植物细胞工程实验报告肖峰.docx
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植物细胞工程实验报告肖峰
实
验
报
告
姓名：
肖峰
学号：
B0704002
班级：
07生物技术
（1）班
指导老师：
莫廷辉
时间：
2009年11月
目录
实验一、培养基母液的配制
实验二、培养基的配制与灭菌
实验三、香蕉吸芽的组织培养
实验四、烟草叶片的组织培养
实验五、柱花草的组织培养
实验六、木薯的组织培养
实验七、桉树的组织培养
实验八、玉米不成熟胚的培养
实验九、花生成熟胚培养
实验十、水稻盾片的培养
实验十一、芦荟的组织培养（自选材料实验）
实验一、培养基母液的配制
一、实验目的
掌握培养基母液的配制。
在配置培养基之前，为了方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。
当配置培养基时，只需按预先计算好的量吸取母液。
二、实验原理
培养基是植物细胞、组织和器官吸取营养的场所。
在植物细胞的分裂和分化过程中，需要各种营养物质，这些营养物质包括无机营养成分、有机营养成分、植物生长调节物质等。
在对植物的器官、组织和细胞进行离体培养时，只是切取植物体的一小部分，它们无法象整体植株那样合成生长发育所需的全部物质。
而自然界的植物千差万别，每一种植物都有自己独特的生理代谢过程和各自的营养需求，没有哪一种培养基能够适用于所有植物。
因此，对培养基组成成分的筛选是非常重要和必不可少的程序。
目前对植物进行组培时，人们所使用的培养基只几十种，其中MS培养基应用最为广泛。
说明MS培养基的无机盐成分对许多植物种均是适宜的，它的无机盐含量较高，微量元素种类较全，浓度也较高。
三、实验试剂与仪器设备
1、药品试剂：
母液、蔗糖、卡拉胶（或琼脂）、NaOH溶液、HCl溶液、无菌水、NAA、BA、IAA、2，4-D等。
2、仪器设备：
电子天平、量筒、PH试纸、培养瓶、解剖刀、酒精灯、高压灭菌锅、移液管、洗耳球、玻璃棒、药勺、超净操作台、铁架、镊子等。
四、实验内容
（一）母液的配制
MS培养基母液方案配制如下表：
成
分
1L母液的用量（mg/L）
每升培养基取用量（ml）
备
注
大量元素（20X）
NH4NO3
33000
50
KNO3
38000
KH2PO4
3400
MgSO4﹒7H2O
7400
CaCl2
6600
50
单独配制
铁盐（100X）
FeSO4.7H2O
2780
10
Na2-EDTA
3730
微量元素（200X）
KI
166
5
H3BO3
1240
MnSO4.H2O
3380
ZnSO4.7H2O
1720
Na2MoO4.2H2O
50
CuSO4.5H2O
5
CoCL2.6H2O
5
有机元素（100X）
VB1
10
10
VB6
50
烟酸
50
甘氨酸
200
肌酸
10000
具体配制步骤如下：
1、大量元素母液的配制
无机盐中大量元素母液，按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大20倍，用感量为0.01g的扭力天平，分别用50mL烧杯称量，用重蒸馏水溶解.溶解时在每只烧杯中加入30-40mL重蒸馏水，置于酒精灯上,加热使其溶解（注意温度不可过高，60-70℃）。
溶解后，在1000mL量筒中，混合后用重蒸馏水定容到1000mL。
其中CaCl2单独配制。
在加入母液时CaCl2应最后加入，以免形成沉淀。
将配好的混合液倒入细口瓶中，贴好标签保存于冰箱中。
配制培养基时，配1000mL培养基取此母液50mL。
2、微量元素母液的配制
无机盐中微量元素母液，按照培养基配方用量的200倍，用微量0.0001g的电光分析天平，分别用50mL烧杯称量，用重蒸馏水溶解。
混合定容于100ml容量瓶中保存于冰箱中,配制培养基时，每配制1000mL培养基取此母液5mL.
3、铁盐母液的配制
无机盐中铁盐母液，按照培养基配方用量的100倍，用感量0.01g的扭力分析天平，分别用50mL烧杯称量，用重蒸馏水溶解，混合定容，倒入细口瓶中，每配制1000mL培养基取此母液10mL。
4、有机元素的配制
无机盐中有机元素母液，按照培养基配方用量的100倍，用感量0.01g的扭力天平，分别用50mL烧杯称量，用重蒸馏水溶解，混合定容，倒入细口瓶中，每配制1000mL培养基取此母液10mL。
五、实验结果
经过大家的集体分工，很快就配制好了母液。
母液澄清，无沉淀，说明配制成功，可以储存起来。
六、注意事项
1、配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如Ca2+和S042-，Ca2+、Mg2+和PO43-一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。
2、配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。
3、药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。
4、药品的称量及定容都要准确。
各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。
5、一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液，其中维生素氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。
5、母液配好后放入冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。
实验二、培养基的配制与灭菌
一、各培养基配制
1、香蕉培养基：
诱导培养基：
MS＋BA3.0mg／L
继代培养基：
MS＋BA3.0mg／L
生根培养基：
MS＋NAA0.5mg／L
2、烟草叶片培养基：
诱导培养基：
MS＋BA1.0mg／L
继代培养基：
MS＋BA1.0mg／L＋NAA0.5mg／L
生根培养基：
MS＋NAA0.2mg／L
3、柱花草培养基
叶片愈伤组织诱导培养基：
MS+BA4mg/L+NAA1.0mg/ml
继代培养基：
MS+BA4mg/L+NAA0.01mg/ml
芽伸长培养基：
MS+BA0.4+NAA0.1mg/ml
4、木薯外植体培养基：
诱导培养基：
MS+GA30.02mg/L+NAA0.02mg/L
继代培养基：
MS+GA30.02mg/L+NAA0.02mg/L
生根培养基：
MS+NAA0.02mg/L
5、桉树外植体培养基：
芽的诱导培养基：
1／2MS＋BA0.5mg／L＋IBA1.0mg／L
芽的增殖培养基：
MS＋BA0.5mg／L＋IBA0.2mg／L
生根培养基：
1／2MS＋NAA0.2mg／L
6、花生胚培养基：
1／2MS
7、玉米胚培养基：
1／2MS
8、水稻盾片培养基：
水稻发芽培养基：
MS
诱导培养基：
MS＋2，4-D2.0mg／L＋BA1.0mg／L
分化培养基：
MS＋BA2.0mg／L
生根培养基：
MS＋NAA1.5mg／L
9、自选材料—芦荟培养基
芽诱导培养基：
MS+BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L
继代增殖培养基：
MS+BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L
生根培养的培养基配：
1/2MS+NAA0.1mg/L
二、培养基的配制及消毒：
（1）按照MS培养基的配方（以配制1LMS培养基为例）取大烧杯加入先前配制好的母液其中包括：
大量元素50ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素10ml，最后加钙盐50ml充分混匀。
再加入30g食用白糖，加入适量的去离子水使总量将近1L，混匀后调PH值（调至5.8-6.2），用1000ml量筒定容，最后向培养基中添加8.0g卡拉胶混匀。
注意事项：
配制MS时，钙盐一定要最后加入；
调好PH值后再加卡拉胶（或琼脂）。
（2）培养基配制好后分装到培养瓶中每瓶约30ml，盖好瓶盖帖上标签。
需要加入激素的培养基在定容到1000ml后加入所需的激素。
混匀后调PH值（调至5.8-6.2），用1000ml容量瓶定容，最后向培养基中添加8g卡拉胶，混匀后进行分装，然后装入高温高压灭菌锅进行灭菌（一般培养基用0.1MPa，121.5℃，15～30分钟可达到彻底灭菌的目的）。
灭菌好后取出冷却备用。
（3）培养环境条件：
培养温度为28（-1、+1）℃，光照强度2000—3000LX，光照时间为12h/d，每隔7天观察一次。
三、超净操作台的消毒
消毒时先用75%的酒精对超净台的各处进行消毒，点燃酒精灯放于超净台右侧，再对实验工具进行灼烧灭菌，后放于架上冷却待用。
并依次将实验中所用培养基瓶及所需试剂瓶进行消毒，置于超净台左侧，注意实验中要用75%的酒精对手进行消毒。
实验三、香蕉吸芽的组织培养
摘要：
香蕉是热带、亚热带地区的重要水果，也是华南四大名果之一，在果树栽培中占有相当的比重。
香蕉栽培具有速生快长、投产早、产量高、效益好、供应期长等优点。
传统的繁殖方法多是采用吸芽分株法，这种方法的繁殖系数低，速度慢，难以满足当前大规模的栽培生产，且容易传播疾病。
利用组织培养的技术来对香蕉优质品种进行无性繁殖，这样不但可以保持香蕉的优良性状，加快繁殖速度，而且，试管苗不带病虫害和病毒病，并且，利用组织培养技术得到的幼苗生长比较一致，有利于田间的管理和采收。
本实验利用香蕉的吸芽作为外植体，诱导培养基为MS＋BA3.0mg／L，继代培养基为MS＋BA3.0mg／L，生根培养基为MS＋NAA0.5mg／L。
关键词：
香蕉吸芽诱导继代生根培养外植体
1、材料和方法:
1.1材料
（1）香蕉吸芽：
从农学院基地挖取品种优良无病虫害的香蕉吸芽
（2）实验采用MS基本培养
（3）诱导培养基：
MS＋BA3mg／L
（4）继代培养基：
MS＋BA3mg／L
（5）生根培养基：
MS＋NAA0.5mg／L
（6）PH：
5.8-6
1.2方法
1.2.1外植体消毒方法
用自来水冲洗吸芽表面的泥土，剥离外假茎，只留下茎和假茎各2-3cm长，假茎的的直径有2-3cm，然后，用洗衣粉清洗一遍，用自来水冲洗，转入0.1%升汞浸泡15-20min，其间不断搅拌，弃去升汞用无菌水洗3遍（无菌水漂洗：
将从升汞中取出的香蕉吸芽组织块转入无菌水中漂洗，不断摇动使漂洗干净）留在瓶中备用。
1.2.2诱导培养
将香蕉吸芽放到无菌工作台的无菌纸上，用消毒刀将外植体的假茎的最外层剥掉，以及有消毒刀将已经变色的茎外面一小层也切掉，然后从外植体茎中间一分为四，接入诱导培养基，共8瓶。
7天后观察，发现诱导培养基中香蕉吸芽组织裂开并且有转绿现象。
1.2.3继代培养
14天后，将已经启动培养的香蕉材料从培养室内取出，在超净工作台上将生长良好的香蕉芽丛分开，切去顶部叶片部分，削去底部褐化部分，将芽丛接种于香蕉继代增殖培养基中。
继代增殖培养中每瓶培养基的接种香蕉芽丛数2代内可为1-2块，3-4代可为3-4块。
继代增殖培养代数视整个细胞工程实验时间而定，一般每2-3周继代一代，可继代增殖培养3-4代。
1.2.3根的诱导
等到分化出来的芽长到1-2cm长后，将其从香蕉吸芽组织中切下来，接入生根培养基中，诱导其生根。
1.2.4炼苗和移栽（略）
1.2.5培养条件：
培养温度为28（-1、+1）℃，光照强度2000—3000LX，光照时间为12h/d（注意香蕉吸芽诱导期无需光照）,每个星期观察一次。
2、实验结果与分析：
2.1对香蕉的吸芽进行诱导培养时，共接种了8瓶，褐化现象不是很严重，诱导率为100%，污染率为0，说明用0.1%的升汞对香蕉的吸芽消毒15-20min的时间控制比较合理，消毒的效果也很好。
附录1、诱导培养实验结果统计表
外植体数目
成活数
污染数
成活率
污染率
8
8
0
100%
0
2.2第一次继代培养时获得了7瓶香蕉苗，有1瓶香蕉苗由于褐化现象比较严重而死去。
可能是因为在继代的培养过程中，用刀切去褐化部分时切去的过多，使香蕉基部受伤严重而死亡。
第二次继代培养获得了7瓶香蕉苗，污染率为0，生长状况良好，其中1瓶已经分化出2个芽。
第三次继代培养时，将其中明显分出多个芽的香蕉苗进行分割，共获得了10瓶香蕉苗，污染率为0。
附录2、继代培养实验结果统计表
继代次数
外植体数
成活数
污染数
成活率
污染率
第一次
8
7
0
87.5%
0
第二次
7
7
0
100%
0
第三次
10
10
0
100%
0
2.3将增殖后的香蕉幼苗接种至生根培养基中，培养7天后观察，发现没瓶中的香蕉苗都有不同长度的根产生，生根率达100%，根的平均长度约为2cm。
附录3、生根培养实验结果统计表
外植体数
生根数
污染数
生根率
污染率
平均根数
平均根长
10
10
0
100%
0
4条
2cm
3、实验结论：
由实验结果与分析可知，诱导培养基MS＋BA3mg／L，继代培养基MS＋BA3mg／L，生根培养基MS＋NAA0.5mg／L对香蕉吸芽的诱导、继代增殖、生根效果都很好，说明这些培养基中各成分的配比比较合理，可以作为借鉴。
4、注意事项
1）整个实验过程要严格进行无菌操作；
2）倒培养基时要边用玻璃棒搅拌，边倒培养基，防止培养基的浓度不均匀；
3）观察记录时，要注意拿组培瓶的方式，手要握住组培瓶的下方而不要握住组培瓶的盖子；
4）发现污染的外植体，要及时清理干净，以免污染其他的；
5）观察记录时要仔细，认真描述并做好记录。
实验四、烟草叶片组织培养
摘要：
烟草具养价值高于任何奶有药用、工业用、保健美容等价值，从烟叶中提取的蛋白质其营类的蛋白质，而烟碱有杀菌止血的功能，是医院必备的药品。
目前烟草一般采用有性繁殖，但繁殖的烟苗不均衡，易发生变异，而且易感病菌，造成多种病害发生，品质退化，从而影响经济收人。
用嫩叶片的组培方法，可以保持优良品种的优良性状，减少病虫害，从而达到高产优质的目的。
另外，烟草生长速度快，生长周期短，所以是基因工程中最为广泛使用的模式植物之一。
本实验利用烟草的叶片作为外植体，诱导培养基为MS＋BA1.0mg／L，继代培养基为MS＋BA1.0mg／L＋NAA0.5mg／L，生根培养基为MS＋NAA0.2mg／L。
关键词：
烟草叶片诱导继代生根培养外植体
1、材料和方法:
1.1材料
1）、烟草叶片
2）、MS为基本培养基
3）、诱导培养基：
MS＋BA1.0mg／L
4）、继代培养基：
MS＋BA1.0mg／L＋NAA0.5mg／L
5）、生根培养基：
MS＋NAA0.2mg／L
1.2方法
1.2.1外植体消毒方法
将烟草叶片洗净，将烟草叶片左右垫与牛皮纸上用手术刀切取2cm长，2cm宽的无主叶脉、主侧叶脉的长方形叶片块（10片左右），置于加了1-2滴土温的0.1%的升汞溶液中消毒10-15min，期间注意不断摇动，取出叶片置于无菌水中清洗3次，留于最后清洗的无菌水中备用。
1.2.2诱导培养
将烟草叶片取出将叶片周遍切去，再将每片叶切成2片，接入诱导培养基中，每7天观察记录一次。
1.2.3继代培养
待烟草的愈伤组织分化成为烟草的叶片与茎时，从诱导培养基中取出烟草幼苗分成小丛后转接继代培养基中，每7天观察记录一次。
（如果需要分化获得更多的烟草幼苗可以再次接入诱导培养基中培养）。
1.2.4生根培养
从继代培养基中取出烟草幼苗，取其中生长健壮的切下，然后转接入生根培养基中，每7天观察记录一次。
1.2.5培养条件：
培养温度为28（-1、+1）℃，光照强度2000—3000LX，光照时间为12h/d，,每个星期观察一次。
2、实验结果与分析：
1）第一次烟草组织培养时，全部被污染，污染率100%，诱导率为0。
原因可能是，用升汞消毒的时间过短，或者是升汞浓度较低，因此应适当延长消毒时间或适当提高升汞的浓度。
附录1、第一次烟草诱导培养结果统计表
接种瓶数
诱导数
污染数
诱导率
污染率
4
0
4
0
100%
2）第二次烟草组织培养时，在升汞里加了2滴吐温，消毒时间延长至15min,接种了4瓶，其中3瓶被污染，污染率为75%，诱导率为25%。
原因可能是取材的时间不对，致使材料的含菌量比较高，不易脱毒。
附录2、第二次烟草诱导培养结果统计表
接种瓶数
诱导数
污染数
诱导率
污染率
4
1
3
25%
75%
3）第一次继代培养时，把剩下的1瓶烟草分割成了4瓶，诱导率为100%，污染率为0。
附录3、第一次烟草继代培养结果统计表
接种瓶数
诱导数
污染数
诱导率
污染率
4
4
0
100%
0
4）将4瓶继代增殖的烟草转入生根培养基中，7天后都长出了根，平均根长约4cm，生根率为100%。
附录4、烟草生根培养结果统计表
接种瓶数
生根数
污染数
生根率
污染率
平均根数
平均根长度
4
4
0
100%
0
3
4cm
3、实验结果结论：
由实验结果与分析可知，烟草叶片的组织培养污染率比较高，说明取材方法和消毒措施不佳，应采用合理的消毒方法，以降低污染率。
4、注意事项
1）整个实验过程要严格进行无菌操作；
2）倒培养基时要边用玻璃棒搅拌，边倒培养基，防止培养基的浓度不均匀；
3）观察记录时，要注意拿组培瓶的方式，手要握住组培瓶的下方而不要握住组培瓶的盖子；
4）发现污染的外植体，要及时清理干净，以免污染其他的；
5）观察记录时要仔细，认真描述并做好记录。
实验五、柱花草的组织培养
摘要：
柱花草又名热带苜蓿、巴西苜蓿，原产于美洲的热带。
分布于世界热带、亚热带。
柱花草生长快而繁茂，再生性较强，年可刈割2—3次，产草量高，每公顷产鲜草30～60t，而且营养价值较高，栽培也比较容易，可刈割青饲、青贮、调制干草或放牧利用。
因而在我国南方热带和亚热带地区作为饲草有种植推广价值。
此外，国外有报道，柱花草有较强固氮能力，每公顷可固定氮素90—108kg，为很好的绿肥植物。
由于柱花草炭疽病是威胁其推广的主要障碍，而转基因技术在培养抗病植株上有广阔的前景，而转基因成功的关键又依赖于组织培养技术。
本实验利用柱花草的叶片作为外植体，诱导培养基为MS+BA4mg/L+NAA1.0mg/ml，继代培养基为MS+BA0.4+NAA0.1mg/ml，生根培养基为MS+BA0.4+NAA0.1mg/ml。
关键词：
柱花草叶片诱导继代生根培养外植体
1、材料和方法:
1.1材料
1）、柱花草叶片
2）、MS为基本培养基
3）、诱导培养基：
MS+BA4mg/L+NAA1.0mg/ml
4）、继代培养基：
MS+BA4mg/L+NAA0.01mg/ml
5）、芽伸长培养基：
MS+BA0.4+NAA0.1mg/ml
1.2方法
1.2.1外植体消毒方法
将柱花草叶片洗净，然后将叶片放在牛皮纸上，用手术刀切取2cm长的片块（10片左右），置于0.1%的升汞溶液中消毒10-15min，期间注意不断摇动，取出叶片置于无菌水中清洗3次，留于最后清洗的无菌水中备用。
1.2.2诱导培养
将柱花草叶片取出放入超净工作台中无菌的牛皮纸上，然后将叶片两端切去少许，接入诱导培养基中，每7天观察记录一次。
1.2.3继代培养
待柱花草的愈伤组织分化成为柱花草的叶片与茎时，从诱导培养基中取出柱花草幼苗分成小丛后转接继代培养基中，每7天观察记录一次。
1.2.4生根培养
从继代培养基中取出柱花草幼苗，取其中生长健壮的切下，然后转接入生根培养基中，每7天观察记录一次。
1.2.5培养条件：
培养温度为28（-1、+1）℃，光照强度2000—3000LX，光照时间为12h/d，,每个星期观察一次。
2、实验结果与分析：
1）第一次对柱花草进行诱导培养时，污染率75%，诱导率为25%，污染率很高。
原因可能是，用升汞消毒的时间过短，或者是升汞浓度较低，因此应适当延长消毒时间或适当提高升汞的浓度或者尝试别的消毒方法。
附录1、柱花草诱导培养结果统计表
接种瓶数
诱导数
污染数
诱导率
污染率
4
1
3
25%
75%
2）第一次继代培养时，把剩下的1瓶烟草分割成了2瓶，诱导率为100%，污染率为0。
附录2、第一次柱花草继代培养结果统计表
接种瓶数
诱导数
污染数
诱导率
污染率
2
2
0
100%
0
3）第二次继代培养时，把剩下的2瓶烟草分割成了4瓶，诱导率为100%，污染率为0。
附录2、第二次柱花草继代培养结果统计表
接种瓶数
诱导数
污染数
诱导率
污染率
4
4
0
100%
0
5、实验结果结论：
由实验结果与分析可知，柱花草叶片的组织培养污染率比较高，说明取材方法和消毒措施不佳，应采用合理的消毒方法，以降低污染率。
6、注意事项
1）整个实验过程要严格进行无菌操作；
2）倒培养基时要边用玻璃棒搅拌，边倒培养基，防止培养基的浓度不均匀；
3）观察记录时，要注意拿组培瓶的方式，手要握住组培瓶的下方而不要握住组培瓶的盖子；
4）发现污染的外植体，要及时清理干净，以免污染其他的；
5）观察记录时要仔细，认真描述并做好记录。
实验六、木薯的组织培养
摘要：
木薯是耐旱、高产的块根作物，其块根富含淀粉，是节粮型的淀粉资源，在饲料、食品、化工、医药、纺织、造纸等方面。
在我国南亚热带地区，木薯是仅次于水稻、甘薯、甘蔗和玉米的作物。
木薯是用其茎干来进行无性繁殖的，但是往往新品种刚刚出现时，其茎干是非常有限的，因此，对优质品种的迅速推广是非常不利的。
利用组织培养的方法不仅可以保持母树的性状，而且繁殖速度快，有利于品种的推广。
本实验利用木薯的茎段作为外植体，诱导培养基为MS+GA30.02mg/L+NAA0.02mg/L，继代培养基为MS+GA30.02mg/L+NAA0.02mg/L，生根培养基为MS+NAA0.02mg/L。
关键词：
木薯茎段诱导继代生根培养外植体
1、实验材料与方法：
1.1实验材料：
1）、木薯幼枝
2）、以MS为基本培养基
3）、诱导培养基：
MS＋BA0.05mg／L＋NAA0.02mg／L＋GA30.05mg／L
4）、继代培养基：
MS＋BA0.05mg／L＋NAA0.02mg／L＋GA30.05mg／L
5）、生根培养基：
MS＋BA0.05mg／L＋NAA0.02mg／L＋MET4mg／L
1.2方法
1.2.1外植体的消毒方法：
从苗圃剪取幼嫩木薯枝条，剪去叶子，然后以一个芽节为一段（芽节上下端保持1.5cm左右）切下，置于75%的酒精溶液中消毒5s，在置于0.1%升汞溶液中消毒10-15min左右，其间注意不断摇动，取出木薯枝条置于无菌水中清洗3次。
1.2.2诱导培养
将消毒好的木薯枝条取出，置于无菌的牛皮纸上，切去上下端各一小部分后，接入诱导培养基中培养，7天后观察。
1.2.3继代培养
（由于本次实验在诱导时全部被污染，故没有进行继代培养）
1.2.4生根培养
（由于本次实验在诱导时全部被污染，故没有进行生根培养）
1.2.5培养条件：
培养温度为28（-1、+1）℃，光照强度2000—3000LX，光照时间为12h/d，每个星期观察一次。
2、实验结果与分析
总共接种5瓶木
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