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AlginatelyaseExpressionCharacterization
目录
第一章引言…………………………………………………………………………………4
1、褐藻胶……………………………………………………………………………………4
1.1褐藻胶的基本结构………………………………………………………………………………………4
1.2褐藻胶的来源……………………………………………………………………………………………5
1.3褐藻胶寡糖及褐藻多糖生物活性研究…………………………………………………………………5
1.4褐藻多糖在细菌生物膜中的生物功能………………………………………………………………6
2、褐藻胶裂解酶………………………………………………………………………………………7
2.1褐藻胶裂解酶的来源……………………………………………………………………………………7
2.2褐藻胶裂解酶的底物特异性……………………………………………………………………………8
2.3褐藻胶裂解酶的分类……………………………………………………………………………………8
2.4褐藻胶裂解酶的作用机制………………………………………………………………………………9
2.5褐藻胶裂解酶的活性测定方法…………………………………………………………………………9
2.6褐藻胶裂解酶的生物学功能……………………………………………………………………………10
2.7褐藻胶裂解酶的应用……………………………………………………………………………………11
3、小结……………………………………………………………………………………………………12
第二章褐藻胶裂解酶AlyB的制备及分离纯化………………………………………13
1、实验材料……………………………………………………………………………………………13
1.1菌株与培养基……………………………………………………………………………………………13
1.2试剂………………………………………………………………………………………………………13
1.3仪器………………………………………………………………………………………………………13
2、实验方法……………………………………………………………………………………………14
2.1AlyB的制备……………………………………………………………………………………………14
2.2AlyB的纯化…………………………………………………………………………………14
2.2.1硫酸铵沉淀…………………………………………………………………………………………14
2.2.2DEAESepharoseFastFlow柱离子交换层析……………………………………………………14
2.3酶活的紫外吸收法测定………………………………………………………………………………14
3、结果……………………………………………………………………………………………………15
3.1AlyB分离纯化…………………………………………………………………………………………15
3.1.1硫酸铵沉淀……………………………………………………………………………………………15
3.1.2DEAESepharoseFastFlow柱离子交换层析……………………………………………………15
3.2褐藻胶裂解酶AlyB的性质分析………………………………………………………………………15
3.2.1温度对酶活性的影响………………………………………………………………………………15
3.2.2pH对酶活性的影响…………………………………………………………………………………16
3.2.3EDTA、金属离子对酶活性的影响…………………………………………………………………16
4、讨论…………………………………………………………………………………………………17
参考文献……………………………………………………………………………………19
第三章致谢……………………………………………………………………………22
第一章引言
近年来，伴随着海洋热，越来越多的人开始关注海洋，尤其关注海洋药物的开发及研究。
其中，海藻多糖的研究日益受到重视，尤其是以海带、巨藻、墨角藻等为原料生产的褐藻胶及褐藻胶低聚糖成为药物和食品研究的新热点。
褐藻胶是一种来源丰富、用途广泛的酸性海洋多糖，由α-L-古罗糖醛酸（G）及β-D-甘露糖醛酸（M）交替组合形成的线性高分子量聚合物。
褐藻多糖及其降解产物褐藻低聚糖已广泛应用于制药、食品、化工等多个领域。
研究证明褐藻寡糖在抗肿瘤、抗艾滋病、抗老年痴呆等方面有显著作用，具有广阔的发展前景。
褐藻胶裂解酶是通过β消去机制降解褐藻胶，它不但作为工具酶用于褐藻寡糖的制备，而且本身具有一定的药用价值，褐藻胶裂解酶可降解胞外褐藻多糖生物膜恢复病原菌对抗生素的敏感性，在治疗囊性纤维化（CF）患者肺部感染时效果明显。
另外，褐藻胶裂解酶还用于藻类原生质体的制备，对藻类生理生化特征等基础研究具有重要作用。
然而，由于褐藻胶裂解酶的分离纯化困难以及已发现的酶活性低等原因，导致迄今为止没有一种酶产业化。
1.褐藻胶
1.1褐藻胶的基本结构
褐藻胶，又称褐藻酸多糖，是由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古罗糖醛酸（G）两种糖单元交替组合形成的线性高分子量聚合物。
图1-1褐藻胶的结构
1.2褐藻胶的来源
褐藻胶广泛存在于巨藻、海带、昆布、鹿角菜、墨角藻和马尾藻等上百种褐藻（Phaeophyceae）的细胞壁以及细胞间质中。
在铜绿假单胞细菌（Pseudomonasaeruginosa）、棕色固氮菌（Azotobactervinelandii）等多种致病菌和土壤微生物中也分离得到了褐藻胶。
1.3褐藻胶寡糖及褐藻多糖生物活性研究
褐藻胶低聚糖包括海藻酸、海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸钙、海藻酸铵等。
目前技术能力已经达到使粘度降解至分子量2000左右。
褐藻胶低聚糖属纯天然多糖，具有特殊的生理活性，对改善人体生理功能，提高免疫力具有重要的作用。
可广泛用于食品、保健品和药品。
传统的食品添加剂对于提高食品的质量、档次、增强感官性状、强化营养、改善食品加工条件、防止腐败变质、延长食品的保质期等方面，发挥重要的作用。
但随着生活水平的提高、消费者保健意识的增强和食品工业本身的行业竞争，食品工业的创新朝着生产更富有营养、更有益人体健康、又能免除人们的某些疾病的功能性食品方向发展，因此在传统食品添加剂的基础上功能性食品添加剂应运而生，在国内食品生产领域广泛应用。
褐藻胶多糖的免疫调节作用表现在多糖能在多个层面、多条途径对免疫系统发挥调节作用。
包括对各类免疫细胞的调节、对细胞因子的调节、对补体的调节；
抗肿瘤作用；
抗病毒作用；
抗菌作用；
消除自由基和抗氧化作用。
同时，褐藻胶寡糖还具有抗疲劳、抗高血脂、抗凝血、降血糖、放射防护效果（抗辐射作用）。
褐藻多糖对海马神经细胞和皮质神经细胞均有明显的营养作用，对肺成纤维细胞增殖活性、血管平滑肌细胞增殖作用也有影响
褐藻糖胶（fucoidan,简称FPS）治疗慢性肾衰,对中早期肾衰效果好,无毒副作用,特别对改善肾功能,提高肾脏对肌酐清除率效果尤为显著,现已按国家二类新药获准进入临床研究。
褐藻糖胶还易与金属离子的结合，可作为金属离子的结合剂和阻吸剂。
临床上，褐藻胶可用做安全有效的止血药;
低泵糖褐藻酸钠可用做代血浆,是维持血容量的良好的扩容剂;
褐藻酸钠还可用做人工牙模材。
同时，不同衍生方法获得的褐藻胶及其胶衍生物，表现出了不同的重要生理活性，并已经开发成多种功能医药材料和食品。
管华诗等以褐藻胶为原材料，先后开发出我国第一代海洋药物PSS和第二代海洋药物甘糖酯（PGMS），不仅在临床上具有良好的疗效，而且创造了巨大的经济效益。
甘糖酯是低分子量硫酸多糖（平均分子量5,000Da），具有调节血脂，防止血栓形成和预防动脉粥样硬化的作用。
高焱等对甘糖酯降血脂作用的分子机制进行了研究，表明甘糖酯可以显著提高高脂血症大鼠肝、脾和主动脉组织中脂质代谢酶LPLmRNA的转录水平，从而起到调节血脂的作用。
研究表明，甘糖酯可以通过显著提高大鼠尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）mRNA的表达水平，从而提高uPA蛋白的活性，激活机体的纤溶系统，达到抗栓作用。
体外实验还表明，甘糖酯对牛脑血管平滑肌细胞的增殖具有抑制作用。
PSS除了在心脑血管病中的应用外,还被广泛用于治疗眼睑黄色瘤、突发性耳聋、系统性红斑狼疮、糖尿病性周围神经病变、不安腿综合征、新生儿硬化症及银屑病、积聚性痤疮、变态性血管炎、系统性硬皮病、静脉炎、结节性红斑、硬红斑、扁平苔癣等。
1.4褐藻多糖在细菌生物膜中的生物功能
细菌生物膜是指由附着于惰性或者活性实体表面的细菌细胞和包裹着细菌自身所分泌的含水聚合性基质所构成的结构性细菌群落。
细菌在其不同生长阶段具有多形性特点，比较特殊的是纤丝状形态变化。
细菌形成纤丝状菌体可由多种因素导致，Jensen等认为纤丝体是由于细菌受外界环境的影响不能正常分裂而形成的，是细菌对自然环境某些条件的适应性变化。
根据变形杆菌纤丝状菌体在原条件下无明显增殖，代谢缓慢，具有多个核质，能在适当条件下断裂形成多个繁殖体等特点，称其为潜生体。
多种因素可导致潜生体的形成，其长度可以是一般菌体的几倍乃至几十倍。
实验发现潜生体胞外粘液多糖的含量显著高于繁殖体。
粘液多糖具有多种重要的生物学性质，如抵抗吞噬细胞的吞噬和抗菌药物的损伤作用，也是细菌的粘附因子之一，粘液多糖的增多会对潜生体有关的生物学性质产生重要影响。
粘液型绿脓杆菌在组织表面的粘附主要受胞外粘液多糖的影响（非粘液型则主要受菌毛的控制）。
Hata等对绿脓杆菌感染的呼吸道表面的扫描电镜观察显示，非粘液型绿脓杆菌多以单个菌体粘附在细胞表面，粘液型绿脓杆菌则主要以微菌落群的形式粘附。
因此，粘液型菌株的粘附能力显著高于非粘液型菌株。
这个结论与本实验结果可以相互应证，即产生大量粘液多糖的潜生体对PG细胞的粘附率显著高于繁殖体。
粘液多糖对潜生体粘附能力的提高起到非常重要的作用，同时潜生体较大的个体也是重要的因素之一，因为个体较大，与细胞的接触面积增大，相互作用的机率也显著提高，从而有利于它粘附在细胞表面，也有利于相互聚集在一起。
（如图1-2、1-3）
图1-2绿脓杆菌潜生体对体外培养的PG细胞的粘附（瑞氏染色×
1000）
图1-3绿脓杆菌繁殖体对体外培养的PG细胞的粘附（瑞氏染色×
1000）
绿脓杆菌粘液多糖主要成分是藻酸盐，由D-甘露糖醛酸，L-古洛糖醛酸组成，多聚物中较多的羟基和羧基能促进细菌间的聚集。
藻酸盐是绿脓杆菌重要的毒力因子，绿脓杆菌能根据宿主环境的变化，调控它两个重要的毒力因子:
4型菌毛和藻酸盐的表达。
由粘附照片也可以看出，繁殖体散在地粘附于PG细胞表面，而潜生体则聚集在一起粘附于细胞表面，这就显著增加了细菌粘附的数量和质量。
聚集在一起的菌体构成稳定的群体结构，这种群体结构的适应能力明显提高，能抵抗不利因素的影响。
McCoy等研究表明，表面生长的细菌在其生物膜的形成过程中，伴随着潜生体的大量产生，这些潜生体使生物膜构成一个立体的交叉网络结构，使其在表面的存在更牢固。
生物膜在细菌致病过程中起到非常重要的作用。
总之，褐藻多糖作为细菌生物膜的主要组分之一，在维持细菌生物膜的稳定性和细菌对抗机体免疫系统和抗生素过程中，扮演着重要的角色。
2.褐藻胶裂解酶
褐藻胶裂解酶，又称褐藻胶裂合酶，英文名称作alginatelyase、alginases或者alginatedepolymerases，能够通过β─消去机制降解褐藻胶，产生一系列的低聚糖。
其作用位点是1→4糖苷键。
在水解的4-O糖苷键所在的糖环的C4和C5位置间形成双键，在褐藻胶解聚的同时，形成了含有4-脱氧-L-erythro-hex-4-烯醇式吡喃糖醛酸的非还原末端。
2.1褐藻胶裂解酶的来源
褐藻胶裂解酶主要有三个来源：
第一类是动物源的褐藻胶裂解酶，包括海洋软体动物和棘皮动物等。
1984年，国内的朱仁华等从朝鲜花冠小月螺、单齿螺和褐疣荔枝螺三种海螺中分离得到褐藻胶裂解酶的粗酶提取液，用粘度法测定了酶活力，尤以朝鲜花冠小月螺的分解活性最高。
1987年，Kloareg等，从海兔内脏中制备出褐藻酸酶，用于墨角藻合子的去壁，制备出了原生质体。
1989年，Yamaguchi等从海螺、鲍的内脏中制备出褐藻解壁酶，用于某些褐藻的细胞解离。
第二类是植物源的褐藻胶裂解酶，包括巨藻、泡叶藻、掌状海带、克氏海带等海藻。
1966年，LinY.T.等从海洋褐藻FucusgardneriSilva中分离提纯出褐藻酸酶。
1999年，Kraiwattanapong等自腐败海藻kombu中分离出一株褐藻胶酶高产菌N─1，并对其降解酶基因进行了克隆和测序。
第三类是微生物源的褐藻胶裂解酶，包括海洋细菌、土壤细菌和真菌等。
1984年，Jeffrey等以褐藻酸钠为唯一碳源，从土壤和海水中分离出产生褐藻酸裂解酶的芽孢杆菌，胞外酶表现出明显的内切甘露糖醛酸裂解酶性质，酶的分子量约为4OkD。
2001年，Wamoto等人研究发现埃氏别单胞菌（Alteromonassp．）可以产生一种褐藻酸胞内裂解酶，分子量为33.9kD，pI为3.8，在pH7.5～8.0时，具有最高活性。
通过酶动力学分析发现该酶优先降解Poly（G）。
2.2褐藻胶裂解酶的底物特异性
褐藻胶裂解酶的底物专一性是根据可降解M段或G段的不同而定义，底物聚合度对酶的作用也有影响。
多数裂解酶对Poly（M）有选择性，也有少数对Poly（G）有专一性。
1996年，Heyraud等人用核磁共振和高效液相色谱对鲍鱼（Haliotistuberculata）的酶的降解作用进行了研究，表明该酶对Poly（M）具有较高的亲和力，可以降解褐藻胶糖链中的M-M和G-M键，而G-G和M-G键不能够被降解。
1998年，Ertesvag等人从维涅兰德固氮菌（Azotobactervinelandii）中得到一种褐藻酸酶，经过克隆、定序，并在E．coli中表达，该酶可以降解M-M和M-G键的多糖，也可以降解含有乙酰基的键，但不能降解G-M和G-G的多糖。
1999年，OsamuMiyake等从Sphingomnclsp．A1中分离出三种褐藻胶外切裂解酶（A1—Ⅰ、A1—Ⅱ、A1—Ⅲ），A1—Ⅰ（65kD）自身催化转变为A1—Ⅱ（25kD）和A1—Ⅲ（4OkD）。
这些酶催化底物均不相同，后两者分别降解Ploy（G）和Ploy（M）；
而A1—Ⅰ对Ploy（G）和Poly（M）均能降解。
这种一个生物体产生多种不同褐藻胶酶或产生一种双功能裂解酶的方式，会更有利于微生物对结构复杂的褐藻胶的完全降解。
2.3褐藻胶裂解酶的分类
按其降解褐藻胶嵌段（底物专一性）的不同可分为三类：
专一性裂解1，4—β—D—甘露糖醛酸片段的裂解酶（A1y；
Ec4.2.2.3），专一性裂解1，4—L—古罗糖醛酸片段的裂解酶（Aly；
EC4.2.2.111）以及两种片段都可裂解的双功能裂解酶。
鲍属软体动物、鞘氨醇单胞发光细菌和铜绿假单胞菌是典型的Poly（M）裂解酶生产源；
克里伯氏产气菌是典型的Poly（G）裂解酶生产源；
别单胞菌和芽孢杆菌中发现能同时降解Poly（G）和Poly（M）的双功能裂解酶。
按其分子量大小不同也可分为三类：
第一类分子量在2OkD～35kD之间（Mr30000类），例如ALY—Ⅰ，GenBankAB030481；
A1—Ⅰ，GenBankAB03312；
AlyA，GenbankL19657；
第二类分子量约为40kD（Mr40000类），例如AcAlgL，GenBankAJ2236O5；
AvAlgi4t，F027499；
第三类分子量约60kD（Mr60000类）。
第二类酶专一性裂解M嵌段，而第一类酶有多种底物专一性。
2.4褐藻胶裂解酶的作用机制
褐藻胶裂解酶通过β消去反应裂解褐藻胶的糖苷键，催化底物分子分裂成两部分，其作用位点是β（1→4）糖苷键。
在裂解的4-O糖苷键所在的糖环的C4和C5位置间形成双键。
在褐藻胶解聚的同时，在产物的非还原性末端形成4─deoxy─L—erythro─hex─4─enopyranosy—luronate残基的寡聚糖醛酸。
由于褐藻胶裂解酶降解的褐藻胶在非还原性末端形成4，5一不饱和双键，在C上失去对称性。
因此，不论是l，4—β─D─甘露糖醛酸或1，4-α—L一古罗糖醛酸都生成不饱和衍生物，双键反应为酶降解所特有。
Gacesa提出了一种褐藻胶裂解酶的催化机制，这种机制可以同时解释褐藻胶的差向异构酶的作用机理，这两种酶的作用仅仅在反应的第三步有所不同。
这种机制包括三步反应：
（a）移去羧基阴离子上的负电荷，这一步通过盐桥的中和作用完成；
（b）从5位碳上获得质子的基质催化反应；
（c）羧基基团提供电子在C4与C5之间形成双键，导致了发生在4─O─糖苷键的β-消去反应。
在差向异构酶的作用机制中，第三步被C5上的质子置换反应所替代（即差向异构化）（如图1-4）。
图1-4褐藻胶裂解酶与褐藻胶差向异构酶作用机理（Gacesa）
2.5褐藻胶裂解酶的活性测定方法
根据褐藻胶裂解酶活性测定的方式，简单分类为定性测定和定量测定两种方式。
定性测定主要采用微生物唯一碳源生长法（M嵌段或者G嵌段）以及平板鉴定法。
唯一碳源生长法主要是使用含有褐藻胶、M嵌段或者G嵌段作为唯一碳源的固体培养基或者液体培养基，培养褐藻胶裂解酶的来源微生物，通过微生物的生长和液体培养基粘稠度的降低初步确定酶的活性。
其中较高纯度的M嵌段、G嵌段可以直接作为酶解反应的底物，进行活性和底物专一性的测定。
更加灵敏的测定方法则使用95%乙醇、饱和氯仿蒸汽或者钌红试剂等处理有微生物生长的培养皿，在一定的背景下观察水解圈的大小。
定量测定褐藻胶裂解酶活性的方法比较多，其中硫代巴比妥酸法（Thiobarbituricacidassay，TBA）、粘度法和紫外测量法最为常用。
TBA与裂解反应生成的不饱和末端反应，生成的复合物在548nm具有特定吸收，可以把1U定义为：
1分钟内每毫升反应液生成1微摩尔不饱和糖醛酸时所需要的酶量。
该方法灵敏而特异，缺点在于易于受其它不饱和糖的干扰。
使用盐分级沉淀得到的酶，或者使用蔗糖自膜周质分离得到的酶组分，需要进行透析处理，以去除可能产生干扰的杂质。
基于裂解反应产生的不饱和糖醛酸在230-240nm具有特定吸收，紫外检测法直观地表明了不饱和末端的生成，并且方法简单，干扰少。
2.6褐藻胶裂解酶的生物学功能
褐藻胶裂解酶作为一种重要的海洋生物酶，有着广泛的生物学功能。
褐藻的细胞壁是一种含有连续的三维褐藻胶网络的纤维素框架，褐藻胶网状结构由Ca2+搭桥的poly（G）以及缠绕其上的poly（M）链构成。
以海草碎片为食物的海洋动物，通常在它们的消化腔产生多种降解糖的酶,包括琼胶酶，纤维素酶以及褐藻胶裂解酶。
这种糖酶的混合物使这些海洋动物能够有效的利用从藻类中获得的能量。
大多数产生褐藻胶裂解酶的海洋细菌、陆生革兰氏阳性细菌以及少数陆生革兰氏阴性细菌可以利用褐藻胶作为它们的初级或二级碳源。
筛选这些产生褐藻胶裂解酶的生物所用的培养基中通常以褐藻胶作为主要碳源，产生褐藻胶裂解酶的微生物可以获得竞争性的生长优势。
当有三种微生物同时生长在含有褐藻胶的培养基时，可能说明它们存在共生关系。
很少有细菌同时合成多糖以及降解这种多糖的酶。
然而，Pseudomonas和Azotobacter合成细胞外褐藻胶，但是并不以它们为碳源或能源，在它们
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