外泌体蛋白质组学研究进展图文精.docx

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外泌体蛋白质组学研究进展图文精

临床检验杂志2016年12月第34卷第12期ChinJClinLabSci,Dec.2016,V01.34,No.12

DOI:

10.13602/ki.jcls.2016.12.11

外泌体蛋白质组学研究进展宰

・927・・综述・

覃思华,郑磊（南方医科大学南方医院检验科,广州510515

摘要:

外泌体（exosome是一类由体内多种活细胞分泌的纳米级的双层膜结构小囊泡。

可携带包含亲代细胞信息的核酸、蛋白质和脂质等。

大多数外泌体有特殊的功能,可能与细胞信号转导功能相关。

现已发现外泌体参与疾病进展、肿瘤血管生成、免疫监视等多个环节。

外泌体中蛋白质是参与疾病发生、发展的重要部分。

该文总结外泌体蛋白质组学的研究思路及方法,综述目前外泌体蛋白质的临床作用,并对外泌体蛋白质组学研究面临的挑战和前景进行分析与评述。

关键词:

外泌体;蛋白质组学;疾病

中图分类号:

R446文献标志码:

A

20世纪80年代,Johnstone等¨1发现网织红细胞在成熟过程中分泌的小囊泡可以传递转铁蛋白,并首次将这种囊泡亚型命名为exosome（即外泌体。

外泌体可通过传递信息影响靶细胞的功能,激活细胞信号通路,在免疫、凝血、肿瘤等生理病理过程中发挥作用。

而其中蛋白质差异表达是区分不同来源外泌体的重要特点,是研究外泌体起源的重要途径旧J。

与核酸相比,外泌体蛋白质的差异表达更难被检测出来,并且常规的分离方法极易携带蛋白质污染,是外泌体蛋白质组学研究主要面临的难题,也限制了蛋白质研究的发展。

但是,随着蛋白质组学技术的快速更新,外泌体特异蛋白质的研究将具有巨大的前景。

1外泌体及其结构功能

外泌体是细胞进化过程中内出芽形成的多泡体释放的一类直径为30~100am的脂质双层膜的小囊泡,可由各种类型的细胞分泌,也可在各种体液中分离出来,包括血液、尿液、唾液、滑膜液、乳汁、脑脊液等。

外泌体携带着大量的细胞特异的生物活性分子,如核酸、蛋白质、脂类和糖类等,这些物质经过亲代细胞选择和特殊包装而进入外泌体,是激发信号转导机制的关键,在机体很多生理病理过程中发挥重要的作用,如免疫调节[3J、动脉粥样硬化Ho、肿瘤药物抵抗垆1、抗病毒㈣等。

外泌体起源于胞内体途径。

细胞内吞的囊泡被分类并到达溶酶体和细胞膜。

瑚J。

早期核内体与细胞内吞的囊泡融合,将囊泡中回收、退化或胞外分泌的部分吸收,成为再生的早期核内体。

这些核内体经历一系列转化后成为晚期核内体。

在此转化过程中,晚期核内体逐渐形成多泡小体（mul-tivesicularbodies,MVBs,而其中30~100nln的囊泡从多泡小体的管腔出芽一J。

多泡小体可以与溶酶体融合,参与溶酶体途径,或参与分泌途径,与质膜融合¨1。

溶酶体途径将导致内容物降解,而分泌途径中形成外泌体释放到细胞外微环境。

以上一系列从核内体复合物到外泌体的形成过程需要内体分选转运蛋白复合物（ESCRT和其他相关蛋白质如Alix[7]。

外泌体是由胞外分泌产生的,不同的脂质与脂质相关的酶也控制着外泌体的分泌过程¨…。

也有的理论强调胞质蛋白半乳凝集素5（galectin-5参与了核内体和外泌体的释放¨1。

所以蛋白质对于外泌体的产生和发挥生理功能都有着重要作用¨“。

目前的研究常以外泌体蛋白在细胞中的定位进行分类。

外泌体中细胞质蛋白最丰富,在体液中可达47%,在细胞上清中为43%,其次是膜蛋白（体液和细胞上清中分别为28%和34%,核酸和线粒体蛋白则较低,大部分的膜蛋白和细胞质蛋白在外泌体中较保守,这在不同来源的外泌体中均已被证实¨3|。

另一种分类方法主要将蛋白质分为两大类。

一类是非特异性蛋白质,大部分是来源于亲代细胞中保守区域的细胞质和膜蛋白,如细胞骨架蛋白[肌动蛋白（actins、微管蛋白（tubulins、埃兹蛋白（ezrin、膜突蛋白（moesin],新陈代谢相关的酶[磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH、烯醇化酶1（enolase1、磷酸甘油酸激酶1（PGKl、丙酮酸激酶2（PKM2],核糖体蛋白,跨膜蛋白[多聚免疫球蛋白受体（PIGR、溶酶体相关膜蛋白1（LAMPl、CD59],膜联蛋白（annexins,热休克蛋白,粘附蛋白[整合素（integrin8、乳腺肪球因子8（MFGE8]等,这些蛋白质可能参与上述的外泌体的合成过程。

另一类则是不同来源外泌体的特异性蛋白质,经质谱研究发现其携带了4400余种特异性蛋白质¨“。

这类蛋白质可能与细胞信号转导功能相关,在免疫、凝血、肿瘤等生理病理过程中发挥作用,在不同的生理病理条件下有表达差异,因此更具备生物学标志物的潜力。

体液中的外泌体蛋白质受血液高丰度蛋白质干扰少、表达稳定,使其较血液中传统的可溶性诊断分子更有意义。

外泌体还携带了特异的信息,介导疾病的发生发展,具有作为生物学标志物的潜力。

2外泌体的分离及鉴定

2.1外泌体的分离和纯化外泌体蛋白质组学研究的前提是获取均匀的无污染的囊泡蛋白产物,故要排除病毒、杂蛋白和外泌体聚集等影响。

不同提取方法获得外泌体的回收率、纯度和颗粒完整性差异较大,目前仍缺乏统一标准的分离方法¨“。

Lobb等¨刮对蔗糖密度梯度离心法、差速超速离心法、尺寸排阻（sizeexclusionisolation,SEC法、沉淀法、超

木基金项目:

国家自然科学基金（81371901;广州市科技计划资助项目（1563000220;广州市健康医疗重大专项（201604020015。

作者简介:

覃思华,1991年生,女,技师,硕士,研究方向:

细胞外囊泡作为疾病诊断标志物。

通信作者:

郑磊,教授,博士,E・mail:

nfyyzhenglei@8ran.edu.C11。

万方数据

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滤法获得的产物进行了初步的表征分析,提出使用每微克蛋白质的颗粒浓度来衡量分离产物的纯度,结果发现沉淀法的回收产率最高但纯度最低,提示得到的产物中有大量的蛋白质并不属于外泌体;超高速离心可能会造成较大损耗,也损伤囊泡,导致分离效果稳定性差;而血浆外泌体分离SEC法产物纯度可与超速离心法相媲美,甚至高于蔗糖密度梯度离心法。

也有一些研究以外泌体表面标志蛋白质为基础,利用与磁珠或其他固定相以共价键或高亲和作用连接的抗体,再通过低速离心或磁场的物理方法将固相流动相分离,达到免疫亲和分离外泌体的目的¨“。

进行蛋白质组学研究的分离要求远高于核酸分析,因为回收产物中蛋白质污染最难去除,也很难保持产物的同质性,这是外泌体蛋白组学研究受限的最主要的原因¨2|。

Abramowicz等Ⅲ1对差速超速离心法、蔗糖密度梯度离心法或碘克沙醇离心法、化学沉淀法、凝胶过滤法、免疫捕获法获得外泌体进行分析,认为目前阶段适宜开展蛋白质组学的研究方法为差速超速离心法与碘克沙醇或蔗糖密度梯度离心或凝胶过滤相结合,此法为制备超大量外泌体进行大规模质谱分析提供了可行的方案。

2。

2外泌体的鉴定成功分离出均匀无污染的外泌体后要对产物进行鉴定,鉴定一般从以下几个方面进行:

定量外泌体浓度和粒径、电镜直接观察其大小形态和鉴定表面蛋白质标志。

纳米颗粒跟踪分析技术常用于定量外泌体浓度和粒径,根据粒子布朗运动轨迹计算外泌体浓度和粒径,易受其他污染蛋白质或与外泌体粒子直径相近的粒子影响¨5|。

电镜对于外泌体的形态学、大小、标志物存在的观察都很有价值,但在浓度测量方面价值有限。

而仅通过外泌体表面的常用蛋白质标志[CD63、CD9、肿瘤易感基因101（TSGl01等]的免疫印迹实验不能判断这些蛋白质是否来自外泌体,也不能判断其是否存在污染¨…。

因此实验中需将几种鉴定方法联合使用。

3外泌体蛋白质组学分析

常用的技术有双向凝胶电泳、液相色谱、质谱等。

在外泌体研究中,单一的技术无法满足研究全面需要,故实验室内常将几种技术联合使用。

3.1外泌体蛋白质表达模式研究蛋白质表达模式是研究外泌体内的蛋白质的组成并了解其生物学信息。

通过凝胶电泳或质谱手段,获取不同样本来源外泌体内不同的蛋白质组成,分析其成为生物学标志物的可能性,发现特异的蛋白质成分或表达量的差别从而应用于临床。

Melo等¨引通过超高液相质谱联用发现一种细胞膜锚定蛋白磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（glypican.1,GPCI在肿瘤细胞分泌的囊泡中特异性高表达,随后在胰腺癌患者血清外泌体中验证了该蛋白质具有极高的特异性和敏感性,将其与常规标志物CAl99相比,表明其更能预测术后的生存期及肿瘤负荷,还在转基因小鼠模型中通过该蛋白质预测胰腺癌情况,确定其是早期胰腺癌特异性的生物学标志物。

而膜蛋白较胞质蛋白更易检测,从临床方面可以分析其成为生物学标志物的可能性,并进行大规模的临床验证,评价其临床应用价值。

另一方面,通过各种蛋白质组学技术获得蛋白质表达谱及蛋白质相互作用信息进行基因功能深层预测四1,再进行下一步的功能研究或通过预测信息展开更深层次的基因功能的研究。

如Clark等口¨在2015年分离非小细胞肺癌两种不同细胞系及正常人支气管上皮细胞上清中的外泌体,然后用细胞培养稳定同位素标记技术（SILAC定量蛋白组学分析筛出3组之间差异蛋白721个,并对其两两比较分析其差异蛋白质的功能分析预测,发现肺癌细胞外泌体蛋白质在细胞侵袭、血管生成及增殖中起作用,还可调节受体细胞的增殖能力,揭示了外泌体蛋白质在肺癌进展过程中有重要作用。

3.2外泌体蛋白质功能模式研究大量的研究主要是对细胞上清中的外泌体蛋白质定性后研究其生物学功能,其中肿瘤来源外泌体蛋白质研究最多。

研究通常从两方面着手,一是某蛋白质的生物学功能及作用已明确,而现发现其发挥作用与外泌体有密不可分的重要关联。

如外泌体分泌的HSP90a增强细胞运动能力旧J,胰腺及脑部肿瘤外泌体中表皮生长因子受体（EGFR对细胞增殖有影响旧剖,乳腺及结直肠肿瘤细胞来源的外泌体中双调蛋白可影响肿瘤侵袭m。

EB病毒感染的鼻咽癌来源的外泌体中EB病毒潜伏膜蛋白1（LMPl可激活ERK和P13K/AKT信号通路旧“,这些蛋白质大多通过激活信号转导途径发挥作用,对肿瘤的发生发展有重要作用。

另一方面则从表达谱中筛选出特异蛋白质,并研究其生物学功能及相关信号通路。

通过蛋白质组学研究在几种肿瘤转移模型中整合素的表达模式,发现在肺转移中外泌体整合素面阳和西B1起关键作用,而外泌体中整合素otvB5在肝转移中起关键作用,如果下调整合素面p4和（xv凹,能分别阻止肝、肺转移,表明被特定器官的细胞获取的肿瘤外泌体可为肿瘤的转移准备转移前微环境;外泌体整合素可激活Sre磷酸化以及促炎症反应S100基因表达,可作为预测肿瘤转移的器官倾向性的诊断指标ⅢJ。

L卜zflr等旧1分析脂肪细胞来源的外泌体蛋白质组学,发现其携带脂肪酸氧化相关的蛋白质,这些蛋白质可影响黑色素瘤细胞的脂肪酸氧化水平,揭示肥胖的黑色素瘤患者预后较差的部分机制。

3.3外泌体蛋白翻译后研究蛋白质组学的研究还包括一些蛋白质翻译后的研究,是深入开展蛋白组学后期研究的方向。

对囊泡蛋白翻译后修饰（PTMs进行研究并不多见。

糖基化就是一个重要PTM现象,对生物学进程有重要影响。

Escrevente等Ⅲo通过凝集素印迹、正相高效液相色谱法（NP-HPLC和质谱方法分析卵巢癌细胞外泌体的糖基化现象,发现半乳凝集素3结合蛋白在卵巢癌细胞外泌体中高表达,聚合物和高甘露聚糖也都在外泌体中被发现。

磷酸化在细胞信号通路中也是一个重要的PTM现象。

Gonzales等¨¨证明尿液囊泡中有14种磷酸化蛋白。

也有人研究了囊泡的磷酸化与年龄相关性的黄斑退化的关系口“。

在囊泡中目前证实的PTM还有泛素化、类泛素化、甲基化、氧化、亚硝基化、棕榈酰化、豆蔻酰化、法尼基化等p“,只是这些FFM在囊泡的功能和蛋白质分选中的作用还有待研究。

因为分离纯化方法受限,这些研究仅在包含外泌体的囊泡类的物质中开展,而外泌体是否参与这些过程仍有待研究。

4外泌体蛋自质组学临床应甩

外泌体蛋白质组学研究在疾病发生发展、诊断治疗以及预后方面都有着巨大的前景。

与传统循环标志物如细胞因子、激素相比,外泌体可在体液中稳定存在且半衰期长,加之

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临床检验杂志2016年12月第34卷第12期ChinJClinLabSci,Dec.2016,V01.34,No.12

脂质双分子层的保护作用,外泌体能运送蛋白质等生物信息

物质至靶器官;与细针穿刺和组织病理检查相比,体液标本

取材方便,创伤小,患者更易接受,便于多次取材,可应用于

临床实时动态个体化诊疗中。

Melo等m1通过蛋白质组学技・929・

术发现外泌体中GPCI可作为早期诊断胰腺癌的标志物,特异性可达100%。

从血清来源的外泌体中发现发育调节基因蛋白（Del.1则可早期诊断乳腺癌㈨。

表1列举目前各种来源的外泌体蛋白质在临床中的应用。

表1目前外泌体蛋白质在临床中的应用

5展望

目前对于外泌体的研究仍存在困难,尤其是蛋白质组学对外泌体质量要求更高,外泌体分离技术的提高和改进,后续鉴定方法的标准化都需要进一步研究。

细胞外囊泡、外泌体、微粒体甚至凋亡小体等由于产生方式不同,通过目前简单的区别方式分离到的囊泡仍存在混杂情况,早期研究中认为成分单一的外泌体,实际与其他类型囊泡混杂在一起,体液中还存在种类间过渡型囊泡H“。

这些都使确定外泌体的功能变得更加复杂,在解释外泌体的生物学作用时也应更加谨慎。

而展开蛋白质组学研究更应注意解决这些问题。

在过去的几年中,随着人们对外泌体研究的不断深入,人们逐渐认识到外泌体对调节信息交换起到的重要作用。

随着高通量技术的发展,对包括外泌体在内的囊泡的分子组成及功能的了解越发成熟,其中有两个公共数据库（EVpe-dia㈣1和Vesiclepedia旧o收录的许多囊泡研究的数据可供研究者使用。

蛋白值组学作为后基因时代重要的研究方法,对于外泌体更应结合基因组、转录组和蛋白质组才能更好更全面地展开研究并实现应用。

目前外泌体研究多为基础研究,其在临床中的重要作用仍有很大研究空间。

研究者们应充分掌握外泌体蛋白值组学研究现状,把握好研究思路与方法,才能使外泌体蛋白质组学研究取得飞跃。

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