微生物基因敲除技术分析Word格式.doc

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基因敲除的一般流程见图1。

用引物扩增目的基因之后，使用内切酶切开基因，连入有相同粘性末端的抗生素基因如四环素抗性基因或者报告基因例如lacZ等；

将载体转化入目的菌内，通过筛选，筛选出含有标记基因的菌株，然后要通过PCR等进行复证。

使用双标记法可以判断发生交换的次数。

如果只发生第一次重组，则两个标记都会被插入宿主DNA中；

而若发生了两次重组，则阴性标记会被丢失，细菌要么是野生型的，要么能检测到阳性标记。

图1常规基因敲除的主要流程和机理

2常规基因敲除的成功率分析

首先，DNA的同源重组频率不是很高。

况且，此处要求发生两次同源重组，这使得重组概率大大下降。

加长两端的同源序列有助于重组，但这样一来内切酶效率就得不到保证。

这一问题解决的方法，主要是进行大量的培养，实验中，往往可以得到较多的敲除子。

第二，图中可以看出，在第一次重组和第二次重组之间，由于敲出基因载体的整个插入，基因仍然有一部分是完好的（载体的一段和宿主的另一端融合而成）。

解决这一问题的方法已如前述：

即引入两个标记。

3常规基因敲除的主要缺点

①速度慢，效率低。

基因敲除需要一般的基因工程方法来进行转化和表达，周期较长，在这个过程中载体是关键；

②对细胞感受态要求较高。

基因敲除和普通基因工程相比，有一定的不同：

因为目的基因必须采用特殊载体装载，保证转化率很关键。

对于这一点，现在可以采用基因枪法或者电转化来解决。

③基因敲除对于酵母、丝状真菌等真核微生物研究较少，主要原因是对于一般的转化方法，对于真核生物转化不容易；

而且在真核生物中，表达周期要更长，因此效率要更低；

真核生物基因调控的手段很复杂，即便是进行了敲除之后，由于某些原因，可能并不表现一定的形状，导致敲除失败。

二常规基因的改进方法

1基因捕获

基因捕获是功能基因组学的研究方法，本来应用于表达基因的寻找。

但它本身的操作方法可以用来构建基因敲除体系。

它的主要机制如下图所示。

图2基因捕获的机制

以带有报告基因的基因捕获载体转化到细胞中。

由于这一序列本身不含有启动子，所以只有转化到有启动子的（能够表达的）DNA序列上，也就是只有转化到基因里，才能够表达报告基因。

结合cDNA文库和DNA芯片，由此便可以报告一个功能基因的位置。

如果采用大量的转化载体和大量的细菌细胞进行实验，则可以得到很多随即插入序列的不同细胞。

类似于CDNA文库那样，这一系列的细菌便可以作为一个体系。

因此，基因捕获也可以当做基因敲除文库来使用。

原核生物，例如大肠杆菌，功能基因的数量远不如真核生物多。

因此，原本用于真核生物的基因捕获在原核生物的应用就变得特别容易。

现在，已经得到了基因捕获体系的大肠杆菌文库，可以进行很多细菌分子生物学实验和分析。

2基因捕获的优缺点

基因捕获的主要优缺点是并存的，那就是它只能够敲除表达的基因（事实上是所有基因都能被敲除，但是只能够报告出表达的基因），这一方面为筛选带来了方便，另一方面又难以对深入的调控问题做研究。

3线形转化敲除法

1998年,Murphy等报道了利用λ噬菌体的线性Red同源重组系统获得高重组率。

Red系统主要包含3种蛋白质分子,分别称为Exo、Beta和Gam，这三者是λ噬菌体中的高效重组蛋白质。

采用这样的转化体系时，宿主DNA被直接切断，转化基因直接插在切口中。

因此，这种转化效率是很高的，可以用来弥补基因敲除需要两次重组的低效率。

线性转化进行基因敲除的方法还有一个有点就是需要的同源序列很短，只有50-60bp，可以进行人工合成，繁琐的酶切和连接。

此外，尚有结合转化敲除法以及温度敏感型质粒敲除法等，转化效率和实验进行速度都比常规敲除有了很大提高，更适合于微生物场合下的基因敲除。

新兴敲除技术的出现使得微生物分子生物学研究处在了新的历史舞台上，结合微生物研究本身的特点，一定能够成为新知识、新技术的诞生地。

三特殊场合的基因敲除技术

1基因条件敲除技术

基因条件敲除可以研究某些基因在微生物发育的不同阶段，或者不同的生长时期的表达情况，或者在发育生物学中进行基因表达的研究。

关于这方面的技术，目前有报道的还很少，但是这种技术在研究实践中一定有很广阔的应用前景。

目前，对基因的条件敲除技术有一些报道。

他们主要应用的基因敲除体系是四环素诱导的基因敲除方法。

图3基因敲除的四环素诱导法。

将tTA整合到宿主DNA上之后，再以基因转运的方式将原基因带回宿主内，前边加上了依赖四环素转录激活子tTA转录起始位点。

须要基因敲除时，只需要向体系中添加四环素，则tTA蛋白构象发生变化，失去启动转录的活性，被沉默的目的基因就不能表达。

于是便实现了人工控制时间的条件基因沉默。

对比原来常规的基因沉默技术来说，基因条件沉默并不是直接将原来的基因一味地破坏掉，而是相当于对基因启动子的人工开启或者关闭，相对而言，这更接近于字面意义的“沉默”。

这一沉默方法极大地方便了发育生物学和对人类疾病病理和发展进程的生物学研究。

2基因自敲除技术和基因链锁敲除技术

与条件敲除相类似，基因自敲除技术是使用细胞内部已知的产物，通过细菌自身的操纵子的作用进行的基因敲除。

这种基因敲除还可以连锁进行，可以用来研究细胞对于外界环境作出反应时都调用了哪些基因，以及一效多因的研究。

3基因定向敲除技术

所谓基因定向敲除，就是在基因敲除过程中，尤其是在基因捕获的过程中，对于所要敲除的基因减少了随机性，而是在一些插入热点的地方进行基因的敲除。

这样一来，基因敲除减少了盲目性。

四RNAi技术

RNA干扰是近几年来研究的热点之一。

RNA干扰采用小的mRNA，它的序列和已知有功能的基因转录出的mRNA能形成互补双链区，导致RNA不能被核糖体识别而不能转录，所以只能被降解。

在原核生物如大肠杆菌中，基因的转录和翻译是同时进行的。

传统的基因敲除是直接将基因破坏掉了，这样不容易在同一体系中同时判断该基因的其他功能，做研究是需要很多平行试验，很费时费力。

RNAi的出现，使得在不破坏目的基因的情况下敲除目的基因变得容易。

只要知道目的基因的mRNA序列，就可以设计DNA片段，编码一个反义的RMA，将这个DNA以载体转化至宿主细胞，就可以将所要敲除的DNA从表达谱上掩盖掉。

这种敲除没有对原来的基因做出改动，因而目的基因在细胞内是完好存在的。

如果配上可以调控表达的体系，那么就可以人为调整反义基因的表达量或者是否表达，从而可以在一个体系中对目的基因进行开关。

因此，反义基因也被称作是“按钮”。

一个应用的例子是在不同菌体内基因表达环境下大肠杆菌的蛋白质组差异分析。

使用RNAi沉默了一些奢侈基因和一些持家基因，然后在沉默条件下和不沉默条件下，还有几个基因的共沉默条件下，提取了细胞的蛋白质组和mRNA组，进行了比对研究，发现了很多原先不知道的调控机理，已经几个基因之间相互作用中，起作用的其他基因的表达情况。

同样的还有采用单次性敲除的方法研究代谢途径变化的方法。

单次性敲除即为向细菌菌体中一次性添加过量某目的基因的反义mRNA的方法。

这种方法的特点在于可以瞬时将细菌中某基因的表达降低到零，这种条件下，细菌会有很多非同寻常的反应，这也是目前基因敲除和功能基因组学研究前沿的方向之一。

RNA在基因沉默的应用也不是没有缺点。

主要缺点是序列必须已知，反义DNA必须人工合成，对于较大的蛋白质来说，人工合成反义基因不容易。

其次是基因沉默的时效性和遗漏。

如果反义DNA的转录量不够，那么很容易发生遗漏。

五对基因敲除一些想法

基因敲除和基因沉默的不同之处在于，基因沉默的机制在于沉默子的作用和调节。

基因敲除的目的是让目的基因的表达降为零，这可以通过多个层面来实现，也即基因表达调控的七个层面：

转录、终止、转录后调控、mRNA寿命、翻译、翻译后调控、酶活性调控等。

在这里面的每一个层次其实都应该是基因敲除的考虑层次。

之前的基因沉默的目光聚集在前两个层次，而RNAi的基因沉默则主要体现在翻译层次。

其实其他的层次的敲除也应该是可行的，而且相对于常规基因敲除来说会有很多意想不到的实验结果，并且可以出现很多之前从未见过的实验技术。

因此，我认为基因敲除技术的发展，应该思路在宽一些，而不是只在几个层面上进行。

总的来说，基因敲除技术现在得到了非常广泛的应用，但是人们对它的改进和研究还是做得不够。

而且基因敲除有一个致命的硬伤，就是不得不承认很多情况下将一个基因从菌体中敲除之后，并没有引起什么变化和改变。

基因复杂的表达和调控机制仍然是一个谜，基因之间的合作关系更是难以预料，关于这一点，人们所知甚少、例如，在基因捕获的过程中，曾报道过将酵母菌40%的基因沉默掉，酵母菌仍能够正常生长；

大肠杆菌的致命基因（缺失或突变之后不能在完全培养基上生长的基因）可能只有总基因组的10%左右。

基因的表达制约着人们对它真实面目的研究。

但是坚信人们有一天会解开生物界最终秘密的。

参考文献：

1谢承佳,何冰芳,李　霜，基因敲除技术及其在微生物代谢工程方面的应用。

生物加工过程

第5卷第3期，2007年8月

2王又红基因敲除技术的应用现状与发展前景国外医学199926-5

3张勇，赵南明，刘强，人工调控基因表达。

科学通报，第44卷第24期1999年12月

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