分子生物学实验指导讲义Word文件下载.docx
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10.将沉淀用70%乙醇清洗两次后，晾干，加入50µ
lTE或无菌水溶解沉淀。
11.加入2倍体积预冷的无水乙
醇，充分混匀，于4℃,7500g（对于小样品，在离心机上以10000r/min）离心15min。
12.测定该溶液在紫外光波260nm和280nm的吸光值计算提取DNA的浓度（也可同时进行琼脂糖电泳）。
五、实验材料与耗材
1、实验材料：
植物叶片（幼嫩叶片为佳）。
2、耗材：
2ml离心管×
1，玻璃棒×
1，陶瓷研钵和杵子×
1，50ml烧杯×
1，剪刀×
1，滴管×
1。
3、试剂：
液氮，CTAB，Tris碱，Na2EDTA，NaCl，β-巯基乙醇，盐酸，氯仿，异戊醇，乙醇
六、仪器与设备
冰箱，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，紫外分光光度计
七、注意事项
1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。
2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。
（二）植物总RNA的提取和含量测定
1、了解RNA的特性。
2、掌握Trizol法提取RNA的原理及操作技术。
RNA分子是化学性质非常活跃的分子。
在提取细胞内RNA的过程中，RNA分子容易受细胞内核酸酶、化学试剂、机械震荡等多种因素影响而破坏分子结构，导致提取失败。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放的核酸酶活性。
Trizol适用于从多种组织和细胞中快速分离总的RNA。
1、称取1g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，吸水纸吸干水分。
2、将叶片剪成1cm长，置预冷的陶瓷研钵中，倒入液氮，快速研磨成粉末。
3、待液氮蒸发完后，快速称取0.1g粉末移到1.5ml离心管中，加入1ml
Trizol.试剂,充分振荡,冰上静置3～5min。
4、加入200μl氯仿/异戊醇（24:
1）或氯仿，剧烈振荡混匀30秒。
5、离心12000rpm，4℃，10min。
6、将上清液小心转移到新1.5ml离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，-20℃，30分钟。
注：
不要吸取任何中间层物质，否则会出现DNA
污染。
7、离心12000rpm，4℃，5分钟。
8、小心移去上清液，防止沉淀丢失。
9、加入700μl70%酒精洗涤，离心12000rpm，4℃，5分钟。
10、重复步骤‘9’。
11、离心结束后，弃去上清，防止丢失RNA沉淀。
12、室温干燥，让乙醇挥发完全。
13、加入30～50μl的DEPC水溶解，可以-70℃保存。
可以采用电泳技术或光谱技术检测RNA的浓度、纯度情况。
四、溶液配制
1、Trizol试剂:
直接使用供应商提供的Trizol类试剂；
每组1ml。
2、氯仿-异戊醇混合液（24:
1，V/V）：
分别量取96ml氯仿和4ml异戊醇混合均匀；
每组200μl。
3、70%乙醇：
量取70ml无水乙醇用水定容到100ml,4℃保存；
每组1.5ml。
4、0.1%DEPC超纯水：
用移液枪吸取1mlDEPC，加入1l待处理超纯水，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC（DEPC分解为CO2和乙醇）；
每组用少量。
植物叶片（幼嫩材料为佳）。
1.5ml离心管（DEPC处理），移液器（规格1000μl、10μl），Tip头（DEPC处理）。
Trizol试剂，氯仿，异戊醇，无水乙醇，超纯水，DEPC（二乙基焦碳酸酯），超纯水（DEPC处理）。
冰箱，超净工作台，冷冻高速离心机，制冰机。
全程佩戴一次性手套。
皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染抽提的RNA并成为RNA酶的来源。
实验项目二：
质粒DNA的提取
1、学习碱裂解法提取质粒的基本原理。
2、掌握碱裂解小量提取质粒的实验技术。
质粒是细菌细胞内独立于染色体外的遗传物质，是环状的双链DNA分子。
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异而分离。
在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA和共价闭合环状质粒DNA的氢键都会被断裂，双螺旋结构解开而变性。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链复性迅速而准确，重新溶解在液相中；
而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
1、将含有目的质粒的E.coli菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
2、取1ml培养物倒入1.5ml管中，12000rpm/min，离心1min。
3、弃去培养液上清，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。
5、加200μl溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，快速颠倒5次，混匀内容物，将离心管放在冰上。
6、加入150μl溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管盖，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。
7、12000r/min，离心10min，将上清液转至新1.5ml离心管中。
8、向上清液加入等体积的饱和酚，混匀。
9、12000r/min，离心5min，将上清液转至新1.5mL离心管中。
10、向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
12000r/min离心5min。
倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
11、1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。
12、20μlTE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存。
13、琼脂糖凝胶电泳检测提取的质粒DNA样品。
1、1.0mol/lTris（pH8.0）：
称取12.11gTris用约80ml水溶解后，加入约4.2ml浓盐酸将溶液pH调到8.0，最后用100ml容量瓶定容；
每组不到0.1ml。
2、0.5mol/lEDTA（pH8.0）：
称取18.61g
Na2EDTA用约80ml水溶解后，加入约2gNaOH,调节pH至8.0，最后用100ml容量瓶定容；
3、0.4mol/lNaOH：
称取0.8gNaOH固体溶解后定容到50ml。
4、2%SDS：
称取1gSDS固体溶解后定容到50ml。
5、5mol/l乙酸钾：
称取49g乙酸钾固体，溶解后定容到100ml。
6、溶液Ⅰ（pH8.0）:
含有50mmol/l葡萄糖、5mmol/lTris、10mmol/l
EDTA。
称取0.9g葡萄糖，用约50ml蒸馏水溶解后，分别量取0.5ml的1.0mol/lTris溶液和4ml的0.5mol/lEDTA溶液加入混匀，加水定容到100ml。
121℃湿热灭菌15min，4℃保存；
每组100μl。
7、溶液Ⅱ：
将等体积的0.4mol/lNaOH和2%SDS混合，新鲜配制；
8、溶液Ⅲ：
含有5mol/l乙酸钾和3mol/l冰乙酸。
分别量取60ml的5mol/l乙酸钾和11.5ml冰乙酸，加水定容到100ml。
121℃湿热灭菌20min，4℃保存；
每组150μl。
9、70%乙醇：
量取70ml无水乙醇用水定容到100ml；
10、TE缓冲液（pH8.0）：
该溶液含有10mmol/lTris和1mmol/lEDTA。
分别量取1ml1.0mmol/lTris和0.2ml0.5mol/lEDTA，混合均匀后定容到100ml；
每组50μl。
含有目标质粒DNA的大肠杆菌细胞。
1.5ml离心管×
3，移液器（规格1000μl、100μl、10μl）。
葡萄糖，Tris碱，盐酸，Na2EDTA，NaOH，SDS，乙酸钾，冰乙酸，乙醇，tip头（需要高压灭菌处理）。
恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅，制冰机。
1、实验中使用的溶液和tip头都需要高压灭菌处理。
2、由于溶液Ⅰ中含有葡萄糖，高压灭菌的时间过长，会导致葡萄糖碳化。
3、加入溶液Ⅱ后，要温和混匀。
4、溶液Ⅰ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE溶液都应4℃保存。
实验项目三：
PCR基因扩增
学习和掌握PCR反应的基本原理与实验技术。
多聚酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。
两个寡核苷酸引物分别结合在待扩增的目标DNA片段的两侧，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。
变性：
加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
退火：
使溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。
延伸：
溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5′→3′方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量增加一倍，新合成的链又可成为下一轮新循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
1、在PCR管内配制20μl反应体系：
反应物
体积（μl）
10×
buffer
2.0
dNTP
0.5
引物1
1.0
引物2
rTaq酶
Template
1
ddH2O
14
总体积
20
2、按下列程序进行扩增：
①
95℃预变性
5min
②
95℃变性
1min
③
55℃退火
④
72℃延伸
⑤重复步骤②～④30次；
⑥
10min
3、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果
配制0.7%琼脂糖凝胶，取10μl扩增产物电泳。
保持电流40mA。
电泳结束后，紫外灯下观察结果。
本实验中使用的10×
缓冲液、dNTP、rTaq酶都直接由供应商提供，无需学生准备。
1、10×
缓冲液：
含有500mmol/lKCl、100mmol/lTris·HCl（pH8.3）、15mmol/lMgCl2
和0.1%明胶。
2、dNTP：
分别含有1mmol/l的dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
3、DNA模板：
模板DNA的浓度控制在1ng/μl。
4、引物1/2溶液:
配制的引物溶液浓度为10pmol/μl。
每组用量不到2μl。
1、实验耗材：
冰盒，PCR管，移液器（规格20μl、10μl，2.5μl），模板DNA。
2、试剂：
聚合酶缓冲液，rTaq酶，dNTP，1对引物，超纯水，tip头。
冰箱，PCR热循环仪，制冰机。
1、实验中使用的tip头都需要灭菌处理。
2、PCR加样时，尽量保持低温操作，避免酶失活和模板、引物降解。
3、取样时注意不能污染试剂。
4、设置1份阴性对照，即用超纯水替代模板DNA进行PCR反应，以排除假阳性结果。
实验项目四：
琼脂糖凝胶电泳
1、学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的实验技术和原理。
2、了解大分子染料染色检测核酸的实验技术。
琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖，其结构单元是
D-半乳糖-3,6-L
半乳糖。
琼脂糖分子依靠氢键及其他作用力使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。
该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。
在pH4.0～9.0
的缓冲液中稳定。
由于其分子上无带电基团，在缓冲液离子强度大于0.05时，对蛋白质无吸附作用，也无电渗现象，因而分辨率和重现性均较好，是一种优良的电泳材料。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值呈反比关系。
凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如pUC19质粒有3种构型：
超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalentlyclosedcircularDNA,简称cccDNA）；
开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA的
1条链断裂（opencircularDNA,简称OCDNA）；
线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA的2条链发生断裂（linearDNA,
简称LDNA）。
这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。
电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
传统的核酸染料溴化乙锭（EB）是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。
溴化乙锭在302nm紫外光下激发并放射出橙红色信号。
由于溴化乙锭可以嵌入核酸分子的碱基中从而导致错配。
许多人认为溴化乙锭是强诱变剂,具有高致癌性。
为减少实验操作中有毒物质的接触，开发了多种安全性、稳定性和灵敏度都较好的大分子核酸染料，可以和核酸分子结合并在紫外灯下产生荧光，适用于各种核酸物质的检测。
1、制备琼脂糖凝胶
（1）按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。
可参照下表。
琼脂糖凝胶浓度（%）
线性DNA的有效分离范围（kb）
0.3
5～60
0.6
1～20
0.7
0.8～10
0.9
0.5～7
1.2
0.4～6
1.5
0.2～4
0.1～3
（2）称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml0.5×
TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。
2、胶板的制备
①取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。
②有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。
③将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，加入2μl大分子染料混匀后，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。
④待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。
⑤加入电泳缓冲液至电泳槽中，让缓冲液盖过凝胶。
3、加样
用移液枪将上样缓冲液与DNA样品按1:
5比例混合，加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。
每次上样量约10μl。
4、电泳
①接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。
DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。
②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳。
③将染色后的凝胶放入凝胶成像仪中拍照。
1、0.5mol/lEDTA（pH8.0）：
Na2EDTA用约80ml水溶解后，加入约2gNaOH,调节pH至8.0，最后用100ml容量瓶定容。
2、5×
TBE（贮存液）:
分别称取54gTris和27.5g硼酸，用800ml蒸馏水溶解后，加入20ml0.5mol/lEDTA，定容到1000ml。
3、凝胶加样缓冲液（6×
）：
含有0.25%溴酚蓝和40%蔗糖。
分别称取0.25g溴酚蓝和40g蔗糖，用80ml蒸馏水溶解后定容到100ml；
每个检测样品用量2μl。
待检测的DNA。
150ml三角瓶1个，50ml量筒1个，移液器（规格10μl）。
琼脂糖，Tris碱，硼酸，溴酚蓝，蔗糖，大分子染料，DNAmarker，tip头。
电泳仪，电泳槽，凝胶成像系统。
1、上样时应将tip头伸入加样孔内加样，以免检测样品扩散到电泳缓冲液。
2、琼脂糖溶液中加入大分子染料时的温度不能太高，以免染料分子降解。
3、电泳时间不能过长，以免样品跑出凝胶。
4、取出琼脂糖凝胶观察时，要小心以免损坏凝胶。
5、接触含有大分子染料的凝胶需要带一次性手套，不能直接接触。
6、核酸染料分子也可以不在制胶的时候加入，而在电泳结束后将胶放入染料溶液中染色30min后再紫外检测。
实验项目五：
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
1、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的实验技术。
2、掌握热激转化实验技术。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指外源DNA导入细菌的过程。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌体细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。
将细菌放置在非选择性培养基中保温复苏一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上，进行转化结果的筛选。
1、从大肠杆菌BL21平板上挑取一个单菌落接于2mlLB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
2、取1ml菌液转接到一个含有50mlLB液体培养基锥形瓶中，37℃振荡培养2～3h。
（此时，OD600≤0.4～0.5，细胞数务必<
108/ml，此为实验成功的关键）。
3、取菌液1ml加入1.5ml离心管，离心12000rpm，2min收集菌体细胞。
4、用1ml冰预冷的0.1mol/lCaCl2
溶液悬浮沉淀。
5、离心12000rpm，2min，回收细胞。
6、用冰预冷的0.1mol/lCaCl2溶液100μl
重悬沉淀。
此细胞为感受态细胞。
在-4℃下可保存2周（2～4天，转化效率最高）。
7、取5μl的质粒加入100μl感受态细胞，冰上放置30min。
同时做两个对照管：
受体菌对照：
100μl
感受态细胞
+5μl
无菌水
质粒对照：
100μl0.1mol/lCaCl2溶液
质粒DNA溶液
8、将离心管放到42℃循环水浴90sec。
9、迅速插入冰上，放置2～3min。
10、每个转化的离心管加入800μlLB液体培养基，37℃培养90min（慢摇）。
11、复苏培养后，离心12000rpm，2min，在超净台上用移液器弃去800μl上清（余下约100μl溶液），用移液器吹打混匀沉淀的细胞和余下的培养液。
12、将约100μl已转化的感受态细胞溶液，均匀涂布在含有氨苄青霉素的培养皿中。
13、倒置平皿37℃培养12-16h，第二天观察细菌生长情况。
1、0.1mol/l
CaCl2：
称取1.11g
CaCl2固体溶液,用80ml蒸馏水溶解后，定容至100ml，需要高压灭菌；
每组2ml。
2、LB液体培养基：
分别称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10gNaCl固体，用800ml蒸馏水完全溶解后，用NaOH调节pH至7.0，加水至总体积为1l，121℃湿热灭菌20min。
3、LB固体培养基：
每1l液体LB培养基加15g琼脂。
4、100mg/ml氨苄青霉素（Amp）：
称取Amp固体100mg，溶于1ml无菌水中。
有条件的情况下，可以将配制好的Amp溶液，用细菌过滤器除菌。
置-20℃冰箱保存。
大肠杆菌菌株JM109细胞，待转化的重组DNA分子（含有Ampr）。
培养皿，三角瓶，玻璃推子，移液器（规格1000μl、100μl、10μl），1.5ml离心管。
CaCl2，胰蛋白胨，酵母提取物，NaCl，NaOH，氨苄青霉素
超净工作台，冷冻高速离心机，恒温摇床，恒温培养箱，恒温水浴器，高压灭菌锅
1、实验中使用的tip头、培养皿都需要高压灭菌。
2、熔化固体培养基后，加入Amp试剂时温度不宜过高，以免Amp失活。
3、超净台上无菌操作注意安全。
4、实验操作过程中尽量避免杂菌污染。
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