细说脂多糖诱导血管内皮细胞的影响Word格式文档下载.docx

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二甲基亚砜、NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（ammoniumpyrrolidinedithiocarbamate，PDTC）、LPS和NO检测试剂盒均购于美国Sigma-Aldrich公司。

TMS购于美国Biomol公司。

ICAM-1、NF-κBp65、IκBα兔单克隆抗体购于英国Abcam公司，TRIzoL试剂购于美国Invitrogen公司。

逆转录试剂盒和SYBRGreen荧光定量试剂盒购于北京天根生化科技有限公司，Real-timePCR引物由TaKa-Ra公司设计合成。

RIPA、PMSF、BCA-100蛋白定量试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司，核蛋白提取试剂盒购于上海贝博生物有限公司，TritonX-100购于美国Amresco公司，辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）、FITC标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术公司。

数控层析冷柜SL-III（上海新诺公司）;

荧光分光光度计（天津拓普公司）;

EC250电泳仪（美国EC公司），细胞超声粉碎仪VCX105（美国BIO-RAD公司）。

全自动凝胶成像分析系统（美国Syngene公司）;

倒置相差显微镜、荧光倒置显微镜IX70（日本Olympus公司）等。

　　　方法

　　　CCK-8法检测TMS对HUVEs的细胞毒性　将HUVEs以1×

104/孔接种于96孔板中，当细胞融合度达到60%时进行TMS的干预（终浓度分别为0、5、10、20、50、100μmol/L），每组设12个复孔。

分别于第1、4、8、12、24、48h后根据试剂盒说明书行CCK-8检测，计算细胞存活率，实验重复3次，取其均值，绘制细胞存活率曲线。

　　　细胞处理及实验分组　细胞经复苏后生长融合度达培养板/孔85%时，应用%胰蛋白酶和%EDTA混合消化液消化，1∶3比例传代，以1×

105个/mL的密度接种于6孔板或1×

106个/mL接种于25cm2细胞培养瓶中培养，P3～P6代细胞进行后续实验。

细胞分为以下6组：

①正常对照组（CON组）：

以HamsF-12培养基培养细胞12h;

②LPS组：

HUVEs与终浓度为μg/mL的LPS共孵育12h;

③TMS+LPS组：

以终浓度为5、10、20μmol/L（分别定义为低、中、高浓度TMS+LPS组）的TMS预处理细胞4h后，再与终浓度为μg/mL的LPS共孵育8h;

④PDTC+LPS组：

以终浓度为10μmol/L的PDTC预处理细胞4h后，再与终浓度为μg/mL的LPS共孵育8h。

细胞置于37℃的5%CO2培养箱中孵育。

　　　Griess法检测细胞产生的NO浓度　以细胞培养上清液中NO2-含量间接反映细胞产生的NO水平变化，收集各组干预后的细胞上清液，于4℃、5000rpm离心5min后取上清液。

按照试剂盒说明书进行药品配制并检测，实验重复3次，取均值。

　　　Real-timePCR检测各组的ICAM-1、NF-κBp65mRNA表达　细胞总RNA的提取按照Invitro-gen公司的TRIzolReagent使用说明书进行操作，然后进行总RNA的纯度测定和质量检测，制备反转录cDNA按照TaKaRa公司PrimeScriptRTreagentKitWithgDNAEraser说明书操作进行。

利用Eppen-dorf公司的Realplex实时定量PCR仪进行分析，GAPDH作内参对每个基因进行标准化，每个样品同一个基因重复3次。

反应完成后，计算目的基因的相对表达量，用2-△△Ct表示。

　　　Westernblotting检测各组的ICAM-1、NF-κBp65、IκBα蛋白表达　胞浆/胞核蛋白提取按照核蛋白提取试剂盒说明书操作，采用BCA法进行蛋白定量，将蛋白样品在Gel凝胶中电泳，电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后，分别加入ICAM-1（1∶1000）、IκBα（1∶1000）、NF-κBp65（1∶1000）一抗过夜;

TBST洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶3000）室温孵育2h。

ECL法显色，GIS凝胶图像系统分析，每个样本重复3次，计算各个样本积分光密度（条带强度×

条带面积），分别与β-actin（胞质）、Histone（胞核）为内参做对照的比值（相对IOD值），以表示目的蛋白的相对表达量，从而反映各目的蛋白水平的变化。

　　　免疫细胞化学染色检测各组的ICAM-1和NF-κBp65蛋白表达　各组细胞经LPS、TMS及PDTC处理后（其中LPS预处理1h后检测NF-κBp65蛋白），应用一抗ICAM-1（1∶200）、NF-κBp65（1∶100））进行目的蛋白检测，从而反映出各组阳性细胞表达情况。

　　　统计学处理

　　利用统计软件，数据均以珋x±

s表示，TMS对细胞存活率的影响采用二因素析因设计方差分析，若同一因素多个水平总体有统计学差异，以SNK法行两两比较;

NO表达及ICAM-1、NF-κBp65、IκBα表达采用单因素方差分析，若组间总体差异有统计学意义，以SLD-t检验行两两比较。

P<

为差异有统计学意义。

　　2　结　果

　　　不同浓度TMS对HUVEs存活率的影响

　　TMS浓度对细胞存活率有影响（F=，P=），干预时间对细胞存活率亦有影响（F=，P=），且二者之间存在交互作用（F=，P=）。

与0μmol/L相比，其他各浓度TMS细胞存活率差异均有统计学意义（P<

），其中5、10μmol/L浓度与50、100μmol/L浓度中细胞存活率差异有统计学意义（P<

）;

20μmol/L__浓度与其他各浓度细胞存活率差异有统计学意义（P<

）。

　　　各组NO表达结果

　　与CON组相比，其他各组NO表达量增加（P<

与LPS组相比，低、中、高浓度TMS+LPS组和PDTC+LPS组的NO表达量降低（P<

与低浓度TMS+LPS组相比，中、高浓度TMS+LPS组和PDTC+LPS组的NO表达量降低（P<

　　　各组表达ICAM-1、NF-κBp65mRNA结果

　　与CON组比较，其他各组ICAM-1mRNA表达均显著增高（P<

与LPS组相比，中浓度TMS+LPS组和PDTC+LPS组ICAM-1mRNA表达下降（P<

NF-κBp65mRNA在各组间的相对表达情况与ICAM-1mRNA表达情况类似。

　　　各组ICAM-1、NF-κBp65、IκBα蛋白表达结果

　　CON组HUVEs细胞的胞质中有一定量ICAM-1蛋白的表达，LPS组胞质中ICAM-1蛋白表达量显著增高（P<

与LPS组相比，中浓度TMS+LPS组和PDTC+LPS组胞质中ICAM-1蛋白表达量均降低（P均<

NF-κBp65蛋白在CON组细胞核中无表达，在LPS组中表达显著增高（P<

），在中浓度TMS+LPS组和PDTC+LPS组细胞核中表达降低（P均<

IκBα蛋白在CON组细胞质中有一定量表达，LPSTMS+LPS组和PDTC+LPS组的表达低于CON组（P均<

　　　各组ICAM-1和NF-κBp65蛋白细胞免疫荧光结果

　　ICAM-1蛋白荧光检测显示，CON组胞质中有弱ICAM-1蛋白荧光表达，LPS组胞质中有ICAM-1蛋白强荧光表达，而中浓度TMS+LPS组和PDTC+LPS组胞质中ICAM-1荧光表达均较LPS组减弱。

NF-κBp65蛋白荧光检测显示，CON组中为单纯细胞核染色且无目的蛋白荧光表达，LPS组中有明显的细胞核绿色荧光且为强表达;

中浓度TMS+LPS组和PDTC+LPS组中NF-κBp65蛋白荧光表达相对LPS组均减弱，且无细胞核荧光表达。

　　3　讨　论

　　白藜芦醇衍生物TMS分子式为C17H18O3，是以白藜芦醇（Resveratrol，RSV）为模板合成的系列化合物之一。

与RSV相比，TMS结构更稳定，3个甲基基团使其更具有亲脂性，易于和细胞膜结合，从而更容易透过细胞膜发挥药理作用。

TMS活性广泛，具有抗有丝分裂、抗新生血管、抗肿瘤、降血糖等功效，并且具有一定的抗炎作用，提示其功能的发挥可能与血管内皮功能的改变相关。

本研究首先对TMS用于细胞培养的药物毒性进行分析，结果显示在5、10μmol/L较低浓度时，TMS对HUVEs细胞的存活率影响较小，而在50、100μmol/L较高浓度时，细胞存活率明显下降，且呈时间、剂量依赖性。

正常生理条件下血管内皮细胞在维持血管结构稳定的同时，可以分泌抗凝、抗血小板聚集、抗纤溶等物质，具有抗炎，防止中性粒细胞、单核细胞等炎症细胞向血管壁黏附聚集的作用。

而VED是指在病理条件（包括高血脂、高血糖、高血流切应力、氧自由基、内毒素等）刺激下，内皮细胞功能发生异常，主要包括两个方面：

①血管收缩张力调节障碍;

②内皮细胞释放的细胞黏附分子和炎症介质表达增加，而内皮细胞释放的内皮衍生松弛因子即NO和ICAM-1是这两方面的重要标志性分子。

研究报道，内皮细胞在生理条件下，一氧化碳合酶（nitricoxidesyn-thase，NOS）维持在较低水平，而在病理情况下，例如SIRS、脓毒症、MODS、动脉粥样硬化等，NOS表达量增高，诱导NO释放增加，从而产生血管扩张、血流减慢、毛细血管通透性增高、促血小板凝集等现象，尤其在感染性休克的发生中其病理损害更为严重，可见NO在维持内皮细胞功能和完整性方面具有重要作用。

本研究以LPS诱导HUVEs细胞，结果表明NO释放量在LPS组中显著增高，而不同浓度TMS进行干预后，NO释放量呈下降趋势，这提示TMS对内皮细胞具有一定的保护作用;

以NF-κB抑制剂PDTC进行干预后，NO的释放量也呈下降趋势，这与邓炎辉等的报道相似。

由于不同浓度TMS对HUVEs细胞的毒性具有一定影响，本研究选择中浓度TMS（10μmol/L）进行后续实验。

　　ICAM-1可促进白细胞与内皮细胞之间的黏附力，在诱导血管通透性增高及新生血管产生过程中具有重要作用。

本研究中，以LPS诱导HUVEs细胞后，在基因和蛋白水平上检测到ICAM-1表达增高，同时这种增高伴有NF-κB亚基p65蛋白和基因表达的增高，这与Jia等的研究相似。

以中浓度TMS进行干预后，ICAM-1及NF-κB在mRNA和蛋白水平表达均下降，推测TMS对LPS诱导血管内皮细胞表达ICAM-1分子的抑制有可能是通过NF-κB细胞信号通路所起的作用。

研究表明，在经典的NF-κB细胞信号通路活化过程中，静息状态下的NF-κB分子以无活性状态存在于细胞质中，它与抑制因子IκB结合，组成一个三聚体p50-p65-IκB。

在外界刺激下，经IκBs激酶催化IkBs磷酸化和泛素化，使NF-κB自身抑制剂IκBα被蛋白酶降解，活化NF-κB转位入细胞核，与参与相关炎症反应分子的DNA基序结合以诱导靶基因转录等。

同时，编码抑制物IκBα基因转录，促其再回到细胞质中恢复静息状态。

本研究结果表明，TMS与NF-κB抑制剂PDTC具有类似的效应，都能使LPS诱导的ICAM-1及NF-κB表达降低、IκBα蛋白表达增高。

细胞免疫荧光检测结果显示，NF-κBp65蛋白在CON组细胞核中无表达，而在LPS组发现了明显的细胞核绿色荧光且为强表达;

在中浓度TMS+LPS组和PDTC+LPS组中，NF-κBp65蛋白荧光表达相对LPS组减弱，且无细胞核荧光表达，即抑制了NF-κBp65蛋白的核移，这些都支持以上提出的假设。

ICAM-1基因启动子上有1个基本的NF-κB位点，在TNF-α、IL-1、LPS及活性氧等作用下，NF-κB能在30min内使ICAM-1基因活化升高，并持续很长时间，且其表达升高与刺激物质呈时间、剂量依赖性。

NF-κB活化后，可增强TNF-α、IL-1β、IL-2的基因转录，促其产生和释放增加，进而再次激活NF-κB;

同时还可使IL-6、IL-8等促炎症因子产生及释放增多，从而导致最初的炎症信号进一步放大，加重机体损伤及微循环障碍，直至弥散性血管内凝血或死亡，这些病理生理异常多见于脓毒症和急性呼吸窘迫综合征等。

　　综上所述，TMS可降低LPS诱导的血管内皮细胞NO和ICAM-1的表达，在一定程度上具有改善VED的作用。

该研究可为TMS作为内皮细胞保护性药物的开发和利用提供一定的实验依据。