目的物与离子交换剂的结合能力首先取决于溶液pH，它决定了目的物的带电状态，此外还取决于溶液中离子的种类和离子强度。
起始条件，溶液中离子强度较低，上样后，目的物与交换剂之间结合能力更强，能取代离子而吸附到交换剂上;洗脱时，往往通过提高溶液的离子强度，增加了离子的竞争性结合能.力，使得样品从交换剂上解吸，这就是离子交换色谱的本质。
2.pH和离子强度I的影响
pH和离子强度I是控制蛋白质离子交换行为、分辨率、回收率等的重要因素。
pH决定了目标分子及离子交换剂的带电荷情况，因而是决定目的物是否发生吸附的最重要参数。
分离时，应控制pH使得目标分子和离子交换剂带相反的电荷。
一方面，离子交换剂有一个工作pH范围，在此范围内能够确保离子交换剂带充足的电荷；另一方面，溶液的pH直接决定了目标分子带电荷的种类和数量，选择适当的pH，能够保证目标分子与离子交换剂带相反电荷而被吸附，同时如果pH距离目标分子等电点过远，则造成目标分子与离子交换剂结合过于牢固而不易洗脱。
在选择操作pH时还需特别注意目标分子的pH稳定范围，若超出此范围会造成目标分子活性丧失，导致回收率下降。
特别是要考虑到由于道南效应（Donnan）的存在，离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的，离子交换剂是亲水的，其表面有一层水膜，水膜里可以看作是离子交换剂的微环境。
在阳离子交换剂表面的微环境中，H+被阳离子交换基团吸引而OH—被排斥，造成交换剂表面pH比周围缓冲液中低1个pH单位；而阴离子交换剂表面的微环境中，OH—被阴离子交换基团吸引而H+被排斥，造成交换剂表面pH比周围缓冲液中高1个pH单位。
例如，某蛋白质在pH5时被阳离子交换剂吸附，实际上该蛋白质在交换剂表面是处在pH4的环境中，若此蛋白质在此pH条件下不稳定将会失活。
大多数蛋白质在pH4以下稳定性都会下降而使回收率很低。
由于溶液中的其他离子与目标分子竞争结合到离子交换剂上，因此离子种类和离子强度I是影响月标分子结合和洗脱的另一重要因素。
低离子强度下，目标分子通过荷电基团结合至离子交换剂上带相反电荷的功能基团上;当竞争离子浓度即离子强度I逐渐升高时，目标分子逐渐被置换下来。
绝大多数目的物在1mol/L的盐浓度下能够被洗脱，因此在探索条件阶段，人们常把洗脱盐的终浓度定为1mo1/L。
事实上在溶液中盐类还常扮演稳定目的物结构的角色，另外，不同离子从交换剂上将目的物置换下来的能力是不同的，并且离子类型还会对分辨率和不同蛋白质的洗脱顺序产生影响。
3.疏水相互作用和氢键
虽然目的物与离子交换剂发生结合主要依靠相反电荷之间的离子键，但实际上此过程中还可能存在其他的作用力，常见的就是疏水相互作用和氢键。
疏水相互作用主要出现在使用带非极性骨架的离子交换剂时，例如离子交换树脂，特别是聚苯乙烯树脂，骨架带有较强的疏水性，能与目的物分子中的一些疏水性氨基酸残基之间通过疏水相互作用结合。
现代HPLC中仍有部分色谱介质以树脂为骨架。
氢键主要出现在使用以亲水性高分子为骨架的离子交换剂，如以Sephadex或Sepharose为基质的离子交换剂，骨架糖链中的轻基、羧基等基团能够与目的物分子中带亲水侧链的氨基酸残基之间形成氢键。
当目的物与杂质在电性质方面很接近时，这些额外的作用力在分离时起着决定性的作用，据此往往可实现分离。
4.离子交换动力学
离子交换的发生及进行的程度即离了交换平衡取决于离子作用，而离子交换动力学则取决于离子交换剂的颗粒结构。
离子交换剂的骨架是具有网孔状结构的颗粒状凝胶，而荷电功能基团均匀分布在凝胶颗粒的表面及网孔内部，可交换分子依据分子量的不同，不同程度地进人凝胶颗粒内部，将荷电功能基团上的反离子置换下来而自身结合到离子交换剂上。
从动力学角度分析，整个过程可分为5个步骤（图6.7-3）。
①可交换分子在溶液中经扩散到达凝胶颗粒表面。
亲水性的凝胶和水分子形成氢键，从而在凝胶表面束缚了一层结合水构成水膜，水膜的厚度取决于凝胶的亲水性强弱、色谱时流速的快慢，亲水性越强、流速越慢，水膜越厚，反之水膜越薄。
可交换分子通过扩散穿过水膜到达凝胶表面的过程称为膜扩散，速度取决于水膜两侧可交换分子的浓度差。
②可交换分子进入凝胶颗粒网孔，并到达发生交换的位置，此过程称为粒子扩散，其速度取决于凝胶颗粒网孔大小（交联度）、交换剂功能基团种类、可交换分子大小和带电荷数等多种因素。
③可交换分子取代交换剂上的反离于
图6.7-3离子交换动力学示意
（以阳离子交换剂为例）
而发生离于交换。
④被置换下来的反离子扩散到达凝胶颗粒表面，也即粒子扩散，方向与步骤②相反。
⑤反离子通过扩散穿过水膜到达溶液中，即膜扩散，方向与步骤①相反。
根据电荷平衡的原则，一定时间内，一个带电分子进人凝胶颗粒，就有与该分子所带净电荷数相当数量的反离子扩散出凝胶颗粒。
上述5个步骤实际上就是膜扩散、粒子扩散和交换反应3个过程。
其中交换反应通常速率比较快，而膜扩散和粒子扩散速率较慢，当溶液中可交换分子浓度较低时，膜扩散过程往往最慢而成为整个过程的限制性步骤；当溶液中可交换分子浓度较高时，粒子扩散过程往往最慢而成为整个过程的限制性步骤。
灌注色谱动力学角度分析，就是通过独有的二元孔网络结构，可使粒子扩散速率大大提高，从而使整个过程效率提高。
（三）离子交换的分辨率
同其他色谱分离一样，离子交换的效果常用两个目标峰的分辨率（Rs）来描述。
一个纯化系统能够达到的分辨率取决于该系统的选择性、效率和容量，这是柱色谱中的3个最重要的参数。
Rs的解析表达式为:
（6.7-1）
式中a——选择性
N——柱效率
k＇——容量因子
1.容量因子
容量因子k＇又称保留因子，是色谱分离中常用的组分保留值表示法。
（6.7-2）
式中tR和VR——溶质的保留时间和保留体积
t0和V0——非滞留组分的保留时间和保留体积
一般来说，容量因子k＇的取值与可交换分子在固定相（离子交换剂）和流动相（缓冲液）中的分配性质、色谱温度及固定相和流动相的体积比有关，而与柱尺寸和流速无关。
2.柱效率
柱效率用在特定实验条件下色谱柱的理论塔板数N来表示，通常表示为每米色谱床所包含的理论塔板数，其计算公式:
（6.7-3）
式中VR——洗脱峰的洗脱体积
Wh——洗脱峰半峰高（h1/2）时对应的峰宽
柱效率下降会导致色谱时区带变宽，也就是洗脱峰的峰宽变大口导致区带变宽的原因之一是可交换分子在色谱柱床中发生纵向扩散，采用尺寸较小的凝胶颗粒作为离子交换剂的基质，可有效减小能够发生纵向扩散的距离，从而大大提高柱效率。
现代离子交换色谱介质中有些是以很小的颗粒作为基质的（小于3µm），它们有非常高的柱效率，但它们往往是非孔型的，可交换分子只能结合在其表面，因而此种离子交换剂的交换容量会下降。
另外，随着基质颗粒的减小，色谱分离时产生的背景压力会增大，不利于进行快速、大规模的色谱。
除基质颗粒大小外，实验技术是影响柱效率的另一重要因素，色谱柱床面不平整，柱床内有气泡等都会导致柱效率下降。
因此色谱过程中操作条件的控制对色谱效果影响很大。
3.选择性
选择性是一个系统分离不同蛋白峰的能力，习惯用相对保留值a来表示，a定义为：
（6.7-4）
式中k1＇和k2＇——洗脱峰1和2的容量因子
VR1和VR2——洗脱峰1和2的洗脱体积
V0——非滞留组分的洗脱体积
从对分辨率的影响上来看，好的选择性往往比高的柱效率更为重要（图6.7-4）。
图6.7-4选择性和柱效率对分辨率的影响
影响到离子交换色谱时选择性的因素包括：
离子交换剂上功能基团的性质和数量，pH和离子强度等实验条件。
由于上述实验条件是容易调控的，因而人们更乐于通过控制实验条件来提高选择性，从而获得好的分辨率。
根据前面所述Rs的解析表达式可知，为了提高一个分离过程的分辨率RS以达到满意的分离效果，必须满足以下条件：
①a>1，当VR1-VR2时a=1，此时两峰完全重叠，分辨率为0，,a值越大，两洗脱峰相距越远，分辨率越高；②N尽可能大，理论塔板数越大，柱效率越高，分辨率也越高；③k＇≠0，,根据k＇的计算公式，当两种蛋白的洗脱体积VR1和VR2均等于非滞留组分的洗脱体积V0时k＇﹦0，此时无法实现分离，分辨率为0，选择合适的色谱条件，使得至少一种蛋白质在离子交换剂上发生吸附，就能满足k＇≠0，增加k＇的值将提高分辨率Rs，有利于分离。
二、离子交换色谱介质（离子交换剂）
离子交换剂是离子交换色谱的基础，它们决定着分离过程的分辨率，同时还决定着分离的规模和成本，现代离子交换技术的进步得益于优质高效离子交换剂的研制和应用。
（一）基本结构
离子交换剂由水不溶性基质和共价结合在基质上的带电功能基团组成，带电功能基团上还结合有可移动的与功能基团带相反电荷的反离子（又称平衡离子）。
反离子可被带同种电荷的其他离子取代而发生可逆的离子交换，此过程中基质的性质不发生改变。
离子交换剂所带功能基团分为酸性基团和碱性基团两类，其中带酸性功能基团的离子交换剂在工作pH范围内解离放出质子而带有负电荷，能够结合溶液中带正电荷的离子（阳离子），因此被称为阳离子交换剂；而带碱性功能基团的离子交换剂在工作pH范围内结合质子而带有正电荷，能够结合溶液中带负电荷的离子〔阴离子），因此被称为阴离子交换剂。
基质是一类水不溶性的化合物，理想的墓质应当满足以下条件：
①有较强的机械稳定性，能适合高流速的需要；②具有亲水性，至少在颗粒表面应当是亲水性的；③高化学稳定性，在很宽的pH范围内保持稳定，耐去污剂、有机溶剂，耐高温，从而方便色谱前后的清洗和消毒灭菌；④高的交换容量，以满足分离较大规模样品的需要；⑤球形，颗粒直径均匀；⑥价格尽可能便宜以降低分离成本。
（二）功能基团和酸碱性质
带电功能基团决定了离子交换剂的基本性质，功能基团的类型决定了离子交换剂的类型和强弱，它们的总量和有效数量决定了离子交换剂的总交换容量和有效交换容量。
根据功能基团是酸性基团还是碱性基团，离子交换剂分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。
此外，根据功能基团的解离性质，离子交换剂还可分为强型离子交换剂和弱型离子交换剂，强弱并不是指可交换分子与交换剂结合的牢固程度，而取决于带电功能基团的pKa值。
强型离子交换剂带有强酸性或强碱性功能基团，其pKa值很低或很高，远离中性，因此解离程度大，在很宽的pH范围内都处于完全解离状态；弱型离子交换剂则带有弱酸性或弱碱性功能基团，其pKa值与强型交换剂相比靠近中性，工作pH范围较窄，超出此范围会造成解离程度下降，带电荷数量明显减少。
当色谱pH远离pKa时，无论是强型还是弱型离子交换剂都能牢固吸附可交换分子。
结合上述两种分类方法，离子交换剂可以分为强酸型（强阳）、强碱型（强阴）、弱酸型（弱阳）和弱碱型（弱阴）四种。
表6.7-1列出了较为常用的离子交换功能基团的名称和种类。
强酸型离子交换剂中最常用的是磺基，弱酸型最常用的是羧基，强碱型最常用的是季铵基，弱碱型最常用的是氨基。
除了磷酸基外，其他功能基团一般都只带单个正电荷或负电荷。
表6.7-1常见的离子交换功能基团
（三）离子交换剂的部分性质
1.粒度
用于生化分离的离子交换剂的颗粒直径一般都在3~300µm林二范围内。
基质颗粒大小直接关系到分离效果，细颗粒的介质常适用于分析型分离，大颗粒介质适合于制备型分离。
除颗粒大小外，基质颗粒的均匀程度对分离效果的影响也很大，颗粒直径越均一，分离效果越好。
2.交联度和网孔结构
离子交换剂的基质是通过交联剂将线型大分子交联形成网孔状颗粒。
不同的离子交换剂使用不同的离子交联剂，例如，聚苯乙烯树脂使用二乙烯苯作为交联剂，葡聚糖和纤维素交换剂使用环氧教丙烷作为交联剂，琼脂糖交换剂使用二嗅丙醇作为交联剂。
交联度的大小影响着离子交换剂的很多特性，包括机械强度、膨胀度、网孔大小、交换容量等。
一般交联度越高，网孔的孔径越小，交联度越低，网孔孔径越大。
离子交换常用介质具有网孔状结构，色谱分离时往往具有分子筛和离子交换双重功效。
3.电荷密度
电荷密度是指恭质颗粒上单位表面积的取代基（功能基团）的数量，它决定着离子交换剂的交换容量、膨胀度等性质。
对小分子进行离子交换时，离子与功能基团按1∶1的物质的量之比结合，交换剂上功能基团密度越大，工作能力越强，高电荷密度的离子交换剂具有优势。
但蛋白质类大分子进行离子交换色谱时，决定交换容量方面，交联度比电荷密度重要得多。
如果基质颗粒孔径太小以致蛋白质分子不能进人颗粒网孔。
即使颗粒表面电荷密度很大，
图6.7-5离子交换剂的膨胀度与交换剂类型和溶液离子强度的关系
测定条件：
色讲柱：
15mm×30mm；操作压力30cmH2O（1cmH2O=98.0665Pa）
（a）和（b）为pH7.6的TrisHCl缓冲液，（c）和（d）为pH4.3的醋酸缓冲液；离子强度用NaCl进行调节
交换容量也不高。
此外，蛋白质类分子带电荷数量往往较多，与交换剂上功能基团结合不是1:
1的物质的量之比关系，而是多点结合，过高的电荷密度会导致蛋白质在离子交换剂上结合过于牢固而难以洗脱，极易造成蛋白质变性，回收率下降。
因此，适合蛋白质类分子离子交换的介质电荷密度往往较低。
4.膨胀度
又称吸水值，是指当干态的离子交换剂在水溶液中吸水后造成体积膨胀的程度，通常用每克干胶吸水膨胀后的体积（mL）来表示。
影响离子交换剂膨胀度的因素如下。
①基质种类。
一般来说，具亲水性基质的离子交换剂膨胀度要大大高于具有疏水性基质的离子交换剂，前者膨胀度可达到60mL/g干胶，而后者有时在溶液中体积变化非常小。
②交联度。
无论是哪一类离子交换剂，其膨胀度都随着交联度的增加而下降。
图6.7-5显示了4种基于交联葡聚糖凝胶Sephadex的离子交换剂在不同交联度下的膨胀度情况，由于SephadexG-25交联度高于SephadexG-50,所以相应的SephadexA-50和SephadexC-50交换剂膨胀度分别高于SephadexA-25和SephadexC-50。
③带电基团的强弱。
在相同交联度的情况下，SephadexA-50和SephadexC-50系列的离子交换剂比它们的基质SephadexG-50膨胀度大得多，原因在于功能基团带同种电荷，相互排斥而扩展了凝胶颗粒的体积，同样的道理，强酸型和强碱型离子交换剂由于带电荷数量多于相应的弱酸型和弱碱型离子交换剂，其膨胀度相应地也比后者高。
图6.7-6离子交换剂的膨胀度与溶液pH的关系
测定条件：
色谱柱15mrn×300mm；操作压力：
30cmH2O（1cmH2O=98.0665Pa）；
（a）和（b）使用咪唑-乙二胺缓冲液，（c）和（d）使用磷酸缓冲液；离子强度均为0.5mol/L
④溶液的离子强度和pH对于某种特定的离子交换剂，膨胀度不是常数，其数值受到溶液离子强度和pH值的影响，特别是交联度较小的交换剂，其结构强度不如交联度较大的交换剂，其膨胀度更易受上述因素影响（见图6.7-6）。
应当指出，让离子交换剂在具有一定离子强度的缓冲液中充分膨胀，可以使颗粒网孔增大并保持孔径稳定，这对于交换剂的交换容量和分离效果都是有帮助的，所以离子交换剂使用前要进行预溶胀。
5.交换容量
交换容量是指离子交换剂能够结合溶液中可交换离子的能力，通常分为总交换容量和有效交换容量。
总交换容量又称总离子容量，用每克干介质或每毫升湿胶包含的带电功能基团的数量来表示，其数值的大小取决于离子交换剂的取代程度也就是电荷密度。
总交换容量可以通过酸碱滴定的方法来测定，也就是利用交换剂上的酸性或碱性基团同已知浓度的酸碱发生反应，利用物质的量关系算出交换剂上功能基团的数量。
也可使得离子交换剂和某种小的离子之间发生完全交换，然后通过侧定该离子的含量算出总交换容量。
总交换容量并不反映交换剂对可交换分子的结合情况，因为交换剂所能结合某种分子的数与该分子的大小、交换剂的网孔结构及所选择的实验条件等多种因素有关口因此，人们提出了有效交换容量的概念，指每克千介质或每毫升湿胶在一定的实验条件下吸附某种分子的实际容量。
由于有效容量是一个变值，在说明其数值时应当同时指出实验条件，比如pH和离子强度。
表6.7-2列出了几种常用的基于Sephadex的离子交换剂的总交换容量和对特定蛋白质的有效容量。
表6.7-2几种常用离子交换剂的总交换容量①
有效交换容量中又分出静态容量和动态容量的概念，这是由于色谱分离过程中的流速对有效容量的影响较大。
静态容量是指在流速为零，蛋白质有充足的时间从流动相扩散到固定相并吸附在交换剂上，此时离子交换剂对蛋白质的吸附可以达到饱和，对应的结合容量即为静态容量。
在流速很低时测出的有效容量近似于静态容量。
而当色谱流速增大后，蛋白质来不及使离子交换剂达到完全饱和，这种在特定流速F测出的有效容量为动态容量，它在数值上总是小丁静态容量。
某种离子交换剂对特定蛋白质的静态容量的测定可采用试管小样法。
具体操作如下取若于支试管，分别往其中加入相同体积的已经用起始缓冲液平衡好的离子交换剂，再分别加入一系列不同浓度的蛋白质溶液，混合振荡确保充分吸附，然后分析上清液中是否含有蛋白质成分，根据能使上清液中无蛋白质的最大蛋白质浓度可以计算出每毫升离子交换剂所能吸附的蛋白质的上限，此即为静态容量。
测定动态容量则必须在色谱条件下进行。
取一定体积的离子交换剂装柱，用起始缓冲液平衡，在特定的流速下加样至色谱柱上端，注意样品应当溶于起始缓冲液，浓度在1~5mg/mL。
为确保离子交换剂满负荷吸附蛋白质，应不停地加样直至紫外检测器测出有蛋白质从柱下端流出，并且检测器上吸光度的读数达到最大值的一半（不含蛋白质的起始缓冲液吸光度为0，样品蛋白质溶液为100%）。
停止加样，用起始缓冲液将不能吸附的蛋白质继续洗出，使柱下端流出液的吸光度回到0附近，此时柱内的离子交换剂处于此流速下的最大吸附状态，而柱内液体中又不含不被吸附的蛋自质。
改变缓冲液条件。
使得蛋白质从色谱柱上解吸，收集洗脱液测定出其中的总蛋白，除以离子交换剂体积后可算出该交换剂在此流速下的动态容量。
（四）离子交换剂的类型
1.离了交换树脂
树脂是一类通过化学方法合成的具有特殊网状结构的不溶性高分子化合物，网状结构的形成往往通过单体聚合时加人一定比例的交联剂来实现。
树脂本身又分为好多种类，最常见的包括聚苯乙烯树脂、聚异丁烯酸树脂、聚丙烯酸树脂、酚醛树脂等。
再通过化学方法往树脂骨架上引人功能基团就得到离子交换树脂。
离子交换树脂种类很多，不同的生产厂家生产的离子交换树脂所标称的型号和名称各不相同，但有的在性能上是非常相似的。
前面已经提到，由于树脂孔径过小，大分子无法进人颗粒内部造成有效交换容量太小，以及电荷密度太高，会使大分子结合过于牢固而不易洗脱。
尽管离子交换树脂在脱盐、小分子的氨基酸及短肤的分离中有着非常广泛的应用，但通常不用于蛋白质类大分子的色谱。
2.离子交换纤维素
基于纤维素的离子交换剂是最早用于分离蛋白质类大分子的离子交换剂之一，于1954年由Peterson和Sober最先报道，在当时蛋白质的色谱领域是一个重大突破，而这类交换剂至今仍在广泛使用。
纤维素离子交换剂的特点是表面积大，开放性的骨架允许大分子自由通过，同时对大分子的交换容量较大。
纤维素的亲水性结构使其表面结合着4倍于自身质量的结合水，形成的交换剂.与蛋白质之间结合时离子键以外的作用力，如疏水相互作用等很低，这使得色谱分离时洗脱很方便，并且蛋白质活性的回收率高。
离子交换纤维素存在着纤维状和微粒状两种不同的物理形态。
纤维状的交换剂是将纤维素直接衍生化，连接上功能基团而形成的。
纤维素分子是由葡萄糖通过β（1→4）糖苷键连接形成的大分子，天然状态下相邻的多糖链之间形成数量巨大的氢键，从而在这些区域形成微晶结构。
微晶区域周围又散布着非晶型〔无定形）区域。
微粒状的交换剂是将纤维素进行部分酸水解，除去了大部分非晶型区域后经衍生化形成的，这样的处理使交换剂的外水空间增大，结构也更为牢固，并且电荷分布更均匀。
英国的Whatman公司是最早生产离子交换纤维素的企业之一
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