重庆大学考研分子生物学题库+答案备课讲稿Word下载.docx

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载体含有LacZ的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。

在这个编码区中插入了一个多克隆位点。

当这种载体进入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞后（质粒和宿主细胞编码的片段各自都没有酶活性），它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫α互补。

由α互补而产生的 

Lac+ 

细菌在呈色底物 

X-gal和诱导剂IPTG存在下形成蓝色菌落。

当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无α互补能力的氨基端片段。

因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。

通过呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。

通过小量制备质粒DNA进行限制酶切分析，即可确定这些质粒的结构。

4.简述菌落PCR筛选

该方法是以转化菌单个克隆为模板，采用特异性引物或通用引物对目的基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳等手段来鉴定筛选阳性转化子，最后可以经提取质粒DNA进行酶切和质粒PCR双重鉴定以及测序分析进一步确认菌落PCR的结果。

5.简述杂交探针技术的原理和方法

在制备好合适的基因文库后，如果用可获得目的基因的互补DNA或RNA做探针，就可以利用核酸杂交技术鉴定出特定的重组体克隆。

原理：

任两条单链核酸分子都有相互形成碱基对的趋势，但形成的大多数分子对由于只有少数链间氢键形成，杂交结构并不稳定，如果多聚核苷酸链是互补的，碱基对的大量形成使双链分子稳定。

步骤：

1、把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维膜上，处理除去杂质，只留下DNA，使DNA分子变性，双螺旋之间的氢键断裂

2、短时间的加热会使这些单链DNA分子牢固结合到膜上。

DNA分子与膜结合其碱基是自由的，可以自由配对。

3、然后把探针加上标签，加热变性，再加到适宜核酸退火的化学溶液中与膜结合。

经过一段时间，等杂交发生后，洗去没有结合的探针，干燥，检测结合的探针的位置，从而筛选出想要获得阳性克隆。

6.对天然质粒的人工构建、改造通常需要对质粒哪些方面进行操作、改进?

对于天然质粒应该做以下几方面的操作、改进：

1.删除一些非必要的区段及对宿主有不良影响的区段

2.削减载体的分子量，是载体具有更大的容纳外源片段的能力

3.加上易于选择或检测的标记，以便筛选出阳性克隆

4.限制性内切酶的酶切位点的改造，便于外源基因插入到载体的特定位置

5.加上一些调控元件，有利于基因的表达

6.安全性改造（因为是简答题，以下四点可以不要，但建议最好要）:

（1）非传递性和不被带动转移。

在基因工程操作中，不希望载体能够进行自主传递，也不希望被带动转移；

（2）具有条件致死突变。

如温度敏感时就丧失复制能力，可防止克隆基因扩散，只存在于限定的宿主细胞中；

（3）一般情况下不希望与宿主染色体发生重组，因为重组后可能给宿主带来突变；

（4）有较小的宿主范围。

7.大肠杆菌乳糖操纵子的主要结构，调节机制。

大肠杆菌的乳糖操纵子（LAC操纵子）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β—半乳糖苷酶、透酶、乙酰基转移酶，此外还有一个操纵基因O、一个启动子P及一个调节基因I。

I基因编码一种与O基因结合的阻遏蛋白，使操纵子受阻遏而处于转录失活状态。

在P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白CAP结合位点。

由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成LAC操纵子的调控区，三个酶的编码基因由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。

调节机制：

分阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。

1、阻遏蛋白的负调节：

在没有乳糖存在时，I基因表达的乳糖阻遏蛋白与O序列结合，阻断转录启动；

当有乳糖存在时，经透酶催化、转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的少数β-半乳糖苷酶催化，转变为别乳糖，与阻遏蛋白结合，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录，使β-半乳糖苷酶分子急剧增加。

2、CAP的正调节：

当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CAP结合，这时CAP结合在乳糖启动序列附近的CAP位点，可刺激RNA转录活性；

当葡萄糖存在时，cAMP浓度降低，cAMP与CAP结合受阻，因此乳糖操纵子表达下降。

8.试说明真核细胞与原核细胞在基因转录，翻译及DNA的空间结构方面存在的主要差异，表现在哪些方面？

比较原核、真核基因组异同

（1）染色体方面：

原核生物为环状DNA分子，且DNA裸露或结合少量蛋白质，只有一个基因连锁群；

真核生物为线性双链DNA分子，且DNA同组蛋白和非组蛋白结合，有2个以上基因连锁群。

（2）染色体遗传物质：

原核生物为质粒，真核生物为细胞器基因组。

（3）转录单元：

原核生物为多顺反子，真核生物为单顺反子，基因家族。

（4）DNA序列：

原核生物无或很少有重复序列，真核生物有重复序列。

（5）基因表达：

原核生物RNA和蛋白质在同一区间合成，有重叠基因；

真核生物RNA在核中合成和加工，蛋白质在细胞中合成，有断裂基因。

比较原核、真核生物的转录过程异同

原核生物：

1起始过程需RNA聚合酶核心酶，由σ亚基辨认起始点（-35bp区）。

在这一区段酶与模板的结合松弛，酶移向-10区并跨入转录起始点。

②延长过程的核苷酸聚合仅需核心酶催化。

③终止分依赖ρ因子的和不依赖ρ因子的转录终止。

真核生物：

①转录起始前的-25bp区段有启动子的核心序列TATAbox。

此外DNA分子上还具有其他可影响转录的顺式作用元件，以及能辨认和结合转录上游区段的反式作用因子。

真核生物RNA聚合酶不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。

②真核生物的转录延长过程与原核生物大致相似。

③真核生物mRNA有polyA尾结构，是转录后才加进去的。

转录不是在polyA位置上终止，而是超过数百甚至上千核苷酸后才停顿。

比较原核、真核生物的翻译异同

1、原核生物与真核生物核蛋白体的组成不同。

2、真核生物肽链合成起始过程与原核生物相似但更复杂。

真核生物有不同的翻译起始成分，起始因子种类更多，起始甲硫氨酸不需甲基化等。

成熟的真核mRNA有5'

帽子和3'

polyA尾结构。

3、真核生物肽链合成的延长过程与原核生物基本相似，只是有不同的反应体系和延长因子。

4、真核生物的翻译终止过程与原核生物相似。

9.试说明色氨酸操纵子（Trpoperon）在原核基因表达调控中的调控机制和重要作用。

色氨酸操纵子结构系：

（1）含有5种结构基因：

TrpE,D,C,B,A；

（2）它的调控结构：

启动子，操纵子，前导序列，弱化子。

（3）阻遏物Trp基因：

它与Trp操纵子相距较远。

大量Trp存在时，大肠杆菌的5种酶的转录同时受到抑制，Trp不足时，这5酶基因开始转录。

前导序列中含有衰减子区域，在前导序列中第10位和第11位有相邻两个色氨酸密码子，参与转录弱化机制，弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置：

（1）当Trp浓度高时，可完整翻译成短肽，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录前，核糖体就到达2区，这样使2-3区不能配对，3-4区可自由配对形成茎-环状终止子结构，转录停止。

Trp操纵子中的结构基因被关闭而不再合成色氨酸。

（2） 

当Trp浓度低时，负载有Trp的转运RNA也少，这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，核糖体才到达1区，这时的前导区结构是2-3区配对，不形成3-4区配对的终止结构，故转录可继续进行，直到将Trp操纵子的结构基因全部转录。

11.阐述酵母转录激活因子GAL4的调控方式及其在酵母双杂合系统（yeasttwohybridsystem）中的应用。

GAL4由两个结构域组成，一个是DNA结合域BD，一个是转录激活域AD，这两个结构域各具功能，互不影响。

但具有完整激活功能的GAL4必须同时含有这两个结构域。

当AD与BD结合后，形成的完整转录因子可以激活被BD结合的基因的表达。

将编码待测蛋白X的DNA序列同编码GAL4BD的DNA序列整合在一个载体上，表达产生X-GAL4杂合蛋白；

将编码蛋白质Y的DNA序列同编码GAL4AD的DNA序列整合在一个载体上，表达产生Y-GAL4杂合蛋白。

这两种杂合蛋白都有核定位序列，当这两种载体同时转化入酵母细胞后，表达产生的两种蛋白都定位在核内。

如果X和Y有相互作用，则分别融合在二者上的AD和BD就会组合成为一个完整的转录因子，激活与BD结合的报告基因的表达，从而知道待测蛋白间是否有相互作用。

12.分子克隆中常用的工具酶及良好载体的条件？

常用的工具酶

1、限制性核酸内切酶：

是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。

2、DNA连接酶：

将两段DNA分子拼接起来的酶。

3、DNA聚合酶：

催化单核苷酸链延伸。

4、逆转录酶：

依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称互补DNA。

5、末端脱氧核糖核酸转移酶：

将脱氧核糖核酸加到DNA的3末端。

6、碱性磷酸酶：

催化去除DNA、RNA等的5磷酸基团。

7、依赖DNA的RNA聚合酶：

识别特异性启动子，RNA转录。

良好载体的条件

1、必须有自身的复制子；

2、载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位点，即多克隆位点，以供外源DNA插入；

3、载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子；

4、载体分子必须有足够的容量；

5、可通过特定的方法导入细胞；

6、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子、加尾信号等DNA调控元件。

13.SANGER双脱氧链终止法的原理？

DNA链中核苷酸以3′,5′-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是2′-脱氧核苷三磷酸。

2′,3′ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3′位置缺少一个羟基。

在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3′羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。

在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。

在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。

14.核酸分子杂交的原理、条件、影响因素？

互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。

这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。

因此，当用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。

必要条件：

一是必需的特异的DNA探针；

二是必需的基因组DNA。

影响因素：

1、核酸浓度越大，复性速度越快。

探针长度要适当。

2、温度：

温度过高不利于复性，温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离。

3、低离子强度下，核酸杂交缓慢，随着离子强度的增加，反应速率增加。

4、杂交液中甲酰胺能降低核酸杂交的TM值。

5、核酸分子的复杂性，即存在于反应体系中的不同顺序的总长度。

6、在杂交前应对非特异反应位点进行封闭，以减少其对探针的非特异性吸附作用。

15.PCR的基本原理和过程？

基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。

PCR全过程即高温变性、低温退火、中温延伸3个步骤构成的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。

1、变性：

94℃，模板双链DNA解链为单链DNA。

2、退火：

引物＋单链DNA杂交链。

3、延伸：

温度至70℃左右，TaqDNA聚合酶以4种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物3′末端为起点的5′→3′DNA链延伸反应，形成新生DNA链。

新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，如此反复，使目的DNA得到高效快速扩增。

16.PCR的反应条件？

1、PCR反应的缓冲液：

Tris-HCl缓冲液。

KCl促进引物的退火，浓度太高时会抑制TaqDNA聚合酶活性。

必要时加入适量二甲基亚砜（DMSO）或甲酰胺利于破坏模板二级结构，提高PCR反应特异性。

2、镁离子浓度：

TaqDNA聚合酶活性需要Mg2+。

Mg2+浓度过低，会显著降低酶活性。

Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。

Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。

3、底物浓度：

dNTPs浓度过高可加快反应速度，也增加碱基的错配率和实验成本。

降低浓度会导致反应速度下降，可提高反应的特异性。

4种dNTP必须以等摩尔浓度配制，以减少PCR反应的错配误差并提高使用效率。

4、TaqDNA聚合酶：

75-80℃时具有最高的聚合酶活性，150个核苷酸/秒；

具有良好的热稳定性，95℃仍有活性。

5、引物：

引物浓度偏高会引起错配或非特异性扩增、生成引物二聚体，使目的DNA片段产率下降。

退火温度与引物Tm值有关，引物Tm值在55-80℃范围较为理想。

6、反应温度和循环次数：

循环次数决定PCR扩增程度。

PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。

一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

17.影响大肠杆菌系统外源基因表达的因素？

1、启动子的强弱；

2、基因的剂量；

3、影响RNA转录和翻译效率的因素：

SD序列、mRNA；

4、外源基因密码子的选择；

5、表达产物的大小；

6、表达产物的稳定性。

18.大肠杆菌系统表达外源基因必须具备的条件？

1、要求外源基因的编码区不能含有内含子；

2、表达的外源片段要位于大肠杆菌启动子的下游，并形成正确的阅读框架；

3、转录出的mRNA必须有与大肠杆菌16SrRNA3，末端相匹配的SD序列，才能被有效的翻译成蛋白质。

4、蛋白产物必须稳定，不易被细胞内蛋白酶快速降解，且对宿主无害。

19.真核细胞表达外源基因的条件？

1、首先必须具备哺乳动物细胞表达的功能元件。

要求哺乳动物细胞表达载体带有能在真核细胞中表达外源基因的真核转录调控元件；

2、注意选择转染的受体细胞，不同类型的细胞具有不同的特性；

3、注意选择适当的选择标记。

20.转基因动物的概念、原理及应用？

概念、原理：

借助基因工程技术把外源目的基因导入生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体染色体上稳定整合，使之经过各种发育途径得到能把外源目的基因传给子代的个体。

应用：

（1）在基因表达调控研究方面的应用：

利用转基因动物可作为在体内研究外源基因表达调控的“反应器”；

（2）用于基因产品的制备：

把转基因动物看作是一种个体表达系统，使导入的目的基因表达，人们就可以从该动物的乳汁和血液里获得目的基因产物。

21.基因敲除的基本程序？

通过DNA同源重组，使特定的内源基因被破坏而造成功能丧失，然后通过介导得到该基因丧失的生物模型的过程。

以小鼠的某基因敲除为例：

1、靶载体的同源序列要足够长，要含有筛选用的标志基因；

2、胚胎干细胞的体外培养；

3、靶载体导入胚胎干细胞；

4、同源重组胚胎干细胞的筛选；

5、基因敲除胚胎干细胞注射入胚泡；

6、胚泡植入假孕小鼠的子宫中；

7、杂交育种获得纯合的基因敲除动物。

22．对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？

天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：

1、加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择，通常是抗生素基因。

2、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。

3、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。

4、改变复制子情况，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。

5、根据特殊需求加装特殊的基因元件。

23.利用双脱氧末端终止法（Sanger法）测定DNA一级结构的原理与方法？

采用2’，3’-双脱氧核苷酸，由于它缺少形成3’，5’磷酸二脂键所需要的3-OH,一旦参入到DNA链中，此DNA链就不能进一步延长。

根据碱基配对原则，每当DNA聚合酶需要dNMP参入到正常延长的DNA链中时，就有两种可能性，一是参入ddNTP,结果导致脱氧核苷酸链延长的终止，二是参入dNTP,使DNA链仍可继续延长直至参入下一个ddNTP。

根据这一方法，就可得到一组以ddNTP结尾的长短不一的DNA片段。

反应终止后，分四个泳道进行电泳，以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基）。

再根据片段3’端的双脱氧碱基的情况，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

24.典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤？

①外源基因的获得。

如酶切法、反转录法人工合成法；

②载体的获得。

如质粒、噬菌体；

③获得重组体；

④重组体导入受体细胞核。

转化、转导、杂交、细胞融合、显微注射技术；

⑤对吸收重组DNA的细胞进行筛选鉴定；

⑥对含有重组DNA细胞进行大量培养，检测外源基因是否表达。

25.提出一个将真核细胞中的mRNA与其他类型的RNA分开的方法。

真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有3’端的Poly（A）尾巴。

A与dT可碱基互补配对，因而可采用寡聚（dT）-纤维素柱层析法。

此法利用mRNA3’末端含Poly（A+）的特点，在高盐缓冲液的作用下，当总RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。

26.简述酵母双杂交的原理。

很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域BD与转录激活域AD。

两个结构域各具功能，互不影响。

但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成激活功能。

不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。

将两个待测蛋白分别与这两个结构域制成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。

如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。

通过对报告基因表达的测定可以知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。

该系统由三个部分组成：

（1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白。

（2）与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称靶蛋白。

（3）带有一个或多个报告基因的宿主菌株。

菌株具有相应的缺陷型、抗性基因，有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。

27.简述蛋白质电泳过程及其注意事项。

过程：

1、胶的配置：

2、样品处理：

将样品加入等量的2×

SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。

3、上样：

取10μL诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μL低分子量蛋白标准品作对照。

4、电泳：

在电泳槽中加入1´

电泳缓冲液，连接电源，对准正负极，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止。

5、染色：

将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色。

6、脱色：

将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。

注意事项：

1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。

2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确。

3、配制胶的原料具有毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。