分子生物学实验讲义.docx

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分子生物学实验讲义

《现代生物学实验》

分子生物学部分

2009、9

目录

内容页

实验一SDS法提取植物核酸……………………………………………………2

实验二CTAB法提取植物核酸……………………………………………………2

实验三DNA的纯化及利用紫外分光光度计检测DNA含量及纯度……………3

实验四质粒DNA的提取………………………………………………………4

实验五PCR技术扩增DNA………………………………………………5

实验六质粒DNA酶切………………………………………………………6

实验七DNA的琼脂糖凝胶电泳检测及目的DNA片段的回收………………7

实验八DNA片段的重组………………………………………………9

实验九大肠杆菌感受态细胞制备………………………………………………10

实验十外源基因遗传转化……………………………………………………11

实验十一转基因水稻GUS报告基因检测………………………………………12

实验十二分子生物学实验设计…………………………………………………11

实验一SDS法提取植物核酸

一、实验目的

通过本实验了解SDS法提取植物组织总核酸的原理及方法。

二、实验原理

利用高浓度的SDS在较高温度下（55-65度）裂解细胞，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来，通过酚和氯仿抽提去除蛋白质、脂质、多糖等，通过RNaseA消化去除RNA，最后用乙醇沉淀DNA。

该法操作简便，能满足大多数实验需要。

三、材料

市售新鲜豆苗，菠菜等。

四．仪器用品

1．用具

玻棒、烧杯（250毫升），离心管（100毫升）、研钵、量筒（100毫升）、分析天平、紫外分光度计，37OC水浴、离心机等。

2．药品配制

（1）研磨缓冲液（pH7.0）：

分别称取一定量的NaCl、柠檬酸三钠和EDTA三种药品，定容于1000毫升蒸馏水中（0.45mol/LNaCl，0.045mol/L柠檬酸三钠，0.1mol/LEDTA）（3×SSC），再在定容好的溶液中按1%比例加入SDS，调pH到7.0。

（2）氯仿-异戊醇：

按照氯仿：

异戊醇=24：

1比例配制。

（3）溶解DNA溶液（pH7.0）：

即0.1×SSC溶液，含有0.015mol/LNaCl，0.0015mol/L柠檬酸三钠。

（4）95%或100%乙醇4C冰箱预冷

五、实验步骤

1.称新鲜豆苗或菠菜嫩叶1克，放在研钵内，加入与2-3ml的体积的研磨缓冲液，充分将植物组织研磨成为浆状物。

2.将750ul浆状物加入一个1.5ml离心管内，加入等体积（750ul）的氯仿—异戊醇混合液，盖上管盖，剧烈摇晃30秒钟，以脱除组织蛋白质，转移至1.5ml离心管中。

3.离心管平衡后，10000转/分离心5min，形成三层，小心的吸取上层含核酸的水溶液，弃去中间的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4.将收集的水溶液放入一个新的1.5ml离心管中，在72C下继续保温3分钟（不要超过4分钟）以灭活组织内的DNA酶，然后迅速取出离心管，放在冰水浴中冷却到室温。

5.取0.5ml溶液转入1.5ml离心管，加等体积95%或100%预冷乙醇水溶液，玻棒取出核酸，溶于适量0.1*SSC中，以待纯化使用。

五、作业

1.在本实验中所用SDS在提取核酸过程中有何作用？

2.在上清液中加入95%（或100%）乙醇后，你看到出现的核酸是什么状态？

实验二CTAB法提取植物核酸

一、实验目的

通过本实验了解CTAB法提取植物组织核酸的原理及基本操作步骤。

二、实验原理

植物细胞中DNA主要存在于细胞核内，称核DNA或染色体DNA，细胞质中含有少量的DNA，分布在线粒体和叶绿体内。

植物细胞内的各种DNA总称为总DNA。

核DNA分子呈极不对称的线状结构，一条染色体为一个DNA分子。

高等植物的核DNA约为109bp，如此细长的分子对任何机械力的作用都十分敏感。

在DNA提取过程中，DNA分子的降解很难避免，因此提取得到的只是DNA分子的片段。

植物DNA的提取常用有CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）和SDS（十二烷基硫酸钠）两种方法：

CTAB是一种去垢剂，能与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液（0.7mol/LNaCl）中可溶解，且能稳定存在，但如果降低盐的浓度（0.3mol/LNaCl），CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来，而大部分的蛋白质及多糖仍溶于溶液中，这样通过离心就可以去除蛋白质、多糖等杂质。

最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

三、材料

新鲜干净的菠菜叶片或豆苗

四．试剂和器材

（1）1MTris-HCl（pH8.0）500mL :

60.57gTris,pH8.0

（2）CTAB分离缓冲液

2%CTAB（W/V）,1.4mol/LNaCL,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HCL（pH8.0）,0.2%巯基乙醇共100mL：

2gCTAB,8.18gNaCL,0.74gEDTA.Na2.2H2O，加入10mL1mol/L的Tris-HCl（pH8.0）,0.2mL巯基乙醇，加水定容到100mL。

（3）70%的乙醇，异丙醇，氯仿-异戊醇（24:

1），液氮

（4）TE缓冲液10mmol/LTris-HCL（pH7.4）,1mmol/LEDTA

（5）研钵（研棒），恒温水浴锅（37-100C），离心机，离心管。

五、实验步骤

1.取新鲜菠菜嫩叶或豆苗4克，放在预冷的研钵内，加液氮研磨至粉末状，将粉末转移至10ml离心管中，加入8ml的60C预热的2*CTAB，轻轻震荡后置于60C水浴锅中45min，并不时震荡。

2.取出离心管，冷却至室温后，加入等体积的氯仿—异戊醇（24：

1）的混合液，充分混匀。

3.将离心管内的溶液进行平衡，4000转/分的条件下离心10min，吸取上清液加入其2/3倍体积的异丙醇，轻轻混匀使核酸析出。

4.用玻棒捞出核酸，用70%的乙醇洗涤，室温干燥后溶于适量1*TE或水中冻存于－20C备用。

五、作业

1.实验中所用的各种药品在提取核酸过程中各自有何作用？

2.在上清液中加入异丙醇后，请用图解说明上清液中出现的核酸。

实验三DNA的纯化及利用紫外分光光度计检测DNA含量及纯度

一、实验目的

了解DNA纯化的原理及步骤，并了解分光光度计法测DNA浓度和纯度的方法及原理。

二、实验原理

利用RNA酶去除植物组织总核酸中的RNA杂质，用有机溶剂抽提溶液中的蛋白质、多糖及酚类物质，再用95%的预冷酒精沉淀和清洗即可得到较纯的DNA。

根据DNA和蛋白质分别在260nm和280nm波长的最大吸收值，即可通过计算由紫外分光光度计测定DNA溶液在260nm和280nmO.D值的比值，确定DNA溶液的纯度。

O.D（260）/O.D（280）应等于1.8。

若大于1.8，说明溶液中含RNA杂质，可用RNA酶重新处理。

若小于1.6，说明溶液中有蛋白质及酚，可用有机溶剂再次抽提。

采用紫外分光光度计分析法确定DNA浓度可利用如下公式进行计算：

1O.D（260nm）=50（ug/ml）

三．仪器用品

1．仪器

紫外分光度计，离心机，移液枪，

2.试剂

25mg/mL的RNA酶，氯仿—异戊醇（24：

1），95%乙醇

四、实验步骤

1.在实验一已提好的植物核酸粗提液中加RNA酶，使最终浓度为50ug/ml，放入37ºC的水浴锅中半小时。

2.加入等体积的氯仿—异戊醇（24：

1）的混合液，充分混匀并于8000转/分的条件离心5min，吸取上清液并加入2倍体积预冷的95%乙醇，轻轻混匀，使DNA析出。

3.在4ºC4000转/分的条件下离心5min，去上清液，晾干沉淀，加适量1*TE或无菌水，使DNA溶解。

4.用紫外分光光度检测DNA纯度和浓度。

四、作业：

1.记录你检测DNA溶液在260nm和280nm两个波长下的OD值。

2.根据测得结果分析你提取DNA溶液的纯度和浓度。

实验四质粒DNA的提取

一、实验目的

通过本实验了解碱裂解法进行质粒DNA的少量制备的方法与原理。

二、实验原理

在强碱环境中，大分子量核DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。

将pH调至中性并在高盐环境中，核DNA之间交联形成不溶性网状结构，但质粒DNA仍然呈可溶状态。

三、主要溶液

溶液Ⅰ：

50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA（pH8.0），25mmol/LTris-Cl（pH8.0）缓冲液

溶液Ⅱ：

1%（m/V）SDS，0.2NNaOH溶液

溶液Ⅲ：

KAC、HAC高盐溶液（所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L）

四、实验步骤

1.吸取1.5ml大肠杆菌菌液，5000转/分离心5分钟，去上清液，若菌体量不足，可重复一次。

2.加100ul预冷的溶液Ⅰ，振荡重悬沉淀的菌体。

3.加200ul新配制的溶液Ⅱ（0.4NNaOH与2%的SDS等体积混合），盖紧管口，快速翻倒离心管5-6次，静置3-5分钟，不可超过5分钟。

4.加150ul溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒混匀5-6次，静置5分钟，12000转/分，离心10分钟。

5.取上清液（约450ul）于另一离心管中，加等体积氯仿（450ul），剧烈振荡混匀，12000转/分离心10分钟。

6.取上情液约400ul于另一离心管，加2倍体积（800ul）的无水乙醇，于－20℃沉淀30分钟。

7.12000转/分离心10分钟，弃上清，70％乙醇洗一次。

8.干燥，加20-30ul含RNase的无菌水，于37℃溶解（消化）30分钟，若暂时不用，于－20℃保存。

五、作业

简述本试验使用的各种试剂在质粒DNA提取中的作用。

实验五质粒DNA酶切处理

一、实验目的

通过本实验掌握采用限制性内切酶酶切DNA作用的原理和操作方法，并了解限制性内切酶酶切DNA的各种影响因素。

二、实验原理

大多数限制性内切酶识别4~6个具有回文对称性质的碱基，本实验所用的内切酶EcoRI能识别6个碱基的靶序列，它们的剪切方式分别是：

GAATTC

CTTAAG

三、实验步骤

取1个无菌离心管按如下顺序及要求操作：

1.加16ul无菌水。

2.加3ulEcoRI10*缓冲液。

3.加入10ul上次试验（试验五）提取的质粒。

4.加1ul内切酶EcoRI（15个作用单位）。

5.混匀，37ºC保温1个小时。

6.电泳分析或-20ºC保存备用。

四、作业

分析可能影响内切酶作用的各种因素。

实验六PCR技术扩增DNA

一、实验目的

通过本实验掌握利用PCR技术扩增目的DNA的原理和操作方法。

二、实验原理

通过酶促反应在体外成百万倍地扩增一段目的基因，它是基于位于待扩增目的基因两端的两个引物（primer）与该目的基因序列退火而后延伸最终达到扩增目的的。

大致过程：

变性退火延伸

（94~98ºC）（37~65ºC）（72ºC）

变性、退火、延伸n次循环

三、实验步骤

1.在一个灭菌的新的离心管中按如下顺序及要求操作：

无菌水19ul

10*缓冲液5ul

MgCl24ul

dNTP1ul混匀

引物35ul（50pmol）

引物45ul（50pmol）

母板DNA2ul（100ng）

Taq酶5ul（一个作用单位）

2.在PCR仪上进行循环扩增

反应程序：

94ºC预变性5min

94ºC变性40sec

55ºC退火40sec30个循环

72ºC延伸45sec

72ºC延伸10min

四、作业

1.分析影响PCR结果的各种可能的因素。

2.在反应程序中，你认为最有可能导致非特异性扩增的过程是哪一步？

实验七DNA的琼脂糖凝胶电泳检测及回收

一、实验目的

1.学习电泳法测定DNA浓度与纯度的方法；

2.了解电泳过程中各种因素对结果的影响；

3.掌握制胶、电泳等基本操作技术。

二、实验原理

DNA的等电点偏酸，当处于电泳条件（PH=8）时，DNA链上带有负电荷，在电场力的作用下会向正极泳动，由于DNA链上负电荷的增加伴随着DNA分子质量的增加而增加。

所以，实际上DNA分子的荷质比始终是一常数，电泳中分离DNA靠的是分子的大小与构型的不同。

三、实验步骤

1.配制琼脂糖凝胶

琼脂糖+TAE或TBE缓冲液+EB（溴乙锭）

2.点样样品

总DNA、总RNA、质粒酶切DNA、重组DNA、PCR产物、标准DNA

3.制样：

浓度为0.5ug/ulDNA样品5ul+2ul溴酚蓝于封口膜上混合

4.加样

5.70V稳压电泳约2小时

6.紫外分析仪观察并分析电泳结果

四、作业

1.分析可能影响琼脂糖凝胶电泳的各种因素。

2.对你所加的各种样品在凝胶上显示的条带状态进行详细说明。

实验八DNA片段的重组

一、实验目的

通过本实验掌握DNA连接酶连接DNA的原理和操作方法，并了解影响连接酶作用的各种因素。

二、实验原理

T4连接酶能催化双链DNA的3’-OH与5’-P末端之间生成磷酸二酯键，并能在不需要其他催化剂的条件下进行末端连接反应。

三、实验材料

已单酶切的pBR322质粒DNA（或已单酶切的实验六质粒DNA）、T4连接酶

三、实验步骤

取两个无菌离心管按如下顺序及要求操作：

1.加4ul的已酶切的质粒DNA，或加上次酶切的pBR322DNA4ul。

2.加2ul的10*缓冲液（T4连接酶缓冲液）

3.加无菌去离子水12ul或根据体积总数推算得6ul。

4.加T4DNA连接酶2ul。

5.这样总反应体积20ul，振荡，离心3~5秒。

6.22ºC保温4小时，65度水浴10分钟。

五、作业

1.认真完成实验操作，为以后实验准备材料。

2.分析可能影响连接酶作用的各种因素。

实验九大肠杆菌感受态细胞制备

一、实验目的

1.掌握采用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞方法；

2.了解制备大肠杆菌感受态细胞操作过程中各种可能的影响因素。

二、实验原理

将正在生长的大肠杆菌在低温（0ºC）下加到低渗CaCl2溶液中，会造成大肠杆菌细胞膨胀（形成原生质球），由此可人工诱导大肠杆菌呈现易于接受外源DNA的感受态状态。

三、实验步骤（所有操作必须在超净工作台上进行）

1.取10ml菌液

2.冰上冷却10min

3.4000rpm/min离心10min（4ºC）

4.弃上清液

5.用4ml冰冷0.1mol/LCaCl2悬浮细胞

6.冰上放置25min

7.4000rpm/min离心10min（4ºC）

8.弃上清液

9.用1ml冰冷0.1mol/LCaCl2悬浮菌体

10.制备甘油保菌管于-70ºC保存备用（甘油终浓度为15%）

四、作业

叙述CaCl2在制备大肠杆菌感受态细胞中的作用。

实验十外源基因遗传转化

一、实验目的

通过实验掌握将重组DNA转化感受态大肠杆菌的操作方法。

二、实验原理

大肠杆菌在低温时由低渗CaCl2的作用下细胞膨胀形成原生质球，同加入在转化混合物中的重组质粒DNA形成一种粘着在细胞表面上的对Dnase抗性的复合物。

当温度升为42ºC（热激处理）时，这种复合物便会被细胞所吸收。

在富裕培养基中生长一段时间使转化基因实现表达后，再涂布在选择性的培养基中即可分离转化子。

三、实验步骤（所有操作必须在超净工作台上进行）

1.取50ul感受态细胞加入一无菌离心管。

2.加5ul重组载体。

3.冰上放置30’。

4.42ºC热激处理2’

5.0ºC2’

6.加100ul37ºC预热完全培养基（2*YT）

7.37ºC振摇1小时

8.涂布平板，培养过夜。

第二天观察转化结果。

四、作业

记录转化子数目，并分析可能影响转化率的原因。

实验十一转基因水稻GUS报告基因检测

一、实验目的

通过本实验掌握在转基因植物中检测GUS报告基因表达活性的操作方法，并掌握通过GUS阳性和阴性分离比推测外源基因整合的拷贝数。

二、实验原理

GUS基因存在某些细菌体内，编码β-葡萄糖醛酸糖苷酶，该酶的作用底物是无色的X-葡萄糖苷酸（简称X-gluc）。

当把表达β-葡萄糖醛酸糖苷酶的转基因植物组织与X-gluc一起温育时，GUS酶就会将反应体系中无色的X-gluc底物水解产生出深蓝色的5-溴-4氯靛蓝。

该反应很容易用普通的生化反应检测出来，GUS基因称为报告基因，在未转基因植物中，这些酶及其所催化的反应几乎完全不存在。

三、实验步骤

1.取转基因稻米和对照稻米各24粒，剥去颖壳。

2.各切1/4胚乳放置于96孔板中，加适量X-gluc溶液8ul。

3.37ºC保温2小时。

4.GUS+、GUS-计数，并计算比值。

四、作业

叙述转基因植物检测的主要方法