MTT配制原理操作步骤结果分析注意事项.docx
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MTT配制原理操作步骤结果分析注意事项
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项
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一、MTT是什么
MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-（4,5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：
噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
（可参考Sigma，货号M5655，ThiazolylBlueTetrazoliumBromide）
二、MTT法用来做什么
简单地说：
是一种检测细胞存活和生长的方法。
MTT主要有两个用途
1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；
2．细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何MTT可以用来做上述工作
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
四、实验所需材料
1．MTT溶液的配制通常MTT配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g
1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具休做法：
预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20mlPBS，从中先吸取500-1000ulPBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光（避光袋或是黑纸、锡箔纸包住）可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
1.2对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。
注意事项：
l在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
l配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感
lMTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
lMTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.
2．MTT甲瓒溶解液
2.1二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。
2.2三联溶解液：
SDS10g，异丁醇5ml，10MHCl0.1ml用双蒸水溶解配成100ml溶液（文献方法：
周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：
455-457），该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。
（个人觉得其溶解的能力不如DMSO强）
该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。
五、MTT法实验步骤
1:
胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。
细胞详细计数方法请参照中的相关文章。
对于初学者而言，要使细胞达到5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。
以一般细胞培养常用的25cm2为例，
1）细胞密度在长到约80%~90%（下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态），消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。
2）另取一支新的15ml无菌离心管（为下一步接种96孔板用），装入约9ml培养基.
3）从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml,加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞（见下图）；如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。
4）细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以（相当于细胞悬液密度为2×104/ml），细胞毒性实验每孔5000—10000个（相当于细胞悬液密度为5×104/ml）。
此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。
比如：
生长较快的细胞密度可略小。
2．将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul,这样待测细胞的密度为5000—10000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。
● 注意：
因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。
-
3. 将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以反应真实情况。
下图可做为96孔板的的参考步局。
● 对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。
但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉（可以用排枪吸走）再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。
另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。
4. 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。
下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。
5. 每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
6. 终止培养，准备溶解结晶。
● 溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解
1） MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。
将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。
有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。
个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。
采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。
2） 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡
10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
● 另一种方法，用三联溶解液（见上面MTT甲瓒溶解液）
1） MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。
这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。
（该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。
）
2） 放入培养箱中继续孵育4
—6小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。
通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。
如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。
如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。
在实际的操作过程中，往往为了等待4—6小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值，给实验者带来了很大的不方便。
个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对OD值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。
7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
六、-
MTT结果分析
关于如何计算IC50
1、改良寇式法:
lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4）
Xm:
lg最大剂量
I:
lg（最大剂量/相临剂量）
P:
阳性反应率之和
Pm:
最大阳性反应率
Pn:
最小阳性反应率
举个例子：
各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT值如下
药物浓度ug/ml
100
50
25
12.5
6.25
3.125
0
OD均值
0.080
0.093
-
0.236
0.374
0.441
0.531
0.614
公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率
抑制率=1-加药组OD值
-
/对照组OD值，如对于100ug/ml的药物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各组抑制率如下：
药物浓度ug/ml
100
50
25
12.5
MTT所有问题大汇总
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实验前应明确的问题
1.选择适当的细胞接种浓度。
一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。
但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。
这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。
否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2.药物浓度的设定。
一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。
根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。
切记！
否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3.时间点的设定。
在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。
4.培养时间。
200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。
5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。
做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6.理论未必都是对的。
要根据自己的实际情况调整。
7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。
调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。
对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8.避免血清干扰。
用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。
由于试验本底增加，会试验敏感性。
因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。
在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
实验步骤
贴壁细胞：
1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况
3.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5.终止培养，小心吸去孔内培养液。
6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）
悬浮细胞：
1.收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul；②加ActinomycinD（有毒性）10ul用培养液稀释（储存液100ug/ml，需预试寻找最佳稀释度，1：
10-1：
20）；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。
每板设对照（加100ul1640）。
2.置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。
（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
4.离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
MTT的配制
MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
配制MTT时用用PBS溶解，也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。
PBS配方：
NaCl8g
Kcl0.2g
Na2HPO41.44g
KH2PO40.24g
调ph7.4
定容1L
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