PCR自测题Word格式.docx
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C.
PCR反应常用的缓冲液为10－50mmol/L的Tris-HCl（室温PH8.3－8.8）
D.
10mmol/L的KCl能促进引物的退火
E.
加入的BSA有利于破坏模板的二级结构
F.
二甲基亚砜有利于保护TaqDNA酶的活性。
E.Mg2+能降低TaqDNA聚合酶的活性。
5.TaqDNA聚合酶活性需要以下哪种离子（c）
A．K+B.Na+C.Mg2+D.Ca2+E.Cl-
6．适用于DNA序列中单个碱基突变的检测的方法是：
（d）
A．筑巢PCRB.多重PCRC.锚定PCRD.LCR
7．以下哪种PCR技术广泛应用于组织胚胎学和肿瘤学的研究（a）
A．原位PCRB．差异显示PCRC．不对称PCRD．反向PCR
8.已知一段设计好的引物的序列为GTGGATCCATGGCTCCTCTGAAGATTC,其Tm值为（）
A.78B.80C.82D.84E.无法计算
9．以下哪种PCR技术可以克服序列未能全知的障碍而获取目的扩增片段（c）
A.共享引物PCRB不对称PCRC锚定PCRD.筑巢PCR
10．一位疑似杜氏肌营养不良症的患者，可以采用以下哪种方法协助诊断（）
A.原位PCRB.多重PCRC.不对称PCR.D.锚定PCR
11．以下关于dNTP的说法错误的是（e）
B.
dNTP具有较强的酸性，使用时应将pH调至7.0-7.5
PCR反应中，四种dNTP必须按比例配制，以减少反应的错配率。
dNTP的浓度过高会增加碱基的错配率
dNTP的浓度低，反应速度下降，但特异性提高
12.TaqDNA聚合酶可以不要模板在dsDNA的末端加上一个（）碱基.
A.dGTPB.dCTPC.dATPD.dTTP
13.有关PCR的描述哪个不对（d）
A.是一种酶促反应
B.引物决定扩增的特异性
C.扩增的对象是DNA序列
A）
D.扩增的对象是氨基酸序列
14.催化PCR的酶是（c）
RNA聚合酶
DNA聚合酶
TaqDNA聚合酶
反转录酶
15.PCR产物具有特异性是因为（c）
TaqDNA酶保证了产物的特异性
合适的变性,退火,延伸温度
选择特异性的引物
引物的Tm值不同.
16．LCR的说法正确的是（）
体系中采用DNA聚合酶
须设计一对引物
反应需经过变性,复性,连接
LCR中,酶将dNTP加到引物的3-OH端
LCR具有高度敏感性
三、多项选择题
1．下列关于退火温度说法正确的是（）
A.合适的退火温度应低于引物Tm值5℃左右。
B.引物与模板的退火温度一般在45－55℃之间
C.在Tm值允许的范围内，选择偏低的退火温度可以提高PCR反应的特异性。
D.退火时间至少需要一分钟。
2．进行PCR实验时以下措施有助于防止污染和结果的假阳性（）
隔离不同的操作区
分装试剂，减少重复取样所致的污染
严格实验操作
设立实验对照
3．适用于扩增3‘或5‘端未知序列的PCR技术是（）
A．反向PCRB.锚定PCRC.多重PCRD.不对称PCR
4．以下关于PCR技术应用说法正确的是（）
筑巢PCR和共享引物PCR有利于增强PCR反应的特异性，适用于模板含量极少的样品的检测
不对称PCR可以大量制备单链DNA，可用于DNA的序列测定
彩色PCR适用于基因诊断和自动化DNA序列测定
定量PCR可用于基因表达和调控的研究
F
差异显示PCR可用于筛选和克隆受发育，突变等各种因素影响下差异表达的基因
5.关于引物设计说法正确的是（）
为保证PCR反应的特异性，所设计的引物长度一般>
30个核苷酸
引物设计时G＋C含量在引物中一般为45～55﹪
按经验，引物自身存在的连续互补序列一般不超过3个碱基
两个引物之间不应存在互补序列，尤其避免3‘端的互补重叠
引物的3‘端可以游离而不影响PCR反应的进行
6.以下关于PCR的说法正确的是（）
PCR的模板可以是DNA也可以是RNA
PCR的模板必须从组织细胞中分离出来
PCR反应的特异性取决于引物和模板DNA的结合位点。
PCR反应初期，目的DNA片断的增加呈指数扩增。
PCR反应一般需要含102－105拷贝的模板
7．以下关于PCR反应条件错误的是（）
PCR缓冲液中加入二甲基亚砜有利于破坏模板的二级结构，提高反应的特异性。
Mg浓度过高会降低TaqDNA酶的活性，Mg浓度过低又会使酶催化非特异性扩增增强。
4种dNTP应以等摩尔浓度配制，以减少错配误差。
引物浓度一般为0.5-1umol/L
8.PCR反应时应设立哪种对照（）
A.阴性对照
B.阳性对照
C.试剂对照
D.以上答案都正确
9.逆转录反应体系包括（）
RNA模板，四种dNTP
RNA酶抑制剂
合适的缓冲液体系
逆转录酶
寡聚胸腺嘧啶核苷酸引物
10.有关PCR的模板说法正确的是（）
模板可以是DNA也可以是RNA
大多数PCR反应中对DNA模板纯度要求不高
模板用量低
标本处理的基本要求是除去杂质
11.以下有关RT-PCR反应的说法你认为正确的有（）
反应体系一般有20μl
反应体系中有缓冲液,四种dNTP,MgCl2,DTT,牛血清白蛋白,Oligo（dT）引物RNA模板和逆转录酶
逆转录于42℃进行,随后即进行PCR
RT-PCR的最终反应过程依然是以DNA为模板的PCR反应
12.PCR的产物累积的特征是（）
反应初期,目的DNA片断呈指数扩增
PCR进行到一定时间出现反应中的停滞效应
到达平台期的的PCR循环数取决于反应体系中酶的耗竭程度
PCR平台期的出现多数不可避免
到达平台期时若扩增目的DNA片断不足,可继续加入模板,酶和缓冲液进行PCR反应
13.有关Mg2+在PCR中的作用说法不正确的是（）
TaqDNA酶的活性维持需要Mg2+
TaqDNA酶的活性与反应体系中的Mg2+总浓度有关
Mg2+过低,酶催化非特异性扩增增加
Mg2+过高会降低酶的活性
总量应低于dNTP的量,常用1.5mmol/L
14.PCR中使用的底物dNTP应该是（）
使用前应将pH值调至7.0-7.5
dNTP浓度高可以加快反应速度,但却增加了出错率
降低反应速度可以提高反应特异性
PCR中,4种dNTP必须按一定比例配制
Mg2+会与dNTP结合,应注意二者浓度之间的关系
15.TaqDNA酶的特点是（）
75-80℃时具有最高的聚合酶活性
活性的维持需要Mg2+的参与
TaqDNA酶和klenow片断一样具有校正功能
TaqDNA酶的忠实性很高
具有类似末端转移酶的活性
16.有关引物的说法正确的是（）
引物浓度一般为0.1-1.5μmol/L
引物与模板的的比至少为108:
1
引物浓度过高会引起错配和非特异扩增,降低扩增效率
引物Tm值位于55-80℃较理想
17.PCR反应温度应该是（）
为使DNA变性完全,变性温度越高,时间越长越好
按模板DNA的复杂程度来调整变性温度和变性时间
于反应管中加入1-2d石蜡油防止反应液的蒸发
温度越高时间越长,dNTP破坏增加,对PCR反应产生不利影响
18.有关退火温度正确的是（）
引物与模板退火温度一般在45-55℃
退火温度过低,使非特异扩增增加
退火温度过高,PCR扩增含量下降
退火时间一般为1-2分钟
Tm值的允许范围内,应该选择较低的退火温度
19.延伸温度应有如下特点（）
一般为72℃
PCR延伸时间越长,产物的得率越高
TaqDNA酶在延伸温度时有较高的酶活性
PCR延伸时间根据待扩增片断的长度而定
20.PCR循环次数设定时应注意（）
应由最初靶分子浓度而定
理论上20-25个循环后,PCR产物累积达最大值
PCR的循环次数一般为25-30次
循环次数过多时会引起停滞效应
21.PCR样品制备时应注意（）
应有专门的区域制备模板
提取DNA样品和RNA样品时要带手套且经常更换
纯化样品对污染有极大的影响
普通分子克隆工具不能用做样品的处理和靶序列
提取核酸所用的试剂要求新鲜配制或者适当储存未经使用的试剂.
22.操作中应该注意（）
使用的溶液应该没有核酸,核酸酶
试剂水都是高质新鲜蒸馏水
工具（枪头,试管）都是一次性并且高压灭菌
应有专门的操作区
试剂应该分装保存
23.PCR反应总为阴性时应该（）
增加TaqDNA酶的浓度
增加靶DNA的量
增加扩增循环或者降低退火温度
提纯样品
取10μl扩增液再行PCR
24.PCR反应出现非特异产物时,应该采取的措施是（）
增加退火温度
降低TaqDNA酶浓度
减少退火及延伸时间
减少引物浓度
减少扩增循环次数
25.PCR可以广泛应用于（）
遗传性疾病的基因诊断
检测癌基因
检测病原微生物
法医鉴定
DNA序列测定
26.对RNA的体外扩增过程,描述正确的是（）
分为循环相和非循环相
也具有变性,复性,延伸三步
反应体系中含有dNTP和NTP两种类型的核苷酸
反应中含有两种特异性引物
待测RNA作为模板进入循环相
27.RNA-PCR技术的特点为（）
扩增效率高
扩增时间短
特异性不强
需严防DNA的污染
28.下列说法错误的是（）
RNA-PCR中,非循环反应与循环反应不处在同一反应体系
RNA-PCR中,扩增产物以2的指数递增
反应温度一般为37-42℃,时间一般为30分钟到1小时
RNA-PCR需采用25个循环达到需要量
G.
依赖于逆转录酶,RnaseH和T7RNA聚合酶共同作用
29.利用PCR技术测序有下列哪几种方法（）
双链直接测序
基因扩增转录测序
不对称PCR产生单链测序
双链克隆后测序
四、填空题
1.PCR反应体系含有，，，。
2.PCR反应的基本过程为,,
3.引物与模板的退火温度一般为，延伸温度一般为
4.PCR循环次数一般设定为，过多的循环次数会导致的出现。
5.，，可用于LCR产物的检测。
6.引物3‘端最佳碱基选择是和。
7.PCR的标本处理的基本要求是
8.PCR的反应体系一般选用。
9.PCR反应的缓冲液提供了PCR反应与常用的为
10.PCR的反应体系中，Mg2＋的浓度一般保持在,常用的是
11.TaqDNA聚合酶具有，缺乏因此无。
12.在变性过程中，为防止反应液的蒸发，可在反应管中加入
13.PCR反应时应设立以下实验对照：
,.
14.
定量PCR必须设立
五、简答题
1、简述PCR反应的基本步骤。
2、简述PCR模板的种类及制备方法。
3、简述PCR产物的积累规律。
4、简述PCR的基本反应。
5、简述PCR实验应注意的事项。
6、简述连接酶链反应的基本原理。
7、简述RNA体外扩增的特点。
六、论述题
1、试述PCR的基本原理及引物设计原则。
2、试述PCR技术的特点。
3、试述PCR反应条件的优化。
4、试述PCR的主要类型及其工作原理。
参考答案及题解
1、PCR:
即聚合酶链式反应。
在模板，引物，4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异性地扩增位于两段已知序列之间的DNA区段地酶促合成反应。
2、变性：
于PCR反应体系中，通过加热使温度至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应模板。
3、退火：
PCR反应中，经变性后将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA模板互补区域结合，形成杂交链的过程。
4、延伸：
当反应体系温度升至70℃左右时，TaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的5‘→3’延伸反应，形成新生DNA链。
5、逆转录PCR：
以mRNA为原始模板进行的PCR反应。
6、停滞效应：
PCR中后期，随着目的DNA扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。
7、共享引物PCR：
利用3条引物扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物与两种待扩增序列都互补，它与另两条引物分别组成两对PCR引物，此种PCR常用于细菌学鉴定，确定同一种属细菌的不同种类。
8、多重PCR：
在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中不同序列的PCR过程。
9、反向PCR：
利用连接酶将一段未知序列两端连接成环状，利用单一限制酶原点切开已知序列，据已知序列的碱基顺序设计3‘端和5’端引物扩增未知序列。
10、原位PCR：
以组织固定处理细胞内的DNA或者RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程，不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA。
11、LCR：
连接酶链反应，又称连接酶扩增反应，是以DNA连接酶将某一DNA链的5‘磷酸与另一相邻链的3’羟基连接为基础的循环反应,特点是能准确分析基因序列中的单个碱基突变。
1、BPCR的引物设计长度一般为15～30个核苷酸，过短影响PCR特异性而过长却会提高相应的退火温度，并使延伸温度>
TaqDNA聚合酶的最适温度，影响产物的生成
2、C含量过低，反应的特异性不高。
但是含量太高又会使引物的Tm值升高，不利于PCR反应的进行
3、D引物的3‘端碱基是延伸的起点，必须与模板严格配对结合，但是5‘端的的碱基可以游离，而不影响引导新生DNA链合成
4、A
5、CTaqDNA聚合酶活性与反应体系中的游离Mg2+浓度相关
6、DLCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5‘磷酸与另一相邻链的3’羟基连接为基础的循环反应,特点是能准确分析基因序列中的单个碱基突变
7、A原位PCR不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA,经扩增后，大部分产物留在细胞内，再可以结合原位杂交或者PCR标记引物的显色技术而广泛应用于组织胚胎学和肿瘤学的研究
8、CTm＝4（G+C）＋2（A+T）
9、BTaqDNA聚合酶缺乏3’→5’外切酶活性，因而没有校正功能
10、C锚定PCR首先通过分离细胞的总RNA或mRNA，逆转录生成cDNA，后在cDNA3’末段加上poly尾。
再通过poly锚定引物和与cDNA特异配对的引物共同进行PCR扩增
11、B多重PCR可以扩增一份DNA样品中的不同序列，因此可以检测是否存在某些基因片段的缺失和突变。
12、BPCR反应中，四种dNTP必须等摩尔浓度配制，以减少反应的错配率并提高使用效率。
13、CTaqDNA聚合酶具有末端转移酶的功能,能催化dNTP加到DNA的3-OH端,但对dNTP的聚合能力不同,对dATP的聚合能力高于其他三种核苷酸,故而PCR的产物末端总是带有两个A.
14、DPCR扩增位于两个特异性引物之间的DNA片断,扩增的特异性由引物特异性来决定.PCR反应本身符合酶促反应动力学,是一种酶促反应
15、CTaqDNA聚合酶具有良好的热稳定性,广泛应用于PCR反应.
16、CPCR反应的特异性由引物的特异性决定,它特异地扩增位于两个引物间的DNA片断.
17、CLCR需要设计两对引物,,采用DNA连接酶,将某一DNA链的5磷酸与另一链的3羟基连接.它并不具有PCR的高度敏感性.
1.AB在Tm值允许的范围内，选择偏高的退火温度可以减少引物和模板的非特异性结合，提高PCR反应的特异性；
退火时间一般选择30秒－1分钟，足以使引物和模板结合完全
2.ABCD隔离不同的操作区,分装试剂，减少重复取样所致的误差,严格实验操作污染,设立实验对照
3.AB
4.ABCDE
5.BCDAPCR的引物设计长度一般为15～30个核苷酸，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度>
TaqDNA聚合酶的最适温度，影响产物的生成。
引物的3‘端碱基是延伸的起点，必须与模板严格配对结合
6.ACDE原位PCR无需从组织细胞中分离模板
7.B
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