口口+7O3i。
；!
DI。
yl一32。
2：
1612083b127423-一b12IllI3l078yl-7Ill，。
1ll1Illllbl-820o30o40050o60o70080o900mz图9离子mz4482的二级质谱和精确质量数扫描图谱Fig9ZoomscanandMsMSspectraoftheionmz4482舳加Oo暑p与IqoBlo舳加Oo暑p与IqoBlo维普资讯http:
/2005，25
（2）孙爱梅等：
胶原蛋白降解物高效液相色谱质谱联用分析71蛋白酶解后得到的肽段存在一定差异，不同类型的胶原蛋白水解物中含有相同序列的肽段和大量有3讨论明显序列差异的肽段，这些差异肽段可作为胶原蛋白类型识别的特征肽段。
GVMGPMGPRGPPGPAGAPGPQGFQGNPGEPGEPGVSGPMGPRGPPGPPGKPGDDGEAGKPGKSGERGPPGPQGARGFPGTPGLPGVKGHRGYPGLDGAKGEAGAPGVKGESGSPGZBGSPGPMGPRGLPGERGRTGPAGAAGARGNDGQPGPAGPPGPVGPAGGPGFPGAPGAKGEAGPTGARGPEGAQGPRGEPGTPGSPGPAGAAGNpGTDGIPGAKGSAGAPGIAGAPGFPGPRGPPGPQGATGPLGPKGQTGEPGIAGFKGEQGPKGEPGPAGVQGAPGPAGEEGKRGARGEPGGAGPAGPPGERGAPGSRGFPGQDGIAGPKGPPGERGSPGAVGPKGSPGEAGRPGEAGIPGAKGLTGRPGDAGPQGKVGPSGAPGEDGRPGPPGPQGARGQPGVMGFPGPKGANGEPGKAGEKGLPGAPGLRGLPGKDGETGAAGPPGPAGPAGERGEQGAPGPSGFQGLPGPPGPPGEGGKPGDQGVPGEAGAPGLVGPRGERGFPGERGSPGAQGLQGPRGLPGTPGTDGPKGASGPAGPPGAQGPPGLQGMTLDAMKVFCNMETGETCVYPNPASVPKKNWWSSKSKDKKHIWFGETINGGFHFSYGDDNLAPNTADVQMTFLRLLSTEGSQNITYHCKNSIAYLDEAAGNLKKALLIQGSNDVEIRAEGNSRFTYTVLKDGCTKHTGKWGKTMIEYRSQKTSRLPIIDIAPMDIGGPEQEFGV
升级会员 