分子诊断第 一 章 至第13章.docx

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分子诊断第一章至第13章

分子诊断第一章至第13章

分子诊断第一章至第13章第一章绪论分子生物学的定义：

分子生物学（molecularbiology）是研究核酸、蛋白质等生物大分子的结构与功能，并从分子水平上阐述核酸与蛋白质、蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系及其基因表达调控机制的一门学科。

广义分子生物学：

包括对核酸、蛋白质等生物大分子结构与功能的研究，以及从分子水平上阐明生命的现象和生物学规律。

狭义分子生物学：

偏重于核酸的分子生物学。

主要研究基因或DNA结构与功能、遗传信息的表达及其调控机制等，也涉及到这些过程中相关蛋白质和酶的结构与功能的研究。

分子生物学研究的内容：

按照狭义分子生物学的定义，可将现代分子生物学的研究内容概括为：

1.基因与基因组的结构与功能。

2.遗传信息的传递。

3.基因表达调控机制。

4.基因工程。

5.结构分子生物。

现代分子生物学的发展：

DNA重组技术：

工具酶的发现、DNA的体外连接、载体的构建。

核酸分析技术：

核酸杂交技术、DNA序列分析技术、PCR技术。

基因组研究：

人类基因组计划、模式生物基因组。

基因表达调控：

操纵子调控机制、真核基因调控方式、小分子RNA的研究。

细胞信号转导研究：

G蛋白偶联信号转导、各种受体分子的研究。

技术应用成果：

癌基因的发现、转基因技术、基因诊断和治疗、生物药物生产。

分子生物学发展趋势：

功能基因组学蛋白质组学生物信息学。

医学分子生物学定义：

定义：

主要研究人体生物大分子的结构、功能、相互作用及其同疾病发生、发展的关系。

研究内容：

主要研究人体发育、分化和衰老、细胞增殖调控、三大功能调控系统（神经、内分泌和免疫）的分子生物学基础；基因结构异常或调控异常与疾病发生、发展的关系；基因诊断、治疗和预防；生物制药。

在基础医学中的应用：

在分子水平上对人的生理功能和病理机制进行研究；出现新的边缘学科分子生理学、分子药理学、分子病理学、分子遗传学、分子免疫学、分子病原学、分子肿瘤学、分子遗传学、分子神经科学等；各学科在分子水平上进行整合的趋势；形成―反向遗传学‖研究途径。

在疾病诊断中的应用：

以核酸、蛋白质为分析材料；应用分子生物学技术分析基因结构、表达变化及功能改变；检测疾病基因的存在及状态；对遗传性疾病、传染性疾病、肿瘤及其他分子疾病进行诊断。

在临床治疗中的应用：

正常基因导入细胞替代或补充缺陷基因；疾病基因的封闭、敲除；非目标基因产物的协同作用。

分子诊断的理论基础：

病原生物与感染性疾病：

①病原生物基因在人体内的复制②病原生物基因与人体染色体整合，致宿主基因结构异常。

基因变异与分子疾病：

基因变异：

单基因疾病、多基因疾病、线粒体遗传病、恶性肿瘤。

基因多态性分析：

疾病诊断和遗传咨询、器官移植配型和个体识别、多基因病的诊断、基因定位和疾病相关性分析。

基因表达异常：

mRNA表达量异常、mRNA转录及加工缺陷。

第二章核酸的结构和功能核酸：

是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。

核酸的分类及分布：

脱氧核糖核酸：

90%以上分布于细胞核，其余分布于线粒体、叶绿体、质粒等。

携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型（genotype）。

核糖核酸：

分布于胞核、胞液。

参与细胞内DNA遗传信息的表达。

某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。

第一节核苷酸的组成及结构一、核酸的化学组成元素组成：

C、H、O、N、P（9－10%）分子组成：

碱基（base）：

嘌呤碱、嘧啶碱；戊糖（ribose）：

核糖、脱氧核糖；磷酸（phosphate）。

核苷酸水解产物：

核苷酸包括磷酸和核苷，核苷包括碱基和戊糖。

二、核苷酸的结构1.核苷的形成：

碱基和核糖（脱氧核糖）通过糖苷键连接形成核苷（脱氧核苷）。

核苷：

AR,GR,UR,CR脱氧核苷：

dAR,dGR,dTR,dCR核苷：

戊糖与含氮碱基脱水缩合而生成。

假尿嘧啶（）核苷的糖苷键不是C-N键，而是C-C键。

2.核苷酸的结构与命名：

核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。

核苷酸：

AMP,GMP,UMP,CMP脱氧核苷酸：

dAMP,dGMP,dTMP,dCMP。

体内重要的游离核苷酸及其衍生物：

多磷酸核苷酸：

NMP，NDP，NTP；环化核苷酸：

cAMP，cGMP；含核苷酸的生物活性物质：

NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD等都含有AMP。

3.核苷酸的连接：

核苷酸之间以3,5-磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核酸。

三、核酸的一级结构定义：

核酸中核苷酸的排列顺序。

由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。

核酸具有方向性，一端称为5-端，另一端称为3-端。

第二节DNA的空间结构与功能一、DNA的二级结构双螺旋结构㈠DNA双螺旋结构的研究背景：

碱基组成分析Chargaff规则：

[A]=[T][G][C]；碱基的理化数据分析A-T、G-C以氢键配对较合理；DNA纤维的X-线衍射图谱分析。

㈡DNA双螺旋结构模型要点：

DNA分子是反向平行的互补双链结构；骨架：

-脱氧核糖-磷酸-碱基：

―挂‖在主链骨架上。

DNA分子为右手螺旋结构。

螺旋直径为2nm，形成大沟及小沟。

相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。

维系键：

疏水作用力，氢键。

碱基堆积力：

碱基平面之间的疏水作用力。

氢键：

垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对。

碱基互补配对：

A=T;GC；碱基互补配对是半保留复制的基础。

㈢DNA双螺旋结构的多样性二、DNA超螺旋结构及在染色质中的组装㈠DNA的超螺旋结构：

超螺旋结构：

DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。

正超螺旋：

盘绕方向与DNA双螺旋方同相同。

负超螺旋：

盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。

意义：

DNA超螺旋结构整体或局部的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录过程具有关键作用。

㈡原核生物DNA的高级结构㈢DNA在真核生物细胞核内的组装：

真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体。

核小体的组成：

DNA：

约200bp组蛋白：

H1、H2A，H2B、H3、H4。

真核生物中的核小体结构：

DNA双螺旋形成超螺旋结构，再与核内的蛋白质结合，形成核小体的结构。

DNA缠绕八聚体1.75圈，然后与H1连接，形成串珠状结构。

意义：

有规律压缩体积，减少占用的空间。

三、DNA的功能DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。

它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。

基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。

基因：

DNA分子中具有特定生物学功能的片段。

基因组：

一个生物体的全部DNA序列。

因组的大小与生物的复杂性有关，如病毒SV40的基因组大小为5.1103bp，大肠杆菌为5.7106bp，人为3109bp。

第三节RNA的结构与功能RNA通常以单链形式存在，但也可形成局部的双螺旋结构。

RNA分子的种类较多，分子大小变化较大，功能多样化。

RNA的种类、分布：

细胞质RNA：

mRNA、tRNA、rRNA、胞浆小RNA；细胞核RNA：

hnRNA、核酶RNA、SnRNA；线粒体RNA：

mtmRNA、mttRNA、mtrRNA。

一、信使RNAmRNA结构特点：

1.大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2甲基化，形成帽子结构：

m7GpppN-。

2.大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸（polyA）结构，称为多聚A尾。

帽子结构和多聚A尾的功能：

mRNA核内向胞质的转位、mRNA的稳定性维系、翻译起始的调控。

编码区：

mRNA分子中每三个相邻的核苷酸组成一组，在蛋白质翻译合成时代表一个特定的氨基酸，这种核苷酸三联体称为遗传密码。

功能：

为蛋白质的合成提供模板。

mRNA的功能：

为蛋白质的合成提供模板。

把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。

二、转运RNAtRNA的一级结构特点tRNA是分子最小（70～90个核苷酸）；含10-20%稀有碱基，如DHU、等；3末端为CCA-OH（氨基酸臂）；5末端大多数为G；具有TC。

tRNA的二级结构三叶草形：

氨基酸臂：

DHU环、反密码环、额外环、TC环。

3－OH端可以结合氨基酸，反密码环可以与mRNA上的密码子配对，将合适的氨基酸携带到合适的位置。

tRNA的功能：

特异性活化、转运氨基酸；识别mRNA密码子，参与蛋白质合成。

命名原则：

tRNATyr：

可以和Tyr结合的tRNA；Tyr-tRNATyr：

结合了Tyr的tRNA。

tRNA的三级结构倒L形三、核蛋白体rRNA是细胞中含量最多的RNA，占总量的80%。

rRNA的功能：

参与组成核蛋白体，作为蛋白质生物合成的场所。

rRNA的种类（根据沉降系数）：

真核生物：

5SrRNA、28SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA原核生物：

5SrRNA、23SrRNA、16SrRNA。

核蛋白体的组成四、其他小分子RNA及RNA组学SnmRNAs：

除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA（smallnon-messengerRNAs,snmRNAs）。

snmRNAs的种类：

核内小RNA、核仁小RNA、胞质小RNA、催化性小RNA、小片段干涉RNA。

snmRNAs的功能：

参与hnRNA和rRNA的加工和转运。

RNA组学：

RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。

同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。

第四节核酸的理化性质一、核酸的一般理化性质核酸具有酸性；DNA分子粘度大；RNA分子粘度小；能吸收紫外光，最大吸收峰为260nm。

可用于核酸的定性和定量测定。

核酸的大小表示：

碱基对bp；长度单位um；分子量Da；核酸的脆性。

OD260的应用：

1.DNA或RNA的定量：

OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA，40g/ml单链DNA（或RNA），20g/ml寡核苷酸。

2、判断核酸样品的纯度：

DNA纯品：

OD260/OD280=1.8RNA纯品：

OD260/OD280=2.0二、DNA的变性定义：

在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。

方法：

过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。

变性后其它理化性质变化：

增色效应、粘度下降、比旋度下降、浮力密度升高、酸碱滴定曲线改变、生物活性丧失。

DNA变性的本质是双链间氢键的断裂。

解链曲线：

如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。

Tm：

变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度（meltingtemperature,Tm）。

Tm的高低与DNA分子中G+C的含量有关，G+C的含量越高，则Tm越高。

三、DNA的复性DNA复性（renaturation）的定义：

在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。

热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火。

减色效应：

DNA复性时，其溶液OD260降低四、分子杂交与探针技术两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，在适宜的条件（温度及离子强度）下，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交。

核酸杂交可以是DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交，RNA-RNA杂交。

不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序。

探针技术：

利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的DNA或RNA片段。

在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记。

这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为探针。

核酸分子杂交的应用：

研究DNA分子中某一种基因的位置；定两种核酸分子间的序列相似性；检测某些专一序列在待检样品中存在与否；是基因芯片技术的基础。

第五节核酸酶核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。

依据底物不同分类：

DNA酶（DNase）：

专一降解DNA。

RNA酶（RNase）：

专一降解RNA。

依据切割部位不同：

核酸内切酶：

分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶。

核酸外切酶：

53或35核酸外切酶。

核酸酶的功能：

生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解。

参与DNA的合成与修复及RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程；负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸；在消化液中降解食物中的核酸以利吸收；体外重组DNA技术中的重要工具酶。

催化性RNA：

作为序列特异性的核酸内切酶降解mRNA。

催化性DNA：

人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。

第三章基因组和基因组学基因定义：

基因是决定一定功能产物的DNA序列（片断），是遗传的结构和功能单位。

功能产物：

RNA和蛋白质。

染色体组：

每个生殖细胞中的全部染色体称为一个染色体组。

人体体细胞内含两个染色体组。

基因组：

每个染色体组的DNA构成一个基因组。

广义的基因组包括细胞核染色体基因组和细胞质中的线粒体基因组。

是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质。

基因组学：

是指对所有基因进行基因组作图，核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析。

第一节原核生物基因组原核生物的生命活动：

1）可进行基因复制；2）复杂的代谢活动：

（获取自身所需的能量、合成自身生长所需的原料）；3）适应环境的变化（调节自身的酶系统组成及功能、调节细胞内某种蛋白质的数量）一、原核生物基因组一般特征1）DNA较小，一般为106~107碱基对、2）基因数目较少，大约为3500个基因、3）通常为一条环状双链DNA（dsDNA）、4）只有一个DNA复制起始点、5）GC含量差异很大，25%~75%之间，可用于推测细菌的种类

（一）原核生物的类核结构：

1）基因组DNA位于细胞中央的核区，无核膜；2）形成类核结构，中央为RNA和支架蛋白，外围是双链闭环的超螺旋DNA。

（二）原核生物的操纵子结构：

是指数个功能上相关联的结构基因串联在一起，连同上游的调控区（包括调节基因、启动子、操纵基因）以及下游的转录终止信号，共同组成的一个基因表达单位。

（三）原核生物的结构基因：

1）结构基因是连续的，无内含子成分；2）多顺反子结构；3）多数为单拷贝基因，编码rRNA、tRNA的基因为多拷贝；4）结构基因的编码顺序一般不重叠。

＊基因重叠是指基因组DNA中某些顺序被两个及以上基因所共用（四）具有编码同功酶的基因：

表达功能相同的产物的一类基因，但基因结构不完全相同。

二、质粒指细菌细胞染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状DNA分子

（一）质粒的结构及理化性质：

1）环状双链超螺旋DNA分子；2）分子量4106~1108D；3）可发生构象变化，出现超螺旋、半开环、线状三种构象；4）具有较强的抗切割和抗变性的能力。

（二）质粒的命名与分类：

命名：

用p代表质粒，后面用两个大写字母代表作者或实验室名称及编号。

如pUC118分类：

可根据复制机制、功能、转移方式、大小以及对宿主的依赖程度不同进行分类。

复制机制：

严紧型质粒、松弛型质粒；质粒功能：

F质粒（性质粒）、R质粒（抗药性质粒）、Col质粒（大肠杆菌素生长因子）；转移方式：

结合型质粒、可移动型质粒、自传递型质粒；质粒的宿主范围：

窄宿主谱型质粒、广宿主谱型质粒。

（三）质粒的生物学特性：

1可移动性；2）自我复制的能力；3）携带筛选标记（抗药性基因、营养缺陷型基因、抗重金属基因、抗紫外线／X射线抗性基因）；4）不相容性。

三、可移动的DNA序列定义：

又称转座因子或转座元件。

是一类在细菌染色体、质粒或噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立DNA序列。

是基因重组的一种方式。

分类：

可分为三类：

插入序列、转座子、可转座的噬菌体

（一）插入序列：

具有转座能力的简单遗传因子，长度一般小于2kb。

IS因子只含有与转座有关的基因与序列。

共同特征是在其末端都具有一段反向的重复序列（IR）。

（二）转座子：

每个转座子都带有3个基因：

一个是编码对氨苄青霉素抗性的内酰胺酶（-lactamase）基因，其它二个是编码与转座作用有关的基因（TnpA和TnpR）。

（三）可转座的噬菌体：

是一类温和型噬菌体，如Mu噬菌体。

（四）转座子的遗传效应：

引起突变、引入新的基因、基因重排第三节真核生物基因组一、真核基因组一般特征1）细胞核基因组含有两份同源基因组（二倍体）；2）核外基因组可有多个拷贝、3）基因组庞大，但非编码序列占90%以上；4）转录产物为单顺反子；5）细胞核基因组存在重复序列；6）基因是不连续的断裂基因；7）线性双链DNA分子，眼型复制模式、8）分细胞核基因组和细胞核外基因组。

（一）单顺反子结构：

单顺反子：

一个结构基因经过转录生成一个单顺反子mRNA分子，翻译成1条多肽链。

（二）断裂基因：

真核细胞的结构基因内部大多由不连续的几个编码序列所组成，之间插入非编码的间隔序列；真核生物基因之间存在非编码区，称为间隔区DNA（spacerDNA），是结构基因彼此分开。

内含子与外显子：

1.内含子：

是结构基因的非编码序列，与编码序列间隔排列。

2.外显子:

是结构基因的编码序列。

基因转录后，剪去内含子，拼接外显子成为成熟的mRNA（三）重复序列高度重复序列：

1）在真核生物基因组中普遍存在，约占10%~60%，占人类基因组约20%；2）重复频率达106以上；3）重复片段10～300bp；4）复性速率高；5）可为反向重复序列或顺向重复