南农 细胞生物学 11Word格式.docx

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此外，运用现代的培养技术并不能重复出Carrel所观察到的培养细胞无限生长的现象。

Hayflick认为Carrel每次向培养基中加入的鸡胚提取物可能混杂人了新鲜的细胞。

而不死的HeLa细胞和L系小鼠细胞已被证明是不正常的细胞，它们的染色体数目或形态已经不同于原先的细胞了。

此外，Hayflick等还发现，从胎儿肺得到的成纤维细胞可在体外条件下传代50次，而从成人肺得到的成纤维细胞只能传代20次，可见细胞的增殖能力与供体年龄有关。

这一现象也为许多研究者所证实。

Goldstein选用了早老症（Hayflick-Guilford综合症）及Werner氏综合症患者的成纤维细胞进行培养。

这两种病的患者表现出极其明显的衰老特征，例如9岁的早老症患者组织中已经有老年色素的沉积，外貌看起来就像70多岁的人那样老，通常在20岁前死去。

从这种病人身上得到的成纤维细胞在体外只能传代2～4次，其DNA合成亦较少，且细胞表面不具有正常成纤维细胞所具有的HLA抗原标记。

Wern—er氏综合症患者的成纤维细胞在体外培养条件下的行为亦大体相同。

这些研究有力地说明，体外培养的二倍体细胞的增殖能力反映了它们在体内的衰老状况。

Hayfiick还比较了取自寿命长度不同的生物的胚成纤维细胞在体外培养条件下的传代数和寿命，发现物种寿命与培养细胞寿命之间存在着确定的相关关系，例如Galapagos龟平均最高寿命最长，达175岁，其培养细胞的传代数亦最多，达90—125次；

小鼠平均最高寿命为3．5年，其培养细胞的传代次数亦少，仅14～28次。

为了确定培养的人二倍体细胞的衰老是细胞本身决定的还是由于培养环境的恶化（例如培养基中营养物质的缺乏，细菌的污染或有毒物质的积累），Hayflick设计了巧妙的实验：

他以间期有无巴氏小体作为供体细胞的标记，将取自老年男性个体的细胞（间期无巴氏小体）和取自年轻女性个体的细胞（间期可见巴氏小体）进行单独或混合培养，并统计其倍增次数；

结果发现，混合培养中的两类细胞的倍增次数与各自单独培养时相同，即在同一培养基中，当年轻细胞旺盛增殖的同时，年老细胞就停止生长了。

这一结果有力地说明，决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不在外部环境。

为了进一步探求体外培养的二倍体细胞衰老表达的控制机理，Wright和Hayflick用细胞松弛素B处理细胞，然后离心以除去细胞核，得到胞质体（cytoplast），再用胞质体与完整细胞进行杂交，观察杂

种细胞衰老的表达。

结果发现，年轻的细胞胞质体与年老的完整细胞融合时，得到的杂种细胞不能分裂；

而年老的细胞胞质体与年轻的完整细胞融合时，杂种细胞的分裂能力与年轻细胞几乎相同。

这一实验的结果说明，是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老的表达。

至此，Hayflick界限，即关于细胞的增殖能力和寿命是有限的观点，为广大的研究者所接受，认为适用于很多类型的细胞；

对于这些细胞来说，衰老是不可避免的，衰老的原因在于细胞本身。

三、细胞在体内条件下的衰老

实际上，在生活有机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生。

例如蝌蚪发育时尾和鳃的消失就是通过细胞的死亡而实现的。

但体内细胞类型不同，其增殖状况各异。

神经元及心肌细胞在发育的早期即已停止分裂，成为固定的有丝分裂后细胞，尔后它们逐渐衰老和死亡。

人脑在衰老时神经元的不断丧失即是一个明证。

肝细胞、软骨细胞属于回复性分裂后细胞，它们通常不分裂，但终身保持分裂能力，例如部分切除肝细胞后，剩余的肝细胞即能进行旺盛的同步分裂。

引起人们最大兴趣的要算那些在正常情况下终生保持分裂的细胞，如骨髓细胞，上皮细胞等。

它们的分裂能力是否随着有机体年龄的增高而下降?

它们会不会衰老?

这些问题引起了研究者们极大的兴趣。

以往曾有人研究过不同年龄BCF，小鼠小肠腺窝上皮细胞的周期长度，发现随着年龄的增高，细胞周期长度明显延长。

2月龄小鼠细胞周期总长度为10．1h，而27月龄者竟达15．2h，延长50％。

可见衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G，期明显延长，S期的长度变化不大。

其他研究者的工作亦得到大体相同的结论。

然而细胞周期的延长，亦即细胞分裂能力的下降的原因是什么?

是由于细胞本身的衰老，还是由于体内环境的恶化?

为了解答这个问题，研究者们采用了组织移植技术。

Krohn用近交系小鼠进行皮肤移植实验。

他将小鼠的皮肤移植到其F，后代身上，当F1变老时，又移植到F2身上，这样他进行了系列移植，结果移植的皮肤细胞可生活7～8年，远远超过其原来供体的寿命，这表明引起小鼠皮肤细胞在体内衰老的主要是体内环境。

Daniel用小鼠乳腺上皮进行了系列移植实验，如果两次移植的间隔时间为1年，则可存活6年，也明显长于小鼠的寿命，说明衰老个体内的环境因素影响了上皮细胞的增殖和衰老。

研究得最为充分的要算骨髓干细胞的移植。

骨髓干细胞产生淋巴细胞、红血细胞、粒细胞及血小板的前体细胞。

Hirokawa等将老年动物进行强辐射处理，破坏其免疫干细胞，然后移植人年轻动物的骨髓和新生小鼠的胸腺，结果观察到年老受体动物细胞免疫功能复壮。

这似乎表明免疫功能的复壮是由于年轻动物的干细胞取代了原来老化了的干细胞。

Astle和Hirokawa（1984）重复并证实了Hirokawa等的实验，他们还发现，如果移植的骨髓干细胞是来自年老的动物，那么免疫反应就仍然保持在较低的水平上，不会复壮。

他们认为免疫反应是

否复壮，关键在于供体与受体的年龄组合。

他们的结论是，老年动物干细胞的免疫缺陷只是在老年受体中才表达。

进一步的研究表明老年动物体内似乎存在有阻抑细胞或阻抑因子，抑制了免疫反应。

总之，根据以上的研究，虽然不能认为骨髓干细胞没有衰老，但可以说，它们的衰老至少是比较缓慢的。

揭示干细胞衰老缓慢的机理，对于了解衰老的本质，无疑是十分重要的。

四、衰老细胞结构的变化

细胞在衰老过程中，其结构会发生深刻的变化。

（一）细胞核的变化

在体外培养的二倍体细胞中发现，细胞核的大小是倍增次数的函数，即随着细胞分裂次数的增加，核不断增大。

细胞核结构的衰老变化中最明显的是核膜的内折（inva画na“。

n），这在培养的人肺成纤维细胞中比较明显。

在体内细胞中也可观察到核膜不同程度的内折，神经细胞尤为明显，这种内折与年龄俱增。

核膜内折在老年小鼠的普肯耶细胞、海马、垂体前叶及肝细胞中均可观察到。

染色质固缩化是衰老细胞核中的另一个重要变化。

体外培养的细胞中，晚代细胞的核里可明显看到染色质的固缩化，而早代细胞的核只有轻微的固缩作用。

除了培养细胞外，体内细胞，如老年果蝇的细胞，老年灵长类的垂体细胞及大鼠颌下腺的腺泡细胞中，都可观察到染色质的固缩化。

染色质固缩作用与染色质蛋白的二硫键有关。

此外，在酵母Sgsl突变体衰老细胞中还观察到核仁裂解为小体的现象。

（二）内质网的变化

Hasan和Glees比较了不同年龄大鼠海马细胞的内质网结构，发现年轻动物的细胞中，糙面内质网发育良好，排列有序；

而在年老动物中，这种有序的排列已不复存在，内质网成分弥散性地分散于核周胞质中。

在衰老大鼠的侧前庭核及小脑普肯耶细胞中，均观察到糙面内质网解体的趋势。

在光学显微镜下用碱性染料染色，可以观察到小鼠和人的大脑及小脑某些神经元中尼氏物质的含量随年龄增长而下降，而尼氏小体实际上代表了内质网和核糖体群。

观察体外培养的人胚肺成纤维细胞，发现26次倍增以前的细胞内质网膜腔膨胀扩大，含有不定形的致密物质，且为核糖体所覆盖；

而40次倍增以后的细胞内质网膜腔未见膨胀，所含不定形致密物质亦少，且具无核糖体覆盖区段。

总的说来，衰老细胞中糙面内质网的总量似乎是减少了。

（三）线粒体的变化

多数研究者的工作表明，细胞中线粒体的数量随年龄增大而减少，而其体积则随年龄增大而增大。

例如在衰老小鼠的神经肌肉连接的前突触终末中可以观察到线粒体数量随年龄增大而减少。

同时许多报告表明，在小鼠、大鼠及人肝的衰老细胞中，线粒体发生膨大。

膨大的线粒体中有时可见到清晰的嵴，偶尔亦会

观察到线粒体内容物呈现网状化并形成多囊体，以及外膜破坏，多囊体释出的情况。

在培养的人成纤维细胞中，还观察到两种不同类型的线粒体：

I型固缩紧密，Ⅱ型大而稀疏，通常每个细胞只含一种类型的线粒体；

随着倍增次数的增加，I型线粒体越来越多。

（四）致密体的生成

致密体（densebodies）是衰老细胞中常见的一种结构，绝大多数动物细胞在衰老时都会有致密体的积累。

除了致密体外，这种细胞成分还有许多不同的名称，如脂褐质（Upofuscin）、老年色素（ageOrsenilepigment）、血褐质（hemofuscin）、脂色素（1ipochrome）、黄色素（yellowpigment）、透明蜡体（hyaloceroid）及残体（residualbodies）等等。

致密体的发现可上溯至19世纪，但只是近年来才逐渐弄清了它们的起源。

较近的研究提供了大量证据，表明致密体是由溶酶体或线粒体转化而来。

多数致密体具单层膜且有阳性的磷酸酶反应，这和溶酶体是一致的。

少数致密体显然是由线粒体转化而来，因为可以看到双层膜结构，有时嵴的结构也依稀可见。

脂褐质通常产生自发荧光，它是自由基诱发的脂质过氧化作用的产物。

（五）膜系统的变化

年轻的功能健全的细胞的膜相是典型的液晶相，这种膜的脂双层比较柔韧，脂肪酸链能自由移动，每个脂质分子与其相邻分子之间的位置交换极其频繁，埋藏于其中的蛋白质分子表现出最大的生物学活性。

衰老的或有缺陷的膜通常处于凝胶相或固相，这时磷脂的脂肪酸尾被“冻结”了，完全不能自由移动，而膜就变为刚性的了，因此埋藏于其中的蛋白质也就不能再运动了；

在机械刺激或压迫等条件下，膜就会出现裂隙，其选择透性及其他功能均受到损害。

此外，细胞衰老时，细胞间间隙连接及膜内颗粒的分布也发生变化。

间隙连接在细胞间离子和小分子代谢物的交换上起着重要的作用。

研究发现，培养的IMR—90晚代细胞的间隙连接明显减少，组成间隙连接的膜内颗粒聚集体变小。

为了观察间隙连接的变化对细胞间的代谢联系产生的影响，研究者们还用放射自显影技术来研究重建间隙连接的年轻或年老细胞间3H—脲嘧啶核苷酸的交换。

结果发现，重新集聚4h后，70％的年轻细胞从共同培养的年轻供体细胞得到3H—脲嘧啶，而只有30％的年老细胞从共同培养的年老供体细胞中得到了这种物质。

这表明，衰老时间隙连接的减少，使细胞间代谢协作减少了。

用冷冻断裂法可以看到细胞膜P面的膜内颗粒在年老细胞中明显减少，而正面颗粒相对增加，但总颗粒数的变化不显著。

这种变化反映了衰老细胞中膜内颗粒在膜平面上进行侧向运动能力的丧失。

五、细胞衰老的分子机制20世纪90年代以来，关于细胞衰老的分子机制的研究有了重大进展，最突

出的成果有：

①单基因的突变导致寿命的显著延长，对这些基因的克隆及其产物特性和功能的研究，使我们对细胞衰老的分子机制的认识大大加深了；

②端粒和端粒酶与细胞衰老关系的发现，提供了控制细胞衰老的新途径，除此以外，在其他一些有关衰老机制的研究上，也取得了不同程度的进展。

（一）氧化性损伤学说的发展

早在20世纪50年代，Harman就已提出衰老的自由基理论，以后又不断有所发展。

这一理论认为，代谢过程中产生的活性氧基团或分子（reactiveoxygenspecies，ROS）引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。

细胞从外界吸收的氧中约有2％～3％变成了ROS，ROS主要有三种类型：

①·

02，即超氧自由基；

②·

OH，即羟自由基；

③H202。

它们的高度活性，引发脂质、蛋白质和核酸分子的氧化性损伤，从而导致细胞结构的损伤乃至破坏。

例如ROS可以氧化不饱和脂肪酸，并产生过氧化脂质，后者进一步分解，产生小分子醛类物质，进而引起蛋白质等大分子的交联。

根据衰老的自由基理论，清除ROS，就可以延长寿命。

事实也确实如此。

近年来发现，超表达Cu／ZnSOD和过氧化氢酶的转基因果蝇寿命比野生型长34％；

而将人SODl的基因转入成年果蝇的运动神经元中，使果蝇寿命延长40％。

差不多同时，有人在线虫中发现了一个ageI突变体，其寿命为野生型的两倍，且其SOD及过氧化氢酶活性及对ROS的抵抗力均比野生型高。

那末，age5和SOD的基因有什么关系?

它们是否是同一个基因呢?

研究者克隆了线虫SOD的基因，发现其位置在tra2和UTIC／。

4两个位点之间，这和当时推定的ageJ基因的位置重叠，从而燃起了人们的希望。

如果这二者是同一基因，那末age5突变体的长寿应归因于SOD的抗氧化功能了。

然而，很快就发现，这两个基因在位置上有一定的距离，从而否定了当初的猜想。

现在我们知道，ageI基因编码磷脂酰肌醇—3—激酶的p110催化亚基，其产物介导磷脂酰肌醇的信号传递路线，而和抗氧化作用无关。

进一步的研究更使人们对SOD这一类抗氧化因子对衰老的影响提出了疑问，有人将小鼠的谷胱甘肽过氧化物酶基因及SODl、SOD2和SOD3基因中的一种剔除，并未引起衰老的加速。

除了age5基因外，近年来还在线虫中发现了另一种和寿命的延长有关的基因，即clkJ基因。

这个基因是酵母中参与CoQ合成的Cat5基因的同类物。

确实线虫的clkI突变体中CoQ含量也较低。

CoQ是线粒体呼吸链的成员，CoQ的缺乏，使电子传递减慢，ROS的形成减少，代谢变慢，这可能是cigJ突变体寿命较长的原因。

（二）端粒与衰老

端粒（telomere）是染色体末端的一种特殊结构，其DNA由简单的串联重复序列组成。

它们在细胞分裂过程中不能为DNA聚合酶完全复制，因而随着细胞分裂的不断进行而逐渐变短，除非有端粒酶（telomerase）的存在。

端粒酶是一种核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白质组成。

端粒酶RNA是合成端粒DNA的模板，而端粒酶的反转录酶亚基（在人细胞中为hTRT）则催化端粒DNA的合成。

合成的端粒重复序列加在染色体的末端。

人的染色体端粒由TTAGGG／CCCTAA重复序列组成。

在生殖细胞中，由于存在端粒酶的活性，端粒保持约15kb的长度，而在人的体细胞中，由于不存在端粒酶的活性，端粒要短得多。

1990年Harley等人用人工合成的（TTAGGG），作为探针，对胎儿、新生儿、青年人及老年人的成纤维细胞的端粒长度进行测定，发现端粒长度随年龄增长下降。

在体外培养的成纤维细胞中，端粒长度则随着分裂次数的增加而下降。

在这些研究的基础上，提出了细胞衰老的“有丝分裂钟”学说，该学说认为，随着细胞的每次分裂，端粒不断缩短；

当端粒长度缩短达到一个阈值时，细胞就进人衰老。

到了1998年，Wright等人提出了更加令人信服的证据。

他们将人的端粒酶反转录酶亚基（hTRT）基因通过转染，引入正常的人二倍体细胞（人视网膜色素上皮细胞和包皮成纤维细胞），发现表达端粒酶的转染细胞，其端粒长度明显增加，分裂旺盛，作为细胞衰老指标的9半乳糖苷酶活性则明显降低，与对照细胞形成极鲜明的反差。

此外，表达端粒酶的细胞寿命比正常细胞至少长20代，且其核型正常。

这一研究提供的证据确实令人信服，说明端粒长度确实与衰老有着密切的关系。

当然也有不少研究报告不支持这一学说。

就在同一年（1998年），Carman等报告说，二倍体的叙利亚仓鼠胚细胞在复制分裂的各阶段始终表达端粒酶，其端粒长度亦保持恒定，然而经过20—30代分裂后，仍然进入衰老。

另外，某些小鼠终生保持较长的端粒，但并未因此而获得较长的寿命；

特别是剔除端粒酶基因的小鼠已经获得，但在其前5代中，迄今未观察到相应的表型的变化（如寿命的缩短）。

看来，衰老的“端粒钟学说”还需要经受更多的检验。

（三）rDNA与衰老

这方面的研究主要是在S．cerevisiae中进行的。

这种酵母的细胞分裂是不对称的，每次分裂，产生一个大的母细胞和一个小的子细胞，母细胞分裂若干代后就进人衰老。

经过大量的研究，已经确定细胞衰老的步伐是由rDNA的变化所决定的。

S．cereuisiae中，rDNA以100—200份串联拷贝的形式存在于第12号染色体上，在酵母达到生命的“中年”时的某一时刻，通过同源重组产生的第一份环状rDNA片段会膨冲而出，成为染色体外rDNA环（extrachromosomalrDNAcircle，ERC）。

随着细胞分裂的不断进行，ERC不断复制增加。

当积累到500～1000份拷贝时，细胞就进入衰老（图13—1）。

用双向电泳法也证明，年老的细胞中积累了许多密闭的环状rDNA，而年轻细胞中则以线性的基因组DNA为主，只含有极少量的环状rDNA。

ERC的积累，导致细胞衰老，并伴随着核仁的裂解。

ERC积累引起细胞衰老的机制是在酵母中发现的，一般认为它适用于哺乳类中由分裂细胞组成的组织。

但关于哺乳类动物细胞中环状DNA随年龄积累的报导并不多见，而且已知的环状DNA不包括rDNA。

这方面还需要进一步的研究。

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（四）沉默信息调节蛋白复合物与衰老

沉默信息调节蛋白复合物（silencinginformationregulatorcomplex，SirCom—plex），简称S汀复合物，包括S汀1、S让2、S汀3、Sid，通常存在于异染色质中。

它们一方面与RAPl和组蛋白H3／114结合，一方面附在核基质上。

S汀复合物的功能是阻止它们所在位点的DNA的转录。

在酵母中，S让复合物通常存在于端粒及与性别决定有关的HML和HMR位点上。

核糖体DNA重复序列1DNA~'

71票薯称分离

，‘扫荡’必需

的细胞因子

死亡

图13—1酵母中ERC生成示意图酵母rDNA由多份重复序列组成，同源重组往往发生在相邻重复序列的某DNA损伤点上；

SGSl基因和SIR基因减缓ERC积累的速率

1994年Kennedy等发现，在一种被称为SIR4—42的酵母突变体中，Sir3蛋白和Sir4蛋白发生重新分布的现象，即由端粒等处向核仁转移，这种转移伴随着寿命的延长。

这一研究表明，核仁的沉默化与寿命的延长有关。

他们发现，从这个突变体中得到的Sir4蛋白，其羧基末端的121个氨基酸残基被除去。

这个区域本是Sir4蛋白与端粒和HM处的RAPl蛋白相互作用的结构域。

这一区域的去除，使Sir复合物得以自由定位，从端粒和HM位点转移至核仁，使核仁的rDNA处于沉默状态，抑制了复制，同源重组及ERC的生成和积累，从而延长了寿命。

（五）SGSl基因、WRN基因与衰老

在酵母中发现了一种sgsl突变体，其寿命明显短于野生型。

野生型平均分裂24．5代，最高分裂代数为40代；

而sgsl突变体平均分裂9．5代，最高分裂代数为18。

这表明SGSl基因的缺陷或丧失明显影响了寿命。

研究者进一步克隆了SGSi基因并分析它所编码的蛋白，发现它属于RecQ亚族的DNA解旋酶。

对sgsl突变细胞的观察，发现其核仁结构在年轻细胞中正常，而在年老细胞中，核仁裂解为小体。

应用免疫荧光法发现了SGSl蛋白在细胞中的定位。

超过90％的细胞中，SGSl蛋白集中在核仁。

核仁如果缺少SGSl蛋白就会裂解。

同时，在sgsl突变细胞衰老时，可观察到SIR蛋白向核仁的转移，转移至核仁的SIR蛋白有阻止核仁裂解和细胞衰老的作用。

当比较正常酵母（SGSl／SIR3）和（sgsllsir3）突变体时，发现经12次分裂后，前者核仁裂解率为6％，而后者达19％，说明SIR蛋白向核仁的转移，抑制了核仁的裂解，延长了寿命。

另一方面，近年来人们也以Werner综合症（WS）为对象，进行衰老机制的研究。

Werner综合症是一种引发早老的疾病。

WS病人出生后10岁前基本正常；

10～20岁时，缺少正常的青春期快速生长过程；

20多岁时，出现双眼白内障、白发、脱发等正常人老年时才会出现的现象；

30多岁时，出现骨质疏松，Ⅱ型糖尿病，动脉粥样硬化，肿瘤等；

40岁以后，心血管病、肿瘤发生频率大大增加。

取自WS病人的细胞在体外条件下培养，分裂代数比正常人的细胞少得多；

其细胞中发生染色体重排，删除突变频率大大增加，所以WRN基因是保证正常寿命所必需的。

WRN基因与SGSl基因同源。

WRN蛋白含1432个氨基酸残基，具有7个DNA解旋酶所特有的标志性序列。

对WS病人的WRN蛋白的分析表明，不同病人的WRN蛋白发生了不同的突变，影响其正常功能，造成DNA复制的严重障碍。

用免疫荧光法也证明，正常人的成纤维细胞中，WRN蛋白位于核仁中，而来自WS病人的皮肤成纤维细胞中，观察不到典型的WRN蛋白。

这些结果表明，编码DNA解旋酶的人WRN基因和酵母SGSl基因是保证细胞正常生命周期所必需的，如果发生突变，就会引起衰老的提前发生和寿命的缩短。

（六）发育程序与衰老

近年来，用线虫进行的发育程序与衰老关系的研究取得了重要的进展，线虫（Canorhabaitiselegans）的幼虫期持续约4天，然后达到性成熟并进入成虫期。

成虫期延续数周，随即衰老死亡。

当线虫幼虫在发育过程中遇到不良环境（如虫口过密、食物短缺或高温），引起性外激素浓度的变化，结果幼虫就进入一种特殊的称为dauer幼虫的阶段，可以延续6个月之久。

dauer幼虫全身被以厚的角质层，口紧闭，处于休眠状态。

如果环境条件改善，dauer幼虫又可发育为成虫，经过数周，完成其生活史。

线虫的这种特殊的发育模式引起了研究者的强烈兴趣，因为这牵涉到发育方向的决定和寿命的延长。

遗传分析表明，存在着两类有关dauer幼虫形成（dauerformation）的基因，称为d。

厂基因。

第一类为do撑和agel基因，第二类为dd／J6基因。

do口编码类胰