发酵工艺学原理讲义及思考题Word格式文档下载.doc
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3.微生物发酵工业又是一个有别于化工过程的一个工业
有以下几个特征：
（1）反应条件温和通常由于微生物的生理特性，要求温度为30℃-40℃pH值中性偏酸性——酵母、霉菌、放线菌等，pH值中性偏碱性——细菌的发酵
（2）无菌发酵整个反应过程要求无菌：
培养基无菌、空气无菌、补料和取样要求无菌操作、某些工程菌，其尾气也要求进行无菌处理。
（3）非连续性生产微生物的生理特性决定了发酵过程的非连续性大部分的工业发酵是以间歇操作为基础进行的，目前可以实现连续化生产的是：
啤酒的连续化生产……
1-2微生物工业发酵的历史及发展方向
一、微生物工业发酵的历史
微生物发酵有着悠久的历史，几千年前的酿造实质上就是一个典型的微生物发酵过程，近几十年的来微生物发酵不但在应用领域上更加广泛，更重要的是建立了许多新的微生物发酵理论体系，诸如：
代谢控制发酵、基因工程菌发酵等……微生物发酵的发展可以分为以下几个阶段：
二、微生物发酵工业的发展方向
微生物发酵工业有着悠久的历史，在国名经济中占有重要的地位，21世纪又是生物的，体现在哪里？
1.从工业领域看
微生物发酵将占据越来越重要的地位，具体的讲：
（1）通过生物工程解决能源问题
能源问题是全球面临的问题，生物工程如何解决？
太阳能 淀粉、纤维素酶工程G发酵乙醇能源
乙烯
（目前已取得突破性进展）
生物工程作为桥梁，2000年世界产值已达50亿美元
（2）取代部分化工工业
许多化工产品的生产由于严重的污染和生产效率问题，而为生物工程取代，例如：
乙醇、甘油、乳酸等
（3）农业：
生物农业、农产品加工等方面（4）医药：
2.从产品角度看，应围绕下列领域：
（1）酶制剂工业：
即是生产工具，又是科学研究的工具和基础
（2）新型抗菌素工业和维生素行业（3）氨基酸及多肽发酵（4）生物免疫物质：
白介素-2、干扰素、抗肿瘤物质等（5）细胞工程及疫苗
3.从科学技术角度看
（1）底物基质的转变以葡萄糖为底物的发酵转变为以更为广泛的基质为原料，特别是以废弃物为基质的发酵，废弃物资源化是其发展方向。
（2）开发新产品利用现代生物技术为基础，开发新产品，新的产品层出不穷，使得微生物发酵向国民经济的各个角落渗透。
（3）微生物发酵向着大型化、自动化、连续化的方向发展。
英国帝国化学公司，甲烷菌发酵罐的容积已达到3000m2
本课程的内容和任务
本课程是生物工程专业本科生的专业基础必修课程，是一门以微生物、生物化学、化工原理等课程为基础，以微生物发酵过程中各种单元操作为主线条，对微生物发酵过程中的基本原理进行阐述的课程。
其基本内容如下：
1.发酵生产用菌种及其有关知识
菌种选育
包括 菌种保藏
生产过程中菌种的扩大培养
2.培养基的制备及灭菌
包括：
工业发酵用原料的选择与处理培养基的灭菌原理和方法工业灭菌的工程计算
3.发酵机制包括：
乙醇、甘油、谷氨酸、柠檬酸、赖氨酸、抗生素等
4.发酵过程及控制
温度的变化及控制pH值的变化及控制
氧传递动力学泡沫的消长规律及控制
思考题：
能源问题是全球面临的问题，生物工程将如何解决？
写出一遍综述。
第二章微生物发酵用菌种及其扩大培养
2-1微生物发酵工业用菌种
一、微生物发酵工业用菌种的特点及要求
微生物发酵工业用菌种因不同的发酵对其要求各异，就是同一种产品的发酵生产，其菌种的特点和要求因不同的原料和生产设备的不同也有很大差异，例如：
GA的发酵：
以淀粉质为原料：
要求VH-,
以糖蜜为原料：
因为糖蜜本身含有非常丰富的VH……
但是作为工业微生物发酵使用的菌种，通常有下列特点：
1.具有稳定的遗传学特性
这对于工业化生产是很重要的，通常工业化生产整个周期很长，在一个发周期中，菌体至少应该增殖一次，在增殖过程中，菌体应该保证原菌的遗传学特征，（尽管菌体生长的环境改变了，压力、基质、溶氧等）
2.微生物生长和产物的合成对于基质没有严格的要求
换言之，可以广泛的使用各种原料作为生产用的底物，某些微生物对于底物有着严格的要求，对于碳源要求单一，这对于微生物的发酵工业提出了严格的要求，增加了生产成本。
3.生长条件易于满足
在微生物的工业化生产过程中，某些环境条件很难实现。
氧的传递和供给就是一个很难完全满足的条件，特别是对于高粘度、高浓度的发酵体系。
对于微生物的生长往往存在一个“临界溶氧浓度”，低于这个溶氧浓度，氧就成了微生物生长的限制性因子，这个溶氧浓度越高，说明菌体生长条件越易满足，从另一种意义上讲，工业化的生产成本就越低。
pH值:
中性偏酸性，偏碱性，强烈的pH值易改变产物和底物的状态。
4.对于细菌，希望具有抗Phage的能力。
5.具有较高的各种酶活力，可以在一定的范围内提高生长速率和反应速度，进而可以缩短发酵周期，降低生产成本。
6.对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细胞不易发生菌体自溶。
对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎；
对于基因工程菌，通常目的产物存在于包含体内，对于包含体，要求在细胞破碎是不易破碎，而在目的产物的分离提出时，则易破碎。
二 微生物发酵工业用菌种的种类
野生型
从菌种的遗传学特征上可以把菌种分为：
培养：
营养缺陷型……
从微生物分类学的角度，分为
1.细菌类：
短杆菌：
GA,Gln,lys……
枯草芽孢杆菌：
淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等
地衣芽孢杆菌：
HASS（耐高温α-淀粉酶）α-Amylase
苏云金芽孢杆菌：
BT生物农药……
梭状芽孢杆菌：
丙酮、丁酸等的发酵
2.酵母菌啤酒酵母：
酿酒酵母、辅酶类物质的发酵
酒精酵母：
汉逊酵母：
食品工业，用于乙酸乙酯的发酵
假丝酵母：
scp生产，石油发酵
3.霉菌黑曲霉：
柠檬酸工业、酿酒业（UV-11,UV-48）、酶制剂工业（糖化酶）
黄曲霉：
酱油生产（3042），面酱
青霉菌：
青霉素的生产
红曲霉：
红曲制造，用于南方红曲酒（女儿红）的生产；
使用红色色
素的生产；
豆腐乳的生产等
赤霉菌：
赤霉素的生产，是一种植物生长激素
4.放线菌：
各种抗生素，链、土、庆大等
2-2微生物用菌种的扩大培养
一、菌种扩大培养的目的
1.提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种。
目的就是：
a、缩短发酵周期
降低能耗、减少染菌的机会（空气过滤设备有效时间是有限的）
b、为了使培养菌在数量上取得绝对的优势，抑制杂菌的生长。
从对数残留定律上看，任何灭菌过程都不能够做到绝对无菌，抑制杂菌生长除了严格环境以外，在数量上让培养菌占绝对优势也是一种方法，往往是一种行之有效的方法。
例如：
啤酒的发酵……
2.让菌种从固试管、液体试管……，逐步适应，例如：
啤酒发酵
3.菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率，减少“倒罐现象。
许多生产菌种往往都是“溶原性”的？
通过连续的扩大培养，每一级都要进行严格的检查，对于不合格的严禁使用，无疑增加了生产的可靠性。
二、扩大培养的方法
通常有两种方法：
固体法：
用于酿造业（酱油、白酒等），也是源于酿造业，有霉菌的纯培养，也有混合培养如：
大曲
液体法：
液体深层培养，适合于众多发酵行业
1.液体扩培流程
固体试管三角瓶大三角瓶一级种子二级种子
三级种子
发酵罐
2.固体扩培流程
固体试管三角瓶种曲麸曲（机械通风制曲）
两者的优缺点比较：
固体培养
（1）酶活力高。
（因为菌丝体密度大）
（2）生产过程中无菌程度要求不是很严格。
（3）对于固体培养，通常用于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以有效的降低产品分离成本。
缺点：
（1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自动化生产。
（2）周期长。
（3）培养过程中环境条件控制较难。
（4）生产过程中，由于无菌程度较低，其菌种菌类不纯。
液体培养
（1）生产效率高，便于自动化管理。
（2）生产过程中温度、溶氧、pH值等参数可以实现全面控制。
（3）通常生产液体种子，整个生产周期较短。
（1）无菌程度要求高，相对生产设备投资较大。
（2）对于某些种类的发酵，液体培养因投资大、生产密度大而难以实现。
现代生物技术的发展是以基因工程菌为主导的微生物发酵领域，其菌种的培养要求无菌程度高，而且培养过程中的条件要求也非常严格（否则易发生变异导致质粒丢失），从这种意义上讲，固体菌种的制备是难以实现的，因此，应以液体培养为主导方式。
应该指出的是：
随着生物工程与技术的发展，许多传统的应用微生物工业的菌种已形成了产业化。
酒精的生产
原生产工艺流程为：
……
其中以酵母为线条的生产工艺为：
以霉菌为线条的生产工艺为：
现在：
（1）酵母使用粉末酵母鲜压榨酵母固定化酵母细胞
（2）霉菌则由各种液化、糖化酶取代
三、菌种扩大培养的条件：
菌种扩大培养条件因不同的菌种差异是非常大的，通常是与菌种的性质有关的，也与后续的发酵工艺有关。
但是，与发酵工艺却有着很大的差别。
1.培养基：
种子培养基因不同的微生物种类差别是很大的，同一种微生物因不同的扩大培养过程（一级、二级）其培养基往往也有较大差异。
啤酒酵母扩大培养用的培养基组成如下：
固体试管液体试管三角瓶大三角
（无酒花）（有酒花）（有酒花）
汉逊罐
通常，对于种子用的培养基，摇瓶与种子罐用的培养基也不相同，摇瓶要求培养基用的原材料精细，碳源浓度较低而且是用微生物较易利用的碳源；
对于种子罐用培养基，要求使用接近大生产用的原材料，氮源浓度较高，有利于菌体的增殖。
HASS（高温淀粉酶）
三角瓶用碳源：
葡萄糖+乳糖
3m3种子罐：
液化淀粉
2.温度
种子扩大培养的温度，从试管到三角瓶到种子罐，其温度也应逐步调整，最后接近大生产的温度，目的在于使菌种逐渐适应。
例如：
啤酒酵母扩大培养
固体液体三角瓶大三角瓶汉逊罐
28℃25℃20℃15℃10-15℃
需要指出的是：
（1）许多微生物其最适生长温度与最适发酵温度往往有差异的，例如：
谷氨酸发酵，谷氨酸产生菌的最适合生长温度为：
30℃，而产物合成温度为32-34℃
（2）种子扩大培养的温度的选择，应该考虑的是菌体的快速增殖上，一方面可以缩短周期，另一方面有利于抑制其他杂菌的生长。
3.氧的供给
菌种扩大培养的目的就是提供大量的强壮的菌体，因此在扩培过程要求菌体增殖速度越快越好，增殖期消耗的底物葡萄糖越少越好，从这个意义上讲，扩培过程中应提供足够的氧气，无论是厌氧发酵还是好氧发酵。
足够的溶氧取决于：
搅拌转速、通气量、搅拌轴功率等，后述。
4.pH值
菌种扩大培养的pH值很重要，直接影响到菌体的正常生长，需要注意以下两点：
（1）扩培选择的pH值是菌体的最适生长pH值，往往与发酵最适pH值不同。
（2）培养基灭菌后，通常其pH值要下降0.5——1.0个单位，因此，……
（三角瓶灭菌后，不能够调整pH值，不宜无菌操作）
1.比较固体培养与液体培养的优缺点。
2.说明菌种扩大培养的条件。
3.菌种扩大培养的目的和意义是什么？
4.工业生产用菌种的基本要求有什么？
第三章微生物用培养基及灭菌
本章的主要内容：
1.培养基的制备2.starch的水解3.培养基的灭菌
§
3-1培养基的制备及要求
一、培养基用原材料及要求
微生物发酵领域其本质，也可以理解为物质形式的转化过程，就是利用微生物生长所需的底物转化成特定的产物，在这个过程中，有两个问题是工业化需要解决的：
（1）产物的社会效益，
（2）物质转变过程中产生的经济效益，即：
低价值的原材料、低能耗等
对于特定的已知产物，在选择培养基原料时，则应注意以下几个原则：
1、培养基原材料的要求
（1）价格低廉，易得到（价格低，但不一定易得到，例如：
地瓜干）
（2）对微生物的生长繁殖和代谢无抑制作用的物质
（3）微生物的代谢产物无有害物质。
2、培养基用原材料的种类
碳源starch及其水解糖液
含有starch及其水解产物的废弃物：
味精废水、粉丝生产废水等
化工石油产品：
醋酸、甲醇、乙醇、甲烷等
氨水、尿素（有脲酶的微生物），以流加形式使用
（NH4）2SO4、NH4NO3、NH4CL等
氮源豆粕、玉米浆、酵母粉、酵母浸出物、鱼粉、
菌体蛋白？
、玉米蛋白粉等
二、培养基的种类固体发酵
生产培养基厌氧发酵
需氧发酵
按用途可分为：
种子培养基
摇瓶培养基（优化工艺……）
检查培养基：
HASS发酵用的检查培养基：
营养琼脂0.5%—0.55%、Sarch2%，Glucose0.5%
平板培养，根据透明圈的大小
本章涉及到的培养基为：
生产使用的培养基
三、培养基的制备
1.培养基配制的原则
培养基制备是发酵成功与否的第一个要点，制备一个完整而科学的培养基是很重要的，也是非常艰巨的任务。
通常制备培养基需要考虑以下几个方面的问题：
（1）合适的C/N，
不同的微生物、同一种微生物不同的菌株，其对培养基中的C/N要求是不一样的，同一菌株在不同的发酵阶段，其对C/N的要求也不一样。
例如：
黄源胶（XanthanGum发酵）：
前期，较低的C/N，目的是强化菌体的生长和增殖：
但是，在黄源胶的生物合成期，则需要较高的C/N，假如在这一时期，培养基中氮源仍然很高，其导致的发酵结果是，底物消耗了但产物的产率却很低。
在大多数情况下，C/N要求在0.2——2.0。
对于一些特殊的情况，例如谷氨酸发酵，在谷氨酸生物合成期，则要求C/N为：
100/15-21。
（2）在确定了C/N的前提下，需要研究的是不同的氮源，对发酵的影响。
虽然C/N确定，但是氮源的利用其本质就是：
pr肽AA,通过AA而被利用，不同的氮源，其AA的组成与比例也不相同，对其发酵结果的影响也不相同。
有人在HASS（高温淀粉酶）的发酵过程中，向培养基中添加某些AA（亮，异亮）则有利于高温淀粉酶的合成基因的表达，发酵液中的酶活力则明显得到提高。
（3）大多数的工业培养基都使用玉米浆。
玉米浆内含有VH，它是菌体生长和代谢的所必需的一种辅酶，通常玉米浆与：
a.菌体的增殖速度有关
b.与菌体细胞膜的合成有关，从而影响到细胞膜的通透性
c.对于某些菌体，与代谢途径和代谢机制有关。
（4）生长因子：
大多数菌体的生长因子如下：
a.维生素：
大多数维生素是微生物生长的辅酶，需要量很小，1—50µ
g/L。
b.AA，凡是微生物自身不能合成的AA则必须以游离的AA或者小分子的肽提供，通常，以小分子的肽提供，微生物更易通过细胞膜进入菌体内部?
，如果提供外援氨基酸，需要注意的是各种氨基酸的平衡。
c.嘌呤及其衍生物
2.培养基的优化方法
一种合成培养基的设计，需要考虑的因素是很多的，需要研究的成分也是很复杂的，其中包括碳源、氮源、玉米浆等，即便是碳源还可以是几种碳源的混合体，再加上述几种因素之间的相互影响，要确定一个科学的培养基配方是需要做大量的工作的，采用一个合理的数学方法，就可以在减少工作量的前提下，得到科学的结果。
介绍一种数学方法：
均匀实验设计方法——旋转正交实验方法.这是在正交实验的基础上发展起来的一种对于多因素、多水平的一种实验设计方法。
参考文献：
方开泰:
均匀正交实验方法雄宗贵:
发酵工艺学原理
3-2培养基用材料及处理
一、淀粉的水解
许多微生物由于其本身的生理生化特性而决定了其代谢所需的底物只能使Glucose等单糖，主要有下列菌种：
酵母：
G、F、蔗糖、半乳糖、以及部分麦芽糖等
大部分的细菌：
GA产生菌、Lys产生菌、苏云金芽孢杆菌等
其中：
地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌则可以以淀粉为原料。
霉菌：
大部分的霉菌可以直接使用淀粉为原料，他们本身具有淀粉的水解能力。
淀粉的水解方法主要有酸法、酶法以及介于这两者之间的酸酶法、酶酸法，分别介绍如下：
1.淀粉的水解方法
（1）淀粉的酸法水解
水解原理：
淀粉是由葡萄糖通过α-1，4或α-1，6葡萄糖苷健连接而成的含有多个葡萄糖的大分子长链物质，根据其葡萄糖连接的糖苷健的不同，可分为枝链淀粉和直练淀粉，可以使用重合度来表示淀粉分子的大小，所含有的葡萄糖苷健的数量，称之为淀粉的重合度，用DP来表示。
淀粉内部的葡萄糖苷健在一定的温度和酸性的条件下可以水解，而使淀粉分子链断裂，高温可加速葡萄糖苷健的水解速度。
水解条件：
高温，120℃以上，H+,0.2MPa的压力
缺点：
反应条件比较强烈，产生的副产物较多.
主要有下列副产物：
a.双分子葡萄糖脱水，形成复合二糖，分别是异麦芽糖、龙胆二糖，
前者不利于产物的结晶提出，后者对于菌体的生长有抑制作用。
b.一分子葡萄糖脱水，形成5-羟甲基糠醛，对于菌体的生长有抑制作用。
c.一分子葡萄糖和—NH2反应，形成氨糖，是淀粉水解糖液有色物质的主要来源。
（美拉得反应）
2.酸酶法
3.酶酸法
4.双酶法：
使用两种淀粉水解酶：
α-淀粉酶
淀粉α-1，4；
1，6葡萄糖苷酶。
α-淀粉酶：
又称为淀粉液化酶，只作用于淀粉α-1，4葡萄糖苷健，其作用特点是可以快速将长链的淀粉水解成短链糊精，液化的含义？
其水解速度随着淀粉链长度的降低而变得越来越慢，换言之，该酶不可能将淀粉完全水解成葡萄糖（从水解葡萄糖苷健的种类，水解速度到最后已无工业意义三个方面），因此该酶的淀粉水解产物中以短链的糊精为主，含有少量的葡萄糖。
1，6葡萄糖苷酶，又称为糖化酶，可以水解淀粉分子的α-1，4；
或α-1，6葡萄糖苷健，其作用特点是，淀粉的分子链越短水解速度越快，水解产物为葡萄糖。
酸法与双酶法的优缺点比较：
（1）酶促反应条件温和，水解产生的副产物少，对微生物的生长有利。
有的人会问？
目前采用的耐高温α-淀粉酶的作用温度也是较高，突破100℃，和酸法水解的温度相差不多。
双酶法淀粉水解首先使用耐高α-淀粉酶进行淀粉的液化，此时水解液中的葡萄糖很少，不具备生成副产物的物质条件。
（2）正因为上述原因，淀粉水解产率较高，通常糖的转化率可以提高10%以上。
这可以给味精、制药的领域带来巨大的经济效益。
对于年产10000吨的小型味精厂，年增产100吨味精，直接经济效益可达到：
0.8*100=80万元。
（3）可以直接使用粮食进行双酶法水解，因为双酶法水解的条件温和，对于粮食中的蛋白质等其他物
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