紫杉醇及阿霉素对细胞增殖及凋亡的影响细胞生物学综合实验报告文档格式.docx
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cellproliferation；
BGC-823cells；
apoptosis；
MTTassay；
fluorescentstaining；
adriamycin；
paclitaxel；
1引言（Introduction）
恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一，极大地危害人类的健康，并将成为新世纪人类的第一杀手。
从世界范围来看，2000年全球新发癌症病例1010万，死亡620万，现患癌症病例2240万[1]。
同时，恶性肿瘤已不再只是发达工业国家的严重疾病，发展中国家面临着更大的疾病负担。
我国作为一个发展中的大国，由于工业化、城镇化和人口老龄化进程的加快，不良的生活方式以及环境污染等问题的存在，恶性肿瘤面临的形势也愈发严峻[2]。
细胞凋亡是一种由基因调控的细胞主动死亡过程，抗肿瘤药物的治疗效果依赖于它们诱导肿瘤细胞凋亡的能力。
细胞凋亡一般由细胞外的调节因素与其在细胞表面的受体结合而启动。
经活化的受体又启动胞内第二信号系统，激活核酸内切酶，引起DNA裂解，进而引发细胞凋亡。
细胞外的调节因素包括生理活性因子：
如肿瘤坏死因子、转化生长因子及表皮生长因子等；
非生理因素：
如X射线、紫外线、一氧化氮、毒素及化疗药物等；
感染因素：
如EB病毒、腺病毒及HIV病毒等。
[3]有学者认为，细胞凋亡的信号传导能使用或部分利用细胞增殖和分化过程中的传统信号途径。
传统信号途径包括G结合蛋白信号途径和酶蛋白信号途径，前者可以调节第二信使cAMP和Ca2+的生成，细胞内cAMP和Ca2+浓度的变化可以对细胞凋亡产生影响；
后者可通过酪氨酸蛋白激酶、Ras-MAPK或Jak-STAT等途径参与凋亡信号的传导。
但众多研究表明可直接启动细胞凋亡的信号途径或死亡信号途径是两种死亡因子，即肿瘤坏死因子和Fas配体与细胞膜表面的相应受体TNF受体和Fas结合以后所发生的凋亡反应。
阿霉素（doxorubicinhydrochloride，DOX，adriamyein，ADM）是一种周期非特异性抗癌药，对各期细胞均有作用，但对s期的早期最为敏感，M期次之，对G1期最不敏感。
本药既含有脂溶性的蒽环配基，又有水溶性的柔红糖胺基，并有酸性酚羟基和碱性氨基，因此具有很强的抗癌活性。
ADM是蒽环类抗生素，其部分分子结构可嵌入到DNA双链中形成稳定的复合物，影响DNA的结构和功能，阻止DNA复制和RNA的合成。
在临床应用时，主要通过药物插入DNA引发拓扑异构酶Ⅱ裂解DNA，从而破坏DNA三级结构。
[4]其抗瘤谱较广，对乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌等多种癌症都有一定疗效，可引起恶心、呕吐、脱发、高热等不良反应。
紫杉醇是1963年美国化学家瓦尼（M.C.Wani）和沃尔（MonreE.Wall）首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（PacificYew）树皮和木材中分离到的粗提物。
在筛选实验中，Wani和Wall发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性成份。
由于该活性成份在植物中含量极低。
紫杉醇是目前疗效较好的一类新的抗微管药物，对许多癌症有特殊疗效，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、膀胱癌等。
紫杉醇作用的目标是细胞骨架的微管系统，它结合到到β-微管蛋白的N-端第31位氨基酸和217～231位氨基酸位点上，促进微管聚合并稳定微管结构，阻止其解聚成亚单位，进而影响到微管聚合与解聚的动态平衡，导致细胞周期阻断在G2/M期。
[5]近年来许多研究证明，紫杉酸可诱导多种癌细胞凋，正是由于这种诱导细胞凋亡的能力，使得紫杉醇具有特殊的临床效果。
2研究背景
2.1细胞生长曲线
一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过潜伏期进入指数生长期。
在细胞到达包和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。
典型的生长曲线可分为潜伏期，指数增长期，稳定期和衰退期。
以存活细胞数对培养时间作图，及得生长曲线，生长曲线常用与测定药物等外来因素对细胞生长的影响。
2.2MTT检测法
MTT检测法是检测细胞增殖活力的一种简便准确的方法。
其原理是在活细胞生长和增殖过程中，线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使黄色的外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，生成的甲瓒量的多少与细胞的数量和细胞的活力成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。
其优点是简单、快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验，肿瘤放射敏感性实验分析。
2.3IC50（半数抑制浓度）
IC50是指在用药后存活的细胞数量减少一半时所需的药物浓度。
在MTT法中,就是以对照组吸光度OD值减少一半所需的药物浓度为IC50。
除此以外,半数抑制浓度的含义还相当于药物对培养细胞的最小致死剂量的平均值,作为反映药效的定量指标,在各种药物的筛选中广泛应用。
本实验将以此法测定药物对细胞增殖抑制的IC50值所对应的药物浓度。
2.4Hoechests-PI双染色法
细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞
PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。
荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是PropidiumIodide。
它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。
尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。
PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。
PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。
Hoechst是一种膜通透性的荧光染料，故正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核Hoechst染色的形态呈圆形，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒；
而调亡细胞的细胞核由于浓集而呈亮蓝色，或核呈分叶，碎片状，边集。
3研究材料与方法
3.1材料
实验以人胃癌BGC-823细胞为本实验室常规保存的细胞，于37℃、5％co2培养箱中培养。
主要试剂
紫杉醇（母液浓度1.9mg/ml），阿霉素（母液浓度5mg/ml），4℃冷藏。
MTT（母液浓度5mg/ml溶于PBS）、DMSO培养液，胰酶，胎牛血清，DMEM培养基，裂解液（0.01MHCI，10%SDS），PBS（PH7.4），PI染液，Hoechests-33342染液。
实验仪器用具主要有荧光显微镜，CO2培养箱，离心机，酶标测定仪，冰箱，计数器，排枪，96孔板，酒精灯等。
3.2方法
3.2.1细胞预培养取对数生长期的BGC-823细胞，用胰酶消化后计数，配置细胞悬液浓度为4×
105/ml；
在96孔板两侧各一列的孔中加入0.2mlDMEM培养基，在中间10列孔中用排枪各加入0.2ml细胞悬液；
将96孔板放入37℃CO2培养箱中培养过夜；
3.2.2药物处理用不同浓度梯度的紫杉醇和阿霉素分别进行药物处理，并设置对照组。
药物处理的96孔板设计如表1和表2所示；
48小时后取出96孔板，吸出所有孔中的液体，各加入0.1ml新鲜培养基和10μlMTT；
4小时后再在每个孔中加入0.1ml裂解液，过夜培养；
3.2.3测定结果用酶标仪测定OD值，检测波长570nm；
将测得的实验组和对照组的OD值分别通过线性拟合作图，计算出两种药物48小时下对于823细胞的IC50；
3.2.4药物处理及荧光检测将一瓶对数期的823细胞传到4个瓶中，于37℃CO2培养箱中培养1天；
将4瓶细胞中的两瓶分别加入IC50浓度的阿霉素和紫杉醇，另外两瓶作为对照组一起放入培养箱中培养48小时；
将4瓶细胞中的悬液分别倒入离心管中，然后用胰酶消化，再将各自的悬液倒回培养瓶中吹打，将壁上细胞洗下来后再倒入离心管中1000rpm离心10分钟；
倒掉上清，用PBS重悬细胞；
取188μlPBS细胞悬液，加入10μlPI，2μlHo.33342,37℃温箱中避光标记15min；
1000rpm离心10分钟，弃上清，加10-50μlPBS重悬，取10μl滴于载玻片上，盖片，保存于暗处；
荧光显微镜下观察拍照（紫外激发）。
数据分析处理采用SPSS12.0；
表1：
96孔板设计（用紫杉醇药物处理）
1
2
3
4
5
6
A
无细胞
不加药
6μg/mL
8μg/mL
10μg/mL
12μg/mL
B
C
D
E
F
G
H
表2：
96孔板设计（用阿霉素药物处理）
7
8
9
10
11
12
2μg/mL
4μg/mL
4研究结果及分析
4.1不同浓度梯度下紫杉醇和阿霉素药物处理后的OD值
以未加细胞的空白组作为基准使用酶标仪测570nm下96孔板OD值，并算出相应的平均值和标准差，结果如表3和表4所示（其中浓度为0的为不加药的细胞对照组）：
表3紫杉醇OD值
浓度（μg/ml）
OD
0.848
1.165
0.780
0.791
1.136
0.746
0.829
0.738
0.745
1.061
0.836
0.820
0.726
0.741
1.088
0.742
0.797
0.723
1.045
0.534
0.776
0.661
0.669
1.024
0.571
0.750
0.648
0.692
1.020
平均值
0.71
0.86
0.73
1.06
标准差
0.132
0.154
0.050
0.043
0.044
表4阿霉素OD值
0.161
0.242
0.323
0.447
0.17
0.237
0.314
0.448
0.159
0.244
0.31
0.466
0.169
0.238
0.324
0.495
0.228
0.515
0.145
0.214
0.308
0.5
0.16
0.23
0.32
0.48
0.010
0.011
0.007
0.029
可见紫杉醇组的标准差整体都大于阿霉素组的标准差，说明紫杉醇组的数据波动较大，可能是由于操作过程引入了较多误差。
将各浓度下OD值的平均值进行作图，并做线性拟合如图1和图2所示：
图1紫杉醇统计结果
图2阿霉素统计结果
通过对照组可知不加药的细胞正常情况下的OD值为1.14，半数死亡即只存活一半细胞时的OD值推测为0.53。
经回归计算，阿霉素IC50为0.48μg/ml，紫杉醇IC50无法通过结果数据算出，我们根据其它小组的结果取9μg/ml作为紫杉醇的IC50。
4.2Hoechest-PI双染色结果
MTT法得出阿霉素IC50后向细胞培养瓶中加药时，将阿霉素加成5.2μg/mlRSK，另一培养瓶中加紫杉醇的IC50（9μg/ml），此外还有两个不加药的培养瓶作为对照也进行染色观察，结果如图3所示（图片放大倍数为20×
10）：
图3荧光染色结果
MTT法得出阿霉素IC50后向细胞培养瓶中加药时，将阿霉素加成5.2μg/mlRSK，浓度低于RSK的IC50，导致双染色后凋亡细胞较少，另一培养瓶中紫杉醇加药正常；
紫杉醇组细胞数量较少，其中主要为死亡细胞和凋亡细胞，可能是由于我们用胰酶消化完细胞后用PBS多洗了一次，导致细胞的流失；
RSK组细胞数量多，死亡细胞与凋亡细胞均较少，这应该是由于我们是按照阿霉素IC50浓度（5.2μg/ml）加的RSK，此浓度小于RSK的IC50，所以只能使较少的细胞发生凋亡；
对照组细胞数量中等，几乎未见死亡细胞与凋亡细胞，符合实验预期。
5反思
（1）整个实验期间注意无菌操作，避免细胞的污染，影响实验结果的准确性和实验进程。
（2）小组成员合理安排时间与分工，避免因复杂的实验流程而造成混乱。
（3）注意细胞保种，发现细胞污染时要及早采取补救措施。
（4）实验每一步的操作和结果要记好，组员之间多交流，本次实验中出现的加药失误主要就是因为最初的实验本上写的是RSK，而后改为阿霉素后并没有更改实验本，也因为沟通较少未发现这个问题。
参考文献
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