基因克隆关键技术Word格式.docx

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“切”是指用序列特异限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目基因；

“连”是指用DNA连接酶将目DNA同载体DNA连接起来，形成重组DNA分子；

“转”是指通过特殊办法将重组DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；

“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子个体。

基因克隆技术涉及把来自不同生物基因同有自主复制能力载体DNA在体外人工连接，构建成新重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态转移和重新组合。

1.目基因获得

目基因是指所要研究或应用基因，也就是将要克隆或表达基因。

获得目基因是分子克隆过程中最重要一步。

基因工程流程第一步就是获得目DNA片段,。

所需目基因来源，不外乎是分离自然存在基因或人工合成基因。

惯用办法有PCR法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库办法来筛选[1]

1.1PCR办法

1.1.1PCR

PCR是一种在体外迅速扩增特定基因或DNA[2]。

聚合酶链式反映（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段一种办法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反映构成一种周期，循环进行，使目DNA得以迅速扩增，具备特异性强、敏捷度高、操作简便、省时等特点。

它不但可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基本研究，还可用于疾病诊断或任何有DNA,RNA地方．聚合酶链式反映（PolymeraseChainReaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

DNA半保存复制是生物进化和传代重要途径。

双链DNA在各种酶作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子参加下，依照碱基互补配对原则复制成同样两分子挎贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度减少后又可以复性成为双链。

因而，通过温度变化控制DNA变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完毕特定基因体外复制[3]。

PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反映环节构成：

①模板DNA变性：

模板DNA经加热至94℃左右一定期间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反映作准备；

②模板DNA与引物退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40～60℃左右，引物与模板DNA单链互补序列配对结合；

③引物延伸：

DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶作用下，于72℃左右，以dNTP为反映原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条新与模板DNA链互补半保存复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多“半保存复制链”，并且这种新链又可成为下次循环模板。

每完毕一种循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目基因扩增放大几百万倍[4]。

1.1.2RT-PCR

反转录PCR（RT-PCR）又称为逆转录PCR，是将RNA逆转录（RT）和cDNA聚合酶链式扩增反映（PCR）相结合技术。

其原理是：

提取组织或细胞中总RNA，以其中mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物运用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目基因或检测基因表达。

是将RNA逆转录（RT）和cDNA聚合酶链式扩增反映（PCR）相结合技术[4]。

RT-PCR技术敏捷并且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒含量和直接克隆特定基因cDNA序列等。

1.1.3real—timePCR

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国appliedbiosystems公司推出，由于该技术不但实现了PCR从定性到定量奔腾，并且与常规PCR相比，它具备特异性更强，敏捷度高，重复性好，定量准，等长处，当前已得到广泛应用[5]。

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反映体系中加入荧光基团，运用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过原则曲线对未知模板进行定量分析办法。

实时荧光定量PCR技术不但广泛地应用于分子生物学各个研究领域，并且也开始作为一种诊断手段应用于兽医临床。

其应用涉及到范畴涉及病原体检测、基因表达定量和等位基因鉴定等各种领域[6]。

实时定量PCR反映是在带透明盖塑料小管中，激发光可以直接透过管盖，使其中荧光探针被激发。

荧光探针事先混合在PCR反映液中，只有与DNA结合后，才可以被激发发出荧光。

随着新合成目DNA片段增长，结合到DNA上荧光探针，即被激发产生荧光相应增长[3]。

Woo等[11]运用SYBRGreenI作为荧光染料建立了一种鉴定钩端螺旋体办法，运用熔点曲线分析来区别特异产物、引物二聚体和非特异性产物，不需要电泳来鉴定，该办法迅速而敏感，整个过程在20min内完毕。

Jamest51等应用TaqMan探针建立了从小牛腹泻粪便中定量检测水源性寄生虫小隐孢子虫Cj基因和18SrRNA办法。

Frank等[12]建立了基于TaqMan探针实时RT-PCR办法，从感染马传染性贫血病毒（EIAV）马血浆中定量检测EIAV荷裁量，比竞争性RT—PCR更省事，有更大检测范畴。

1.2基因组文库或cDNA文库构建和筛选

将基因组DNA用限制性内切酶消化后插入到恰当载体中，得到具有不同插入片段克隆载体，这种克隆载体混合物具有长短不同基因组片段，这就是基因文库。

若将细胞内所有mRNA均逆转录成cDNA，然后将所有cDNA片段克隆到恰当载体中，构建成具有不同cDNA片段克隆载体混合物，这就是cDNA文库。

cDNA合成可用RT-PCR法，也称反转录PCR[9]。

它是一种酶促合成法，即以mRNA为模板，在反转录酶作用下，以4种脱氧核苷三磷酸为材料合成DNA（cDNA），再经复制后即成双链DNA。

从真核生物中提取mRNA，由于mRNA后有100-200bpPoly（A），用与Poly（A）互补12-18个核苷酸Oligo（dT）合成一种组织中所有mRNA相应cDNA第一链。

然后使用末端转移酶在cDNA第一链末端加上多聚C，经变性和水解mRNA后，加入1个末端为多聚G引物合成其互补链（第二条链），再经PCR进行大量扩增。

由于真核生物基因由编码外显子和大量不编码内含子两种序列构成，用这种办法得到基因没有内含子，不具备启动子和终结子，因此缺少功能活性。

如果外接一段调节序列，就能在受体细胞中表达，因此此法是克隆真核生物基因有效办法[7]。

自从1970年Temin等发现反转录酶以来,此法已广泛应用于人[8]、猪、田鼠、鸭子。

当获得了基因组文库或cDNA文库，可以依照已知信息合成特异性探针，采用核酸分子杂交办法从文库中筛选感兴趣基因片段，这仍是当前获得新基因一种惯用手段。

1.3化学合成法制备基因片段

采用DNA合成仪，对目基因进行分段合成，然后进行连接，可以得到所需目基因。

化学合成法可以变化原始基因序列，甚至可以合成自然界不存在序列。

在合成过程中可以依照需要变化核苷酸密码子，如将真核基因序列中不易在E.coli中运用稀有密码子改成E.coli偏爱密码子，有助于真核基因在E.coli中表达。

2.重组质粒构建

DNA体外重组是将目基因在DNA连接酶作用下，连接到适当载体DNA上，以便下一步转化之用。

这种由两种不同DNA片段重新组合而成DNA称重组DNA，简称重组体。

重组DNA分子是在DNA连接酶作用下，有Mg2、ATP存在连接缓冲系统中，将分别经酶切载体分子与外源DNA分子进行连接。

　　DNA连接酶有两种：

T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

两种DNA连接酶均有将两个带有相似粘性末端DNA分子连在一起功能，并且T4噬菌体DNA连接酶尚有一种大肠杆菌DNA连接酶没有特性，即能使两个平末端双链DNA分子连接起来。

但这种连接效率比粘性末端连接率低，普通可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增长DNA浓度来提高平末端连接效率。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反映分为3步：

一方面，T4DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；

然后，酶-ATP复合物再结合到具备5’磷酸基和3’羟基切口DNA上，使DNA腺苷化；

最后产生一种新磷酸二酯键，把切口封起来。

连接反映普通将两个不同大小片断相连[10]。

　　诸多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链3’端加上一种突出碱基A。

pUCm-T载体是一种已经线性化载体，载体每条链3’端带有一种突出T。

这样，pUCm-T载体两端就可以和PCR产物两端进行对的AT配对，在连接酶催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成具有目片断重组载体。

　　连接反映温度在37℃时有助于连接酶活性。

但是在这个温度下粘末端氢键结合是不稳定。

因而采用折中温度，即12～16℃，连接12～16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶活性，又兼顾到短暂配对构造稳定。

3.重组分子扩增和鉴定

3.1重组DNA分子导入受体细胞

目基因和载体在体外连接形成重组DNA分子后，需要被导入受体细胞中才干进行增殖和（或）表达。

接受重组DNA分子细胞称作受体细胞或宿主细胞。

受体细胞分为原核细胞（如大肠杆菌）和真核细胞（如酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞）。

原核细胞可作为基因复制扩增场合，也可作为基因表达场合；

而真核细胞普通只用作基因表达系统。

受体细胞是重组基因增殖场合，因此对受体细胞也应具备几点规定：

①容易接纳重组DNA分子；

②对载体复制扩增无严格限制；

③不存在特异能降解外源DNA内切酶体；

④不对外源DNA进行修饰。

由于载体不同，所具备筛选标志不同，所用受体细胞也不同，因而可依照所用载体选取适当受体细胞。

普通将重组DNA分子导入原核细胞过程称为转化，而导入真核细胞过程称为转染。

未经解决大肠杆菌很难接受外源重组DNA分子，但经物理或化学办法解决后，细菌对摄取外来DNA分子变得敏感了，这种经解决而易接受外源DNA分子细胞叫做感受态细胞。

将重组DNA分子和感受态大肠杆菌细胞相混合，使重组DNA分子进入大肠杆菌中，就可以实现重组DNA分子转化[10]。

3.2重组DNA分子鉴定

重组DNA分子导入受体细胞后与否得到扩增，扩增后重组DNA分子与否对的，导入重组DNA分子与否具有对的插入片段，重组DNA分子能否表达插入目基因，普通可以采用如下几种办法对重组DNA分子进行鉴定。

3.2.1.抗生素筛选　可依照所选用载体特性，特别是抗药基因存在与否进行初步筛选。

例如载体具备抗氨苄青霉素抗性基因，若转化后细胞能在含氨苄青霉素培养基中生长，阐明载体DNA被导入到了受体细胞中并且可以扩增繁殖。

但这种筛选并不能阐明目基因一定连接到了载体上。

但通过抗药基因失活筛选可以证明有外源基因插入。

3.2.2.X-gal筛选　有些载体为了以便筛选，依照细菌乳糖操纵子原理，将LacZ基因构建到了载体多克隆酶切位点处。

如果目基因连接成功，LacZ基因将由于目基因插入而失活，不能产生分解乳糖及其类似物半乳糖苷酶，菌落在具有X-gal培养基上呈现白色，无目基因插入克隆菌落为蓝色。

依照这种特性，可以基本判断重构成功与否。

3.3.3.酶切电泳鉴定　将重组DNA分子提取出来，用特定内切酶切割重组DNA分子并电泳。

如果目基因被成功地插入到了载体分子中，可以通过目基因两端酶切位点将目基因切割下来，经琼脂糖凝胶电泳即可以判断目基因存在与否，这是简便而惯用鉴定办法。

3.3.4.序列分析　通过初步鉴定后重组DNA分子往往需要进行目基因片段DNA序列分析，普通采用多克隆酶切位点两端载体序列作为测序时引物结合位点，即所谓通用引物。

关于DNA序列分析技术将在关于章节详细论述。

普通需要表达目基因都必要通过DNA序列分析予以确认。

3.3.5.其她办法　如采用核酸分子杂交或菌落原位杂交鉴定重组DNA分子，或采用蛋白印迹办法直接检测目蛋白表达状况。

4.某些惯用试剂配备

在实验过程中，需要配备某些试剂，如LB培养基，琼脂糖凝胶、电泳缓冲液等，详细配备办法如下[13]。

4.1LB（Luria-Bertani）培养液、平板配制

　　配制每升LB培养液，应在950ml去离子水中加入：

　　细菌培养用酵母提取物（bacto-yeastextract）5g

　　细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-tryptone）10g

　　NaCl10g

　　摇动容器直至溶质完全溶解，用5mol/LNaOH（约0.2ml）调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1L，在高压下蒸汽灭菌20min。

　　LB琼脂平板配制：

先按上述配方配制液体培养基，临高压灭菌前加入琼脂糖15g/L，同法高压蒸汽灭菌20min。

从高压灭菌器取出培养基时应轻轻旋动以使熔解琼脂糖能均匀分布于整个培养基溶液中，应使培养基降温至50℃时，加入抗生素等不耐热物质。

4.2琼脂糖凝胶配制

　　依照所需凝胶浓度称取琼脂糖，加入相应电泳缓冲液中，用微波炉加热煮沸至琼脂糖完全溶解，加入适量TAE混匀，恰当冷却后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，凝胶厚度不超过梳孔。

4.3电泳缓冲液

Tris-乙酸（TAE）：

50×

浓贮存液（每升）：

242gTri碱57.1m、冰乙酸100ml、0.5mmol/LEDTA（pH8.0）使用时再稀释50倍。

Tris-磷酸（TPE）：

10×

108gTri碱15.5ml、85％磷酸（1.679g/ml）40ml、0.5mmol/LEDTA（pH8.0）使用时再稀释10倍。

Tris-硼酸（TBE）：

5×

54gTri碱27.5g、硼酸20ml、0.5mmol/LEDTA（pH8.0）使用时再稀释10倍。

4.430％丙烯酰胺：

将29g丙烯酰胺和1gN,N’－亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。

用Nalgene滤器（0.45孔径）过滤除菌查证该溶液pH值应不不不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。

4.51mol/LCaCl2：

在200ml纯水中（Milli-Q水或相称级别水）溶解54gCaCl2·

6H2O，用0.22滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于－20℃。

2.5mol/LCaCl2：

在20ml蒸馏水中溶解13.5gCaCl2·

6H2O，用0.22滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于－20℃。

4.61mol/L二硫苏糖醇（DTT）：

用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于－20℃。

4.70.5mol/LEDTA（pH8.0）：

在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·

H2O），在磁力搅拌器上激烈搅拌，用NaOH调节溶液pH值至8.0，然后定容至1升，分装后高压灭菌备用。

4.8溴化乙锭（10mg/ml）：

在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以保证其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。

4.910%十二烷基硫酸钠（SDS）：

在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液pH值至7.2，加入水定容至1L，分装备用。

5.总结

在分子生物学中，基因克隆是一种惯用技术。

其中核心技术是DNA重组技术，它运用酶学办法将不同来源DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一种新杂合DNA分子。

在此基本上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量子代分子，此过程称基因克隆。

有目地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，变化生物遗传性状系列过程总称为基因工程。

本论文重要简介了基因克隆技术几种重要过程。

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