AriaII操作手册-分选20160402.doc

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FACSAriaⅡ中文操作手册

FACSAriaⅡ流式细胞仪

一、开机准备

（一）准备液路

1.将流式细胞仪的上盖打开；

2.开启计算机，等待所有程序载入。

3.开主机电源Mainpower（右图），从电脑桌面上双击打开FACSDiva软件，输入密码BDIS。

打开激光开关laserpower（根据实验需要进行选择）；开启实验所需激光器电源。

4.确认液流车中各种液体的液面水平（鞘液、废液、去离子水、漂白剂、乙醇），倒空废液或加满其他液体（下图）。

5.从软件的Cytometer菜单上选择FluidicStartup（射流启动），点击OK确认。

将出现如下窗口：

6．将液路和气路管道从酒精桶断开，连接到鞘液桶；完成后点Done；

7．将Closed-loop喷嘴（闭环喷嘴）插入流动室；完成后点Done；会出现右侧窗口，提示液流开启进行中；

8．达到100%，移去Closed-loop喷嘴，完成后点Done；

9．按照实验要求，插入直径合适的喷嘴（喷嘴直径应该是分选颗粒直径的3-6倍）；

10．然后点OK，完成整个过程；

11．从菜单上选择Sort（分类）>sortsetup,确认setup模式与喷嘴大小匹配。

（二）开液流

1．打开液流窗口的液流；

¨点击软件界面上（如下图）的按钮

打开分选液流窗口（如下图）

¨点击分选液流窗口的按钮（stream的前面按钮），开启液流

2．打开分选仓前的门，检查液流。

液流应为一条细线落入废液槽正中（可通过调整红色标志的键）；

（如果液流不稳，检查流动室中是否有气泡，将液流关闭，10秒钟后再开，排除气泡。

）

3．关上分选仓前的门。

（三）设定液流断点

1.调整液流震幅（Ampl），使断滴位于窗口上方1/3处。

（Ampl不要超过70，如果超过，检查流动室是否有气泡；确认鞘液压力和震动频率是否合适）；

2.确认卫星液滴与大液滴融合，应该在断滴的6滴之内融合（红色箭头数起，左图的左侧合格，右侧不合格），如果没有融合，重新安装喷嘴。

二、建立实验模板

1.在软件界面左侧Browser面板下，依次点击NewFolder、Experiment、Specimen（均可重命名），单击Specimen左侧“+”符号，显示下方的Tube，点击左侧灰色指示箭头，使之变成绿色（当前指示）。

2.在软件（）Cytometer面板上，点击Parameters选项卡，选择实验所需荧光通道（按Ctrl键可多选），并删除多余通道。

选择荧光素名称、信号放大类型（log/lin）、信号脉冲类型（H/A/W），

3.在（）右侧worksheet页面中，画出实验所需模板（斜箭头）：

首先画出点图（双参数：

FSC-A和SSC-A），根据阴性对照（未染色的细胞）圈出细胞群P1；其次画出点图（双参数：

荧光名称），利用鼠标右键ShowPopulations选项，选择P1，建立图之间的联系（如下图）。

4.至此，一个简单的实验模板基本建成。

现在可以将样本管放在上样台上，点击上样面板的load，此时AcquireData自动被激活或手动点击采集控制面板上的Acqiredata按钮，仪器开始获取样本数据。

5.根据实验情况调整Cytometer面板中各通道电压，使FSC/SSC中信号位于利于观察的位置（细胞群落在中央位置）。

调整阈值（Threshold），去除碎片和噪音信号。

调整上样速度（FlowRate）（最大为10）。

6.在FSC/SSC中调整门的位置、大小和形状，使之圈住感兴趣细胞群。

调节荧光通道的电压，使荧光信号位于合适的位置。

7.在鼠标右键中打开数据显示，观察实验的实时结果。

8.实验条件调整完毕后，在上样面板中设置EventsToRecord等参数，点击RecordData，开始保存数据。

（三）液流关机

预备关机

1．关激激光电源；

2．从上样架上移去上样管；

3．关闭液流（stream的前面按钮）；

4．倒空废液桶；

5．加满酒精桶

关机

1．从菜单上选择Cytometer>fluidicsshutdown（关闭），会弹出下面窗口

2．从流动室上移去喷嘴；完成后点Done。

3．插入Closed-loop喷嘴，完成后点Done。

4．将鞘液桶的液流管和气管分别连接到酒精桶上，点Done。

鞘液桶

酒精桶

鞘液桶

酒精桶

气管

液流管

从此处断开连接

液路关机时

正常运行时

5．按照提示，放上一管3ml清洗液，完成后点Done；

6．清洗完成后，按提示，点OK。

7．关闭流式细胞仪主机电源；

8．退出软件，关计算机。

清洗外部

用软布沾次氯酸钠和蒸馏水清洗分选仓、偏转板、上样架、分选收集架，进行消毒和避免形成盐结晶。

每日关机和日常维护

（一）日常关机

1．关闭液流

2．取下喷嘴，装上ClosedLoopNozzle。

3．从菜单上选择Cytometer>>CleaningModes>CleanFlowCell，会弹出右侧窗口：

放一管无菌水在上样台上。

4．完成后，按要求点击OK；

5.用超纯水清洗ClosedLoopNozzle。

6．关闭流式细胞仪主机电源；

7．退出FACSDiva软件，关电脑。

FACSDiva软件介绍

DIVA软件界面如下：

在①工具栏中，可以显示或隐藏某个工作窗口

1、工作界面工具栏

保存（Save）-保存实验模板及数据。

直接退出软件时，软件将自动保存已建立的实验模板和已获取的实验数据。

浏览器（Browser）-点击可显示或隐藏浏览器窗口。

多孔板（Plate）-显示或隐藏多孔板实验窗口。

仪器设置（Cytometer）-显示或隐藏仪器设置窗口。

属性（Inspector）-显示或隐藏属性窗口。

工作表（Worksheet）-显示或隐藏工作表窗口

获取控制器（AcquisitionControls）-显示或隐藏获取面板

生物指数编辑器（BiexponentialEditor）-显示或隐藏生物指数编辑器

分选设置（Sorting）-显示或隐藏分选设置

2、各窗口介绍

2.1浏览器（Browser）

浏览器是创建实验模板和管理实验数据的窗口。

如图：

窗口第一栏的浏览器工具栏（Browsertoolbar）中包含了浏览器的所有构建模块，点击某个图标即可建立对应的项目。

从左至右分别是：

文件夹（Folders）、实验（Experiments）、样本（Specimens）、样本管（Tubes）、样本/样本管特异仪器设置（Specimen/Tube-specificcytometersettings）、分选版面（Sortlayout）、总工作表（GlobalWorksheet）、多孔板（Plate）。

各新建的项目均可用鼠标右键菜单重命名。

2.2仪器设置窗口（Cytometer）

仪器设置窗口是调节各通道电压、选择信号放大类型、脉冲类型、荧光补偿、阈值、激光延迟的界面。

2.3属性窗口（Inspector）

当鼠标焦点位于某个窗口或图像、数据框时，属性窗口内显示该焦点的相关设置。

2.4获取面板（AcquisitionDashBoard）

在获取面板中，用户可以控制仪器上样、获取数据、设置停止门、设置保存细胞数量。

2.5分选设置窗口（Sorting）

分选窗口包括两部分：

侧液流窗和断点液流窗

►侧液流窗中可以控制电压开关、测试液流、滤光片、废液抽屉、调整侧液流角度、液流聚焦、调整液滴延迟。

►断点液流窗可以开、关液流，开启断点监视（SweetSpot）、调整振幅（Ampl）、震荡频率（Freq）、设置Drop1和Gap值。

2.6工作表窗口（Worksheet）

在工作表窗口中，用户可以创建实验模板，包括直方图、散点图的绘制、各种门的创建以及进行数据分析。

实验模板建立常见问题

问题1：

在选择通道参数时，待选项中没有自己要选的荧光名称。

1.打开Cytometer菜单下的ViewConfigurations（视图设置）选项。

2.在跳出的窗口中双击仪器配置。

3.在新窗口的右侧Parameters中有各种染料的名称，将其拖拽至相应的检测器中。

完成后点击OK。

4.点击Setconfiguration，点击OK。

★若3中仍找不到所需染料名称，则可在2的Parameters选项卡中添加，然后完成3、4过程即可。

问题2：

如何在荧光通道中添加抗体名称？

1．在Experiment菜单下选择ExperimentLayout（布局）。

2.在新窗口的Label栏中添加抗体名称，完成后点击OK。

亦可选中同一列Label批量添加抗体名称

问题3：

如何调整荧光补偿？

手动调整补偿

以FITC/PE双染为例：

1.建立如下实验模板：

2.上阴性/同型对照（未染的细胞），调整参数的电压将细胞群调至第三象限（Q3）：

3.上FITC单染样本，调整Cytometer面板Compensation（补偿）中的值，使阳性信号落入单阳性范围（如下图右侧）。

调整前后信号差别如下：

4.上PE单染样本，调整Cytometer面板Compensation中的值，使阳性信号落入单阳性范围。

调整前后信号差别如下：

5.荧光补偿调整完成。

★注：

若样品为多染，需分别制备单染样本，调整每对荧光通道组合之间的补偿值。

分选

一、液流监视

1．用蘸有超纯水的棉签擦拭偏转板，之后用干棉签擦拭干净。

整个分选过程都应确保偏转板无液滴或盐结晶。

2．打开液流，液流应为一条细线，无分叉、喷雾。

关闭液流罩。

3．调整仪器小激光的角度，使液流窗中的亮点最亮（下图圆圈圈的旋钮）。

4.调整Ampl值，使液流断点位置位于窗口中上部。

液流应类似于右图：

二、分选液路调整

1.打开Votage（电压）、TestSort，调整Ampl值，使液流窗的四个侧液流亮点距离最远、亮点最集中（若只做两路分选，可将两个外侧VotageSliders滑动器调至0）。

调整完毕后，输入断点液流窗的Drop1和Gap的实测值，点击SweetSport。

2．安装分选收集装置，打开WasteDrawer，调整VotageSliders，使侧液流分别流入各自收集管中。

关闭TestSort、Votage、WasteDrawer。

注意：

分选电压打开时，禁止触摸偏转板！

三、确定液滴延迟（DropDelay）

1.在Experiment菜单下选择NewExperiment，选择AccudropDropDelay，点击OK。

2.展开Specimen_001与Tube_001并激活Tube_001，双击SortLayout_001，界面会出现一个SortLayout对话框

3.将两滴BDAccudropBeads溶解在0.5mlPBS中上样。

将WindowExtension设为零。

调整上样速度到1000-3000events/秒。

4．打开Votage，点击sort。

此时弹出对话框，提示是否打开WasteDrawer。

因为没有必要收集，所以选择cancel。

5．点击液流窗OpticalFilter。

此时，液流窗如下图：

调整DropDelay值，使左框中亮度达到最大。

每次调整后要等几秒钟。

6．在SortLayout窗口（倒数第三个）将Initial改为FineTune,重新调整DropDelay，使左框达到最大值（通常接近99%）。

7．调整完毕后，关闭OpticalFilter、Votage、Sort。

将WindowExtension恢复为初始值，通常为2。

★AccudropDropDelay模板一经建立，以后的调整过程可以重复使用该模板，无需每次新建一个AccudropDropDelay模板。

每次打开软件时，DropDelay均值为最近一次调整后的值。

★进行完步骤4时，可以应用软件的自动调整液滴延迟（AutoDelay）

在跳出的对话框中选择StartRun，软件会自动寻找最佳值。

四、开始分选实验

上述工作准备完毕后，即可安排分选。

1.建立一个新的SortLayout。

在已有的Experiment中，选中Sort菜单下的NewSortLayout。

2．在SortLayout窗口输入合适的选项。

u从Device选项中选择合适的收集装置。

u从Precision（精密度）选项中选择Purity。

u在TargetEvents（分选细胞数）下选择数目、输入数字或选continuous。

u选中分选方向（Left或Right），在相应的方向，添加要分选的细胞群（门）。

3.开始分选

u放入收集管。

u上样。

u设定合适的收集速率。

速率低时分选效果比较好。

一般<8.0。

u打开Votage。

u点击SortLayout上的“Sort”。

u此时出现一个对话框，提示是否打开WasteDrawer。

如果确定开始分选，点击“OK”。

u如果TargetEvents选择了“Continuous”，仪器将持续分选，直至点击“Sort”或“Acquire”手动停止分选。

从SortLayout窗口可监测分选的进度，分选的细胞数显示在相应的区域。

在相关的计数区显示分选速率。

无菌分选操作流程

1．打开Cytometer

2.在弹出的对话中，每按照提示操作完一步，均点击Done。

1） ◆鞘液桶灭菌（可高温高压灭菌，亦可酒精消毒。

高温灭菌时注意取下液面感应器），并倒入无菌鞘液。

◆DI桶灭菌

◆更换0.2um鞘液滤器

2）安装密闭喷嘴，点击“完成”。

3）将漂白水桶液流管与DI液流端口相连，点击“完成”。

4）将上面两个液流管复位，点击“完成”。

5）将鞘液液流管（不包括滤器）与液流车侧面的液流输出端口相连，点击“完成”。

6）将鞘液液流管从液流车上断开，并装入新的无菌0.2um滤器，点击“完成”。

7）将旧的鞘液滤器取下，安装装有无菌滤器的鞘液液流管，点击“完成”。

8）若要接着进行分选实验，点击下图的第一个Run；若要终止实验、关闭系统并清洗流动室，点击第二个Run。

1.断点液流窗液滴形状及其可能原因

正常液流

可能

原因

喷嘴位置偏

喷嘴位置偏

喷嘴堵塞

镜头脏

Attenuation开启

解决

方法

重装喷嘴

重装喷嘴

清洗喷嘴

用棉签擦拭镜头

关闭Attenuation

2.分选实验中遇到的问题及可能原因

开启TestSort时无偏转液流

鞘液为蒸馏水

将鞘液更换为PBS或生理盐水

液流不能落入废液槽中心或无液流

喷嘴位置不正确

重装喷嘴

喷嘴堵

清洗喷嘴

偏转板电压设置太高

降低偏转板电压

偏转板产生电火花

偏转板上端过分靠近

调远偏转板上端距离

偏转板上有盐结晶

清洗偏转板

侧液流不稳定

Ampl值不恰当

调整Ampl值

偏转板有水滴或雾气

擦拭偏转板

OpticalFilter左右框值总和小于100%

小激光没有与液流正交

调整小激光角度

侧液流窗脏

擦拭侧液流窗

Accudrop微球过期

更换新微球

CytometerSetupandTracking（CS&T）操作流程

微球用量：

Fordefiningbaseline,addtothelabeledtube:

-0.5mLdiluent

-3dropsofbeads

•Forrunningdailymeasurements,addtothelabeled

tube:

-0.35mLdiluent

-1dropofbeads

•Forresettingtargetvalues

-addtoatubelabeledcurrentlot:

-0.5mLdiluent

-3dropsofbeadsfromcurrentlot

-addtoatubelabelednewlot:

-0.5mLdiluent

-3dropsofbeadsfromnewlot

一、微球信息导入。

1.在Cytometer菜单中，打开CST选项。

2.在出现的窗口右侧，选择仪器配置。

3.在Tools菜单中，选择BeadsLots选项，选择Import，导入已有的微球信息文件（

二、定义基线（DefineBaseline）（初次使用CS&T时。

若已有Baseline，跳过此步）。

1.SetupControl窗口中，选择DefineBaseline，选择手动上样或自动上样。

2.确认Beads信息及仪器配置（CytometerConfiguration）无误后，点击Run。

仪器将自动完成检测和设置过程。

3.仪器收集完信息后，将会显示PMTVs调整结果。

4.点击ContinueSetup。

仪器完成TargetValue设置后，将显示下图结果。

点击ContinueSetup。

5.仪器显示设置报告。

三、每日优化仪器状态（CheckPerformance）

1.SetupControl窗口中，选择CheckPerformance，选择手动上样或自动上样。

2.确认Beads信息及仪器配置（CytometerConfiguration）无误后，点击Run。

仪器将自动完成检测和调整过程。

3.仪器完成检测和调整后，会出现一个提示框。

若要查看设置报告，点击ViewReport；若要结束设置，点击Finish。

四、重设目标值（ResetTargeValues，换不同批号的CS&T微球时选中）

1.SetupControl窗口中，选择ResetTargeValues，选择手动上样或自动上样。

2.确认仪器配置（CytometerConfiguration），选择新、旧微球的ID（需先将新微球信息导入）。

3.上旧微球样品，点击RUN。

4.等待仪器提示放入新微球样品，上样完毕，点击Continue。

5.等待仪器出现提示框。

若要查看设置报告，点击“ViewReport”；若要结束设置，点击“Finish”。

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