污泥脱水液培养微藻在盐胁迫下的油脂积累情况docWord下载.docx
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ZhuGuoqing1,2
1SchoolofEnvironmentScienceandCivilEngineering,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China
2JiangsuEngineeringLaboratoryforBiomassEnergyandCarbonReductionTechnology,Wuxi214122,China
AbstractInordertoreducethecostofproducingbiodieselfromoil-richmicroalgae,thesludgeliquorwasselectedastheculturesolution,andthebiodieselby-product—crudeglycerol（preparedinlaboratory）wasselectedastheexternalcarbonsource.Thelipidaccumulationunderdifferentcrudeglyceroldosage,differentsaltconcentrationsandsaltstresstimewereinvestigated.Theresultsshowedthatinthesludgeliquorsupplementedwithcrudeglycerol,microalgaegrewwellandcouldenterastablegrowthperiodinashorttime.Undertheconcentrationof1g/Lcrudeglycerol,thebiomassyieldandlipidproductioncouldreach0.89gL-1d-1and0.62g/L,whichwere1.95and1.88timesofthoseintheuntreatedgrouprespectively.AfteraddingNaCltosludgeliquor,withtheincreaseofculturetime,thelipidcontentofmicroalgaeincreased.WhenNaClwasaddedto20g/Landculturingmicroalgaefor48h,themaximumlipidcontent,lipidproductionandlipidyieldwereobtained,respectively45.4%,1.29g/Land1.047g/g,whichwere1.97,1.65and2.64timesasmuchasthoseinthecontrolgroup.AndtheutilizationrateofCODandammonianitrogeninsludgeliquorwas85.3%and99.6%.Accordingtofattyacidanalysis,thecontentofunsaturatedfattyacidinthe20g/LNaClgroupwas78.9%,higherthanthatinthenon-addedgroup,whichmettherequirementsforbiodieselproductionandcouldbeusedasrawmaterialforbiodieselproduction.TheresultsshowedthataddingcrudeglycerolascarbonsourceinsludgeliquorcouldoptimizeC/Nandpromotethegrowthofmicroalgae;
saltstressonmicroalgaeinsludgeliquorcouldsignificantlyincreasethelipidcontentofalgaecellsandpromotetheaccumulationoflipidundertheappropriatesaltconcentrationandstresstime,whichprovidedacertainreferenceforlarge-scalecultivationofmicroalgaetoproducebiodiesel.
Keywordsmicroalgae;
saltstress;
sludgeliquor;
crudeglycerol;
lipidaccumulation
生物柴油，当今世界公认的理想可再生能源，是当前最常用的生物燃料之一。
目前，生物柴油的生产原料主要为植物和动物脂肪酸[1]。
而微藻可以利用阳光、水、CO2合成自身生长所需物质[2]，并且种类繁多，其中相当部分含油量极高，在适宜的培养条件下，甚至可获得干藻质量50%～70%的含油率。
因此，具有高光合作用效率、可适应恶劣生长环境、短生长周期、高生物产量等特点的微藻成为当今生产生物柴油的优势原料[3]。
但是，目前限制微藻生物能源产业化的因素亟待解决。
首要问题便是微藻培养需要消耗大量水资源和无机营养盐[4]。
据此已有大量研究在寻求适宜培养微藻的废水，尤其在市政废水和畜禽养殖废水中的藻类培养研究更为广泛，因为这些废水量大、可用性强[5]。
但养殖废水氨浓度高，会抑制藻类的生长，需要稀释后用于微藻培养[6]，所以现阶段更倾向于市政废水培养微藻。
Wang等研究了初沉池进水、初沉池出水、好氧出水和污泥脱水液培养小球藻的可行性[7]。
Zhou研究也表明污泥脱水液是所有城市污水流中最好的藻类培养液，具有高生物量积累和高效废水营养物去除的特点[8]。
污泥脱水液是市政废水经二级处理产生的污泥脱水后所形成的废水。
前期研究表明利用污泥脱水液可培养富油微藻，在实现废水深度处理的同时，产生的微藻生物质可作为生物能源的原料[9-10]。
然而，以自养为主的微藻高密度培养时的光限制，以及污泥脱水液中可利用的碳源限制等，导致微藻的生物产量和油脂含量有限。
据此，在光照条件下进行光合自养的同时利用外加有机碳源异养，进而提高微藻的生长速率及油脂产率得到越来越多的关注[11]。
其中优选经济有效的外加有机碳源成为关键。
随着生物柴油的大量生产，副产物粗甘油的产量也迅速增加。
这些粗甘油废液如果不能及时有效地利用和处理，将可能成为新的污染源[12]。
利用生物柴油生产的副产物——粗甘油添加至污泥脱水液中培养富油微藻，可在处理废水的同时，获得较大的微藻产量[10]。
然而，微藻生物柴油规模化最终取决于藻细胞的产油效率。
为此，国内外学者围绕微藻细胞高密度培养和油脂积累特性方面进行了大量研究，发现在高盐胁迫下，藻细胞中的生物碳流会倾向高能产物储存的方向流动，从而提高油脂含量[13]。
目前，在添加粗甘油的污泥脱水液复杂体系中，对粗甘油的利用、盐浓度与盐胁迫时间对微藻生长的影响尚未明确。
所以，优化外加碳源粗甘油的添加浓度以提高微藻生物量的同时，优选适宜的盐胁迫浓度和胁迫时间以获得高油脂含量和稳定生物量是本文的关键。
因此，本文以外加粗甘油的污泥脱水液为培养液培养普通小球藻，在确定适宜粗甘油添加浓度后，对小球藻进行不同盐浓度、不同胁迫时间的培养实验，根据微藻的生长量和油脂含量得出污泥脱水液培养微藻在盐胁迫下的油脂产量变化情况，为生物柴油副产物粗甘油找到高效、低碳循环发展的处理方式，为进一步提升微藻处理污泥脱水液与生产生物质柴油的能力、增加微藻在水处理与生物质能源领域的应用潜力提供一定参考。
1实验材料与方法
1.1实验材料
（1）藻种：
普通小球藻（Chlorellavulgaris），编号UTEX2714，购于德克萨斯大学微藻种库（Texas,USA）。
（2）培养基：
Tris-Acetate-Phosphorus（TAP）培养基[14]。
其成分为每升培养基400mgNH4Cl,100mgMgSO4·
7H2O,50mgCaCl2·
2H2O,110mgK2HPO4,56mgKH2PO4,2420mgNH2C（CH2OH）3,1.00mlCH3COOH,1.00ml微量元素储备液。
每升微量元素储备液含50gNa2EDTA,22gZnSO4·
7H2O,0.05gCaCl2·
2H2O,11.4gH3BO3,5.06gMnCl2·
4H2O,16gKOH,4.99gFeSO4·
7H2O,1.61gCoCl2·
6H2O,1.57gCuSO4·
5H2O,1.1g（NH4）6Mo7O24·
4H2O.
（3）实验用水水质
污泥脱水液，取自无锡新城污水处理厂污泥脱水车间。
污泥来源主要为生物池，少部分来源于缺氧池和厌氧池，污泥采用带式压滤机脱水，静置后上清液的水质指标如表1所示。
表1污泥脱水液水质指标
Table1Thecharacteristicsofsludgeliquor
化学需氧量COD
（ρ/mgL-1）
总氮TN
总磷TP
（ρ/mgL-1）
氨氮NH4+-N
pH
278.00±
9.28
44.59±
1.56
4.05±
0.15
28.15±
0.94
7.54±
0.30
（4）实验碳源
外加碳源粗甘油，为实验室配制，其含质量分数为50%的甘油，5%的甲醇。
1.2实验方法
（1）粗甘油添加浓度的选择
取5个1000ml三角烧瓶，分别装入500mL已补加0、0.5、1.0、1.5、2.0g/L粗甘油的新鲜污泥脱水液。
取适量TAP培养基中生长至对数期的藻液，于4000r/min条件下离心5min，弃去上清液，保留藻泥，用上述污泥脱水液悬浮藻泥，分别接种于这5个三角瓶中，使其初始藻密度为1.0g/L，再将三角烧瓶置于恒温光照摇床内培养，摇床设置参数为温度27±
1℃，转速150r/min，光暗比12h:
12h，光照强度6000lx，培养48h后测定生物量和油脂含量，以确定适宜的粗甘油添加浓度。
（2）盐胁迫浓度及胁迫时间对小球藻油脂积累的影响
取5个1000ml三角烧瓶，分别装入500mL已补加适宜浓度粗甘油的污泥脱水液。
藻种接种方式及培养条件同上，培养小球藻至稳定期，完成生物量的积累，然后进行盐胁迫浓度和胁迫时间的对比实验。
将上述完成生物量积累的小球藻培养液离心处理，保留藻泥，加入已补加粗甘油的新鲜污泥脱水液，设置NaCl浓度分别为0、5、10、20、30g/L，胁迫时间为12、24、36、48h。
将接种微藻的三角烧瓶放置在恒温光照摇床内培养，摇床设置参数同上。
盐胁迫开始后每隔12h取样测量生物量、pH、油脂含量、COD等指标，以确定适宜的NaCl浓度和胁迫时间。
1.3指标分析方法
（1）藻细胞生物量的测定
通过已知干重的小球藻液在680nm下的光密度值，作细胞生物量（干重）与OD680的相关性曲线。
通过每天测定的藻液OD680，计算藻细胞生物量M（g/L）[15]。
（2）藻细胞油脂含量测定
培养结束后，将收集的藻培养液以4000r/min转速离心5min，弃去上清液，蒸馏水冲洗藻泥，再次离心，重复此过程3次，将最终收集的藻泥置于-80℃冷冻24h，-50℃真空冷冻干燥24h。
将冷冻干燥的藻体磨成粉末，取0.05克粉末与5毫升氯仿/甲醇（2:
1）混合，然后在室温条件下振荡30分钟，使其萃取充分，溶剂相通过离心机7000r/min离心10分钟，同样的过程重复一次，收集溶剂相于已干燥恒重的称量杯（w1）中，将称量杯放入105℃烘箱烘干至恒重（w2）[16]，利用下式计算油脂含量：
油脂含量（L，%）=
（3）pH值
使用Multi3420手持数字参数计（德国，WTW）测定。
（4）氨氮
采用纳氏试剂分光光度法（HJ535-2009）测定。
（5）化学需氧量
采用重铬酸钾法（HJ828-2017）测定。
（6）甘油含量
取不同浓度标准品甘油溶液，测定412nm下吸光度，绘制标准曲线。
样品经3500r/min离心20min，取上清液，适当稀释后测定[17]。
取一定浓度样品稀释液各1ml，分别置于不同比色管中，再加入1ml0.015mol/L的高碘酸钠溶液，混匀，室温放置10min，然后加入2ml0.1％的L-鼠李糖溶液，以除去过多的高碘酸盐，混匀后加入4mL新鲜配置的Nash试剂，53℃水浴加热15min，使其充分呈色。
再以试剂空白做参比，在412nm测定吸光值，计算甘油含量，该值表示培养液中剩余甘油浓度。
（7）元素分析
微藻培养结束后收集藻液经离心机4000r/min离心5min，保留藻泥，弃去上清液，使用蒸馏水重新悬浮藻泥，此过程重复三次。
将最终收集的藻泥置于-80℃冷冻24h，-50℃真空冷冻干燥24h。
将冻干处理后的藻体研磨成粉末，用Variomicro型元素分析仪（德国，Elementar）进行藻细胞内元素含量的测定[18]。
粗蛋白含量（%）=6.25×
氮元素含量
（8）淀粉
采用FernandesB方法[19]进行测定。
藻体经冷冻干燥后研磨成粉末，称取研磨后的藻粉记为M1（2-4mg），加入4mL乙醇溶液，乙醇溶液体积浓度为80%，68℃水浴15min，将水浴后的溶液经4000r/min离心6min，弃去上清液，重复此过程3次。
离心结束后在沉淀中加入3.3ml30%HClO4，随后室温下振荡15min；
将振荡后的溶液经离心机以4000r/min离心6min，取上清液置于比色管中，重复此过程三次；
离心管内溶液定容至10mL；
通过苯酚-硫酸法分析离心管内溶液糖含量，记为M2mg/L。
M为对应培养时间的生物量。
淀粉含量计算公式为：
（9）脂肪酸含量
标准曲线绘制：
在气相瓶中加入37种脂肪酸甲酯混合标准品（Sigma-Aldrich），精准进样进行分离定性。
气相色谱（GC-2010Plus）条件：
色谱柱：
peg-20m；
进样量0.2μL；
进样口温度250℃；
载气为高纯氮气，流速50mL/min；
分流比19.3:
1；
柱温箱采用柱升温程序：
初始温度200℃，保持10min，以20℃/min升到220℃，保持14min；
检测器为FID，温度250℃；
氢气流速25mL/min，空气流速300mL/min。
将37种脂肪酸甲酯混合标准品置于1mL容量瓶中，使用正庚烷梯度稀释1.25倍，然后转移至气相小瓶精确进样，以各峰面积为横坐标，相应的质量浓度为纵坐标拟合绘制标准曲线[20]。
样品处理：
称取冻干藻粉25mg，与2毫升乙酰氯/甲醇（1:
9）混合，将混合液置于80℃烘箱内反应45min，冷却至室温，加入1mL0.58%NaCl溶液混匀，再加入2mL正己烷，混匀后静置，分层明显后用注射器收集混合液中正己烷层，使用孔径为0.22μm的有机滤膜过滤至气相瓶，进行气相色谱分析。
1.4指标计算方法
藻细胞油脂含量即为单个藻细胞内脂质重量占细胞鲜重的百分比；
藻细胞生物量产率为单位时间内藻细胞生物量增长量；
油脂产量是藻细胞产出的油脂总量，为藻细胞油脂含量和生物量之积；
油脂得率指微藻消耗单位质量碳源的产油量，为油脂产量和碳源消耗浓度之比。
为探究藻细胞对不同粗甘油浓度适应情况，故考察不同粗甘油浓度下藻细胞生物量产率；
为提高油脂产量，所以必须提高藻细胞内油脂含量；
同时，为成本考虑，考察微藻油脂得率，在消耗等量的碳源时尽可能获得高油脂产量。
生物量产率（P,gL-1d-1）：
油脂产量（C,g/L）：
油脂得率（Yc,g/g）：
碳源消耗浓度（X,g/L）：
COD利用率（D，%）：
氨氮利用率（M，%）：
式中：
t——培养时间，h；
Mt——培养t时微藻生物量，g/L；
L——微藻生物量为M时对应的油脂含量，%；
Xt——微藻生物量为M时对应的COD，g/L；
Nt——微藻生物量为M时对应的氨氮浓度，mg/L。
2结果与讨论
2.1不同粗甘油浓度对小球藻生物量和油脂含量的影响
不同粗甘油浓度下小球藻的生长指标情况如表2所示，培养48h后，相比于对照组，补加粗甘油后脱水液中碳源充足，小球藻生物量产率显著提高，1.0g/L粗甘油添加浓度下生物量产率可达0.89gL-1d-1，为对照组的1.95倍。
当添加浓度进一步提高时，生物量产率逐渐降低，可能是粗甘油浓度提高对小球藻造成底物限制，粗甘油中所含甲醇对微藻生长存在抑制作用，甲醇含量的上升限制了生物量产率的提高。
此外，相比于对照组，添加粗甘油后，脱水液中小球藻的油脂含量略微提升，由于最终油脂产量为油脂含量和对应生物量之积，所以在生物量产率显著提高的基础上，最终油脂产量得到明显提高，1.0g/L粗甘油添加浓度下油脂产量可达0.62g/L，为对照组的1.88倍。
可见，污泥脱水液中外加粗甘油作为有机碳源，不仅可以优化C/N，显著促进小球藻生长，还可以略微提高小球藻油脂含量，在小球藻生物量和油脂含量均提高的结果下，最终实现油脂产量的明显提升。
据此确定1.0g/L为适宜的粗甘油添加浓度。
表2不同粗甘油浓度下小球藻的生长及油脂指标情况
Table2GrowthandlipidindexofChlorellavulgarisunderdifferentconcentrationsofcrudeglycerol
粗甘油添加浓度
Crudeglyceroladdedconcentration
（ρ/gL-1）
生物量产率
Biomassyield
（ρ/gL-1d-1）
油脂含量
Lipidcontent
（P/%）
油脂产量
Lipidproduction
0.46±
0.02
17.00±
0.56
0.33±
0.01
0.5
0.55±
27.30±
0.37±
1.0
0.89±
0.03
22.30±
0.86
0.62±
1.5
0.84±
20.80±
0.78
0.56±
2.0
0.82±
20.60±
0.82
2.2不同盐浓度和胁迫时间对小球藻生物量和油脂含量的影响
Na盐对微藻细胞生长的影响主要有两种方式。
一是微藻吸收环境中Na+并将其积累在细胞内，从而形成单盐毒害作用；
二是高盐环境往往造成渗透胁迫，致使质膜间跨膜渗透压降低，最终造成细胞膨压的缺失[21-22]。
不同盐浓度和胁迫时间下小球藻生物量（a）、油脂含量（b）及油脂产量（c）的变化如图1所示。
图1不同盐浓度和胁迫时间小球藻的生物量（a）、油脂含量（b）、油脂产量（c）。
Fig.1Biomass（a）,lipidcontent（b）,lipidproduction（c）ofChlorellavulgarisunderdifferentsaltconcentrationsandstresstime.
由图1（a）中可以看出，胁迫培养48h期间，除了盐浓度30g/L组，其它组别生长趋势相似，在培养前24h生物量逐渐增大，24h后生物量下降，最终趋于稳定。
其中，20g/L组在24h时生物量最大，略好于对照组，分析原因可能此时脱水液中的藻细胞对该范围盐浓度有一定承受能力，在20g/LNaCl浓度下，Na+促进了微藻细胞对脱水液中无机盐的吸收，对细胞内pH起到一定调节作用，进而促进微藻生长[23]。
但是，随着培养时间的增长，盐的刺激作用愈加明显，在Na+长时间作用下，后期生物量下降，低于对照组。
此时脱水液中微生物细胞为了在高盐环境下维持细胞膨胀压力，会将细胞内积累的Na+释放到外部环境，同时增加质膜对K+的吸收，调节相容性渗调剂和渗透保护剂的合成和积累，达到维持细胞内部平衡的目的[24-25]。
但是，随着培养液中盐浓度的进一步提升，即在超过微藻可承受能力时，培养过程中微藻生长会受到明显的抑制作用，获得的微藻生物量明显低于对照组。
因此当NaCl浓度为30g/L时，微藻细胞生长趋势缓慢，生物量基本无增长，原因可能就是在此盐浓度下，微生物的膨胀压力无法正常维持，同时高盐浓度可能会使相关酶失活，抑制细胞呼吸，呼吸作用减弱致使细胞停止分裂从而停止生长[26]。
表3不同盐浓度和胁迫时间下小球藻油脂得率（w/gg-1）
Table3Lipidyield（w/gg-1）ofChlorellavulgarisunderdifferentsaltconcentrationsandstress
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