生化实验合集Word格式文档下载.docx
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（V未－V对）×
NNaOH×
14.008
2
公式中V未为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。
V对为滴定对照液（3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。
NNaOH为标准氢氧化钠溶液的摩尔浓度。
六.注意事项
1.标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。
不可使用隔日贮在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。
2.中性甲醛溶液在临用前配制，若已放置一段时间，则使用前需要重新中和。
3.本实验为定量实验，甘氨酸和氢氧化钠的浓度要严格标定，加量要准确，全部操作要按分析化学要求进行。
4.脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定毫升数偏低。
而酪氨酸的滴定毫升数结果偏高。
七.思考题
甲醛滴定法为什么不能准确测定含有多种氨基酸的样品中的氨基氮？
实验六蛋白质的盐析和透析
1．目的要求
掌握蛋白质盐析和透析两种操作，了解蛋白质盐析和透析的原理与影响因素。
2．方法原理
在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析，盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。
蛋白质用盐析法沉淀分离后，需脱盐才能获得纯品，脱盐最常用的方法为透析法。
蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大，不能透过半透膜，而无机盐及其它低分子物质可以透过，故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯，即把蛋白质溶液装人透析袋内，将袋口用线扎紧，然后把它放进蒸馏水或缓冲液中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而保留在袋内，通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完为止。
透析常需较长时间，宜在低温下进行。
3．主要实验仪器及材料
鸡蛋；
氯化钠；
硫酸铵；
硝酸银；
硫酸铜；
氢氧化钠；
火棉溶液。
４．掌握要点
蛋白质盐析
５．实验步骤
1）蛋白质盐析
取10%鸡蛋白溶液5mL于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，蛋白即析出，如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质的析出。
2）蛋白质的透析
6．实验思考题
1）蛋白质的盐析和透析在生产和科研中有哪些具体的应用价值？
2）如何在盐析和透析操作中维持蛋白质的各种活性？
3）如果要进一步分离不同种类、分子量的蛋白质，还有哪些实验手段？
实验三氨基酸的分离鉴定--纸层析法
学时数：
4学时
一、目的：
学习分配层析的原理；
掌握氨基酸纸层析法的操作技术要点；
并了解氨基酸的呈色反应原理。
二、原理：
※分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。
混合物之间的分配系数相差越大，越容易分开。
通常用α表示分配系数。
一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定温度下是一个常数。
※纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，纸纤维上的－OH具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，有机溶剂通常作为流动相。
流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。
※氨基酸层析图谱常用茚三酮作显色剂。
氨基酸被分离后，在层析图谱上的位置用Rf（比移）表示。
Rf的主要决定因素是分配系数，另外还与物质的结构、溶剂系统、滤纸质量及层析温度等条件有关。
三、器材：
层析缸、毛细管、喷雾器、层析滤纸、电吹风
四、试剂：
展层剂（水饱和的正丁醇与醋酸的混合物）、氨基酸溶液（Pro、Val、Leu及其混合液）、茚三酮显色剂
五、步骤：
（取滤纸时，始终拿滤纸边缘）
1、平衡：
将展层剂置于层析缸中进行平衡。
2、标记：
取层析滤纸一张，在纸的一端距边缘2－3cm处用铅笔划一直线，在此直线上，每隔2－3cm做一记号（点样点）。
3、点样：
用毛细管将各氨基酸样品分别点在标记的位置上，干后在原来点样位置再点一次（可用吹风机吹干，但要控制温度不能太高）。
注意，每点的扩散直径不能超过3mm。
4、展层：
用线将滤纸缝成筒状（用透明胶粘也可以），注意滤纸的两边不能接触！
！
缝好后，将滤纸直立于层析缸中。
（点样端在下，展层剂的液面需低于点样线）待溶剂上升15cm左右（约40min），取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，吹风机吹干。
5、显色：
用喷雾器均匀喷上茚三酮显色液（要离开滤纸一定距离且要直立喷洒，显色液在滤纸上不能成柱状流下）；
热风吹干，可见显色的各层析斑点。
6、计算：
计用直尺量出原点到溶剂前沿及各层析点中心的距离，分别计算Rf值；
并通过比较单种氨基酸样品与混合液中氨基酸的Rf值，指出相对应的氨基酸。
六、结果：
实验九阳离子交换树脂摄取氯化钠
3学时
一、目的：
学习并掌握离子交换层析法的原理和基本操作技术
二、原理：
离子交换层析法是利用各种离子对交换剂的亲和力程度不同而达到分离的方法。
本实验利用阳离子交换树脂摄取氯化钠，作为柱层析的基本训练。
三、器材：
碱性滴定管、层析管、锥形瓶、玻璃棒、强酸型阳离子交换树脂、移液管等
四、试剂：
盐酸，氢氧化钠，10g/L的氯化钠，0.1mol/L的标准氢氧化钠溶液，酚酞指示剂
1、树脂处理、转型：
水浸过夜→盐酸浸泡→氢氧化钠溶液浸泡→盐酸转型→水洗至中性待用
2、装柱：
采用重力沉降法
关闭层析柱下端出口，用小烧杯将处理好的氢型树脂和水一起取适量，用玻璃棒一边搅拌一边加入层析柱，不要有气泡和分层，打开下端出口，当顶部水快干时，关闭出口。
3、加样：
加入6ml10g/L的氯化钠溶液，当溶液的弯月面在树脂顶端时，用蒸馏水洗脱。
4、洗脱：
收集40ml洗脱液
5、滴定：
用0.1mol/L的标准氢氧化钠溶液滴定洗脱液
6、计算
六、结果：
实验十、植物材料基因组DNA的提取、基因组DNA纯度与含量的测定
一、实验目的要求
学习和掌握植物基因组DNA的提取纯化方法。
二、实验原理
利用基因工程手段对植物进行定向改造，已成为当今植物育种学发展的一个新领域，植物基因工程操作离不开植物基因组DNA的制备。
利用基因组较长的特性可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离，加入一定量的异戊醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到分离的目的。
在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。
植物中的次生代谢产物一多酚类化合物可以介导DNA降解，而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题。
这些多糖能抑制限制酶，连接酶及DNA聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。
应考虑去除多糖和酚类物质。
三、实验材料、试剂和仪器
四、操作方法
1、取3m核酸提取缓冲液于离心管中，65℃水浴预热。
2、称取水稻幼苗叶片0.5g，剪碎，置于65℃预热的研钵中，加入少许石英砂，并加入3ml预热到65℃的核酸提取缓冲液。
快速研成匀浆，立即加入到预热离心管中，65℃恒温水浴1h，经常轻轻摇动。
3、加入等体积氯仿-异戊醇-乙醇溶液,轻柔颠倒混匀（带手套防止损伤皮肤）后，室温静置分层10min。
4、室温下5000rpm离心5min（弃沉淀）。
5、仔细移取上清液至另一离心管中，加入3m平衡酚，轻柔顺倒混匀，静置15min。
6、仔细移取上清液至另一离心管中。
加入1倍体积异丙醇混匀后静置20min，出现絮状DNA沉淀。
7、4℃5000rpm离心5min。
8、将沉淀移入新的离心管中（若蛋白质和RNA未除干净可重复操作）
9、加入1.5ml氯仿与1.5ml平衡酚，轻柔顺倒混匀，室温静置15min
10、4℃离心（12000rpm,10min）
11、上清液转移到干净离心管中，加入3mL氯仿,颠倒混匀，室温静置10min
12、4℃离心（12000rpm,10min）
13、转移上清液于新离心管当中，加入3mL氯仿,颠倒混匀，室温静置5min。
14、4℃离心（12000rpm,10min）。
15、转移上清液于新的离心管当中→加入2μLRnase（0.2g/L）,室温放置10min。
16、加入1/10体积3mol/LNaAc和2倍体积-20℃预冷的无水乙醇。
-20℃放置20min。
17、4℃离心（5000rpm,3min）收集沉淀
18、70%乙醇洗涤沉淀,倒掉乙醇溶液,37℃干燥沉淀30min。
让酒精完挥发。
19、用1mLTE溶解沉淀，此即为水稻基因组DNA溶液。
20、加RNA酶→保温20~30min。
21、取100μL水稻基因组DNA溶液，稀释10~20倍→用紫外分光光度计测定其A260、A280及A230值，计算DNA浓度及A260、A280、A230的值。
22、→取５μLDNA原溶液进行1%Agrose凝胶电泳检测纯度其结果（相对分子质量大小、纯度及质量）贴妥标签 →4℃保存备用。
说明:
如果蛋白质和RNA未驱除干净，重复酚，酚/氯仿，氯仿抽提步骤，继续用Rnase处理,乙醇沉淀和洗涤，重新溶于TE中，直至基因组DNA纯度和质量符合要求。
在DNA提取过程中应做到
Ⅰ、根据不同的需要，保证结构的相对完整性；
Ⅱ、尽量排除其它大分子成分的污染（蛋白质、多糖及RNA等）；
Ⅲ、保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。
注意事项：
1、裂解液要预热，以抑制DNase，加速蛋白质变性，促进DNA溶解。
2、各步操作要轻柔，尽量减少DNA的人为降解。
3、取上清液时，不应贪多以防非核酸类成分干扰。
4、异丙醇、乙醇、NaAc要预冷以减少DNA的降解，促进DNA和蛋白质的分相及DNA的沉淀。
实验一蛋白质含量测定法
本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。
了解各种测定方法的基本原理和优缺点。
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：
①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；
②蛋白质的性质；
③溶液中存在的干扰物质；
④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法
样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：
CH2COOH
|+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3
（1）
NH2
2NH3+H2SO4→（NH4）2SO4
（2）
（NH4）2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3（3）
反应
（1）、
（2）在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白
氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
五种蛋白质测定方法比较如下：
方法
灵敏度
时间
原理
干扰物质
说明
凯氏定氮法
（Kjedahl法）
灵敏度低，适用于0.2~1.0mg氮，误差为±
2％
费时
8～10小时
将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定
非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）
用于标准蛋白质含量的准确测定；
干扰少；
费时太长
双缩脲法（Biuret法）
灵敏度低
1～20mg
中速
20~30分钟
多肽键＋碱性Cu2＋→紫色络合物
Tris缓冲液；
某些氨基酸
用于快速测定，但不太灵敏；
不同蛋白质显色相似
紫外吸收法
较为灵敏
50～100μg
快速
5～10分钟
蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收
各种嘌吟和嘧啶；
各种核苷酸
用于层析柱流出液的检测；
核酸的吸收可以校正
Folin－酚试剂法（Lowry法）
灵敏度高
～5μg
慢速
40～60
分钟
双缩脲反应；
磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原
甘氨酸；
各种硫醇
耗费时间长；
操作要严格计时；
颜色深浅随不同蛋白质变化
考马斯亮蓝法（Bradford法）
灵敏度最高
1～5μg
快速
5～15分钟
考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其λmax由465nm变为595nm
强碱性缓冲液；
TritonX-100;
SDS
最好的方法；
干扰物质少；
颜色稳定；
二、双缩脲法（Biuret法）
（一）实验原理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
H2O
O=CC=O
HNNH
R-CHCH-R
O=CCuC=O
紫色络合物
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1~10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：
硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材
1.试剂：
（1）标准蛋白质溶液：
用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NNaOH配制。
（2）双缩脲试剂：
称以1.50克硫酸铜（CuSO4·
5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·
4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10%NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。
此试剂可长期保存。
若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2.器材：
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法
1.标准曲线的测定：
取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。
充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。
用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。
取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定：
取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。
注意样品浓度不要超过10mg/ml。
实验十三蛋白质的两性性质及等电点的测定
一、目的
通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。
掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。
二、原理
蛋白质是两性电解质。
蛋白质分子中可以解离的基团除N-端α-氨基与C-端α-羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离为带电基团。
因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：
调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。
在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。
三、仪器和试剂
1．仪器
（1）试管架
（2）试管：
15ml×
6
（3）刻度吸管：
lml×
4，2mI×
4，10ml×
（4）胶头吸管×
2.试剂
（1）1mol／L乙酸
（2）0.1mol／L乙酸
（3）0.01mol／L乙酸
（4）0.2mol／LNaOH
（5）0.2mol／L盐酸
（6）0.01％溴甲酚兰绿指示剂
（7）0.5％酪蛋白
四、操作步骤
（1）取一支试管，加0.5％酪蛋白1ml，再加溴甲酚兰绿指示剂4滴，摇匀。
此时溶液呈蓝色，无沉淀形成。
（2）用胶头滴管慢慢加入0.2mol／L盐酸，边加便边摇直到有大量的沉淀生成。
此时溶液是pH值接近酪蛋白的等电点。
观察溶液颜色的变化。
（3）继续滴加0.2mol／L盐酸，沉淀会逐渐减少以至消失。
观察此时溶液的颜色变化。
（4）滴加0.2mol／LNaOH进行中和，沉淀又出现。
继续滴加沉淀又逐渐消失。
2.酪蛋白等电点的测定
（1）取同样规格的试管7支，按下表精确地加入下列试剂
试剂（ml）
管号
1
3
4
5
6
7
1mol／L乙酸
1.8
0.8
0.1mol／L乙酸
4.0
1.0
0.01mol／L乙酸
2.5
1.25
0.62
H2O
2.4
3.2
3.0
0.5
2.75
3.38
溶液的pH
3.5
3.8
4.1
4.7
5.3
5.6
5.9
（2）充分摇匀，然后向以上各试管依次加入0.5％酪蛋白lml，边加边摇，摇匀后静置5min，观察各管的混浊度。
五、结果处理
用一、＋、＋＋、＋＋＋等符号表示各管的混浊度。
根据混浊度判断酪蛋白的等电点。
最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。
六、注意事项
缓冲液的pH值必须准确。
七、思考题
1．解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。
2．该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？
实验一醋酸纤维薄膜电泳分离核苷酸
学习核糖核酸碱水解的原理和方法，掌握核糖核苷酸的醋酸纤维薄膜电泳的原理和方法。
RNA在稀碱条件下水解，先形成中间物2＇，3＇-环状核苷酸，进一步水解得到2＇和3＇-核苷酸的混合物。
在PH3.5时，各核苷酸的第一磷酸基（PK0.7－1.0）完全解离，第二磷酸基（PK6.0）和稀醇基（PK9.5以上）不解离，而含氮环的解离程度差别很大。
（见附表）因此在PH3.5条件下进行电泳可将这四种核苷酸分开。
四种核苷酸在PH3.5时的离子化程度：
核苷酸
含氮环的PK值
离子化程度
净负电荷
AMP
3.70
0.54
0.46
GMP
2.30
0.05
0.95
CMP
4.24
0.84
0.16
UMP
－
1.00
本实验先用稀氢氧化钾溶液将RNA水解，再加高氯酸将水解液调至PH3.5，同时生成高氯酸钾沉淀以除去K+,然后用电泳法分离水解液中各核苷酸，并在紫外分析灯下确定RNA碱水解液的电泳图谱。
电热恒温水浴锅；
紫外分析灯（波长为254nm）点样器；
离心机；
电泳仪和电泳槽
100ml0.3mol/L氢氧化钾溶液；
40ml200g/L高氯酸溶液；
4g核糖核酸（粉末）；
1000ml0.02mol/LPH3.5柠檬酸缓冲液；
3.材料
醋酸纤维薄膜（2×
8cm）
1.RNA的碱水解：
称取0.2gRNA，溶于5ml0.3mol/L氢氧化钾溶液中，使RNA的浓度达到20－30mg/ml。
在37度下保温18小时（或沸水浴30分钟）。
然后将水解液转移到锥形瓶内，在水浴中用高氯酸溶液滴定到水解液的PH为3.5。
2000转/分离心10分钟，除去沉淀，上清液即为样品液。
2.点样
将醋酸纤维薄膜在PH3.50.02mol/L柠檬酸缓冲液中浸湿后，用滤纸吸去多余的缓冲液。
然后将膜条无光泽面向上平铺在玻璃板上，用电样器在距膜条一端2－3cm处点样。
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