细胞工程知识点及重点难点总结Word文件下载.docx
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又称脱分化，指某些条件下分化细胞不稳定，又回到未分化状态的这一过程
6、愈伤组织：
脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的、松散的细胞团称为愈伤组织。
愈伤组织的种类
胚性愈伤组织（Embryoneniccallus）：
表面光滑、组织结构紧凑、细胞小、再生力强。
胚性愈伤组织容易形成胚状体，所以被称为胚性愈伤组织。
非胚性愈伤组织：
表面粗糙、组织结构疏松、细胞大。
第三章细胞工程实验室及实验基本操作（教材第二章）
1、什么是灭菌是么是消毒（P18）
灭菌是指杀灭或者去除物体表面和孔隙内的所有微生物，包括抵抗力极强的细菌芽胞。
消毒是指杀死物体上的病原微生物，但细菌芽胞和非病原微生物可能还存活。
2、常用的灭菌和消毒方法有哪些
物理法
（一）紫外线
直接照射、表面灭菌、可消毒空气和培养用具（如塑料器皿），消毒的效力和距离有密切关系，故无菌室天花板一般不宜太高。
一般石菌室内空气、桌椅以及培养用具在紫外线有效消毒距离内，照射30分钟，可达到灭菌效果。
紫外线照射使用方便、消毒效果好；
缺点是能产生臭氧，污染空气，且对未直接照射的部分无消毒效果。
（二）干热消毒
主要用于消毒玻璃器四周，干热、消毒的器皿干燥，易贮存。
但干热传导慢，需加温到160℃，保持90~120分钟，才能杀死芽孢，达到消毒目的。
消毒后不要立即打开箱门，防止冷空气忽然进入影响消毒效果和损坏玻璃器皿。
金属器械和橡胶制品不能用于干热消毒等。
（三）湿热消毒
即高压蒸气消毒，是最有效的一种方法。
布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿以及某种液体都可以用这种方法。
（四）滤过消毒
不能高温高压灭菌的液体可以用此法，如动物组织的人工合成培养液、小牛血清、胰蛋白酶系。
须选一定规格的滤器，液体滤过速度，且保证除菌效果的关键。
一般以肉眼可见液滴滴下为。
滤过后及时分装。
（五）煮沸消毒
急需要时的常规方法，金属器械、胶塞在水中煮沸20~30分钟，趁热倒去水分即可使用。
化学法
（一）消毒剂灭菌
来苏尔、新洁尔灭（1%）、70~75%酒精、安替福氏、贝氯酸钙、乳酸蒸气、环氧乙烷。
（二）抗菌素灭菌：
（三）熏蒸灭菌
3、什么是平衡盐溶液（BSS）
平衡盐溶液（BalancedSaltSolution；
BSS）
又称生理盐水或盐溶液。
具有维持渗透压，控制酸碱度的平衡作用，同时也能供给细胞中生存所需的能量和无机盐离子，用作冲洗组织和细胞，配制各种培养用液的基础溶液，也可用于短暂培养。
成分：
水，无机盐，葡萄糖组成。
4、什么是生物安全实验室目前，生物安全实验室的种类有哪些，各有什么特点。
5、动物细胞培养的天然培养基有哪些
天然培养基
1．血浆
最常用的是鸡血浆，它具有一定的营养，与少量鸡胚浸出液混合后，有良好的凝固作用，利于支持细胞的生长。
缺点易液化，一般常用作各种细胞生长的基质。
2．鼠尾胶原
对维持细胞生长有良好作用。
由于鸡血浆存在一定缺点，人们曾试用了很多化药品，其中鼠尾胶原较好。
它能促进组织和细胞的附着，改善生长表面药性。
来源：
燃尾键，豚鼠真皮，牛的真皮和牛眼的水晶体，实验室常用大鼠尾制胶原。
3．胚胎浸出液
主要成分是大分子核蛋白和小分子氨基酸，有刺激细胞生长的作用。
在动物、细胞培养中应用最早，但由它而作了变到使用合成培养液，并渐渐被合成培养液所代替，但在研究中仍有应用价值。
常用的有鸡胚和牛胚。
4．血清
是动物用量最大的天然培养基。
血清含有丰富的营养物质，包括大分子的蛋白质和核酸。
动物细胞的生长和增殖需要血清。
实验证明血清对细胞附着和保护尚有明显作用，且能中和有毒物质的毒性，使细胞不受伤害。
血清种类很多，其中有小牛血清、胎牛血清、马血清、人胚胎血清等，胎牛血清比较理想，但不易得到。
目前各实验室多采用小牛血清。
目前已有出售小牛商品血清。
人血清一般都采用AB型血清，但价格昂贵，很少用。
5．血清代用品
血清的来源比较困难，而且成分复杂，人们努力寻找其替代品，其中有聚乙烯、吡咯咆酮（P、V、P）、蛋白胨、水解乳蛋白等，但都不如血清，因而没广泛使用。
第四章植物组织器官培养技术（教材第四、七、八章）
1、离体无性繁殖（propagationinvitro）：
利用离体培养技术，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，在短期内获得大量遗传形状一致的个体的方法。
也称之为微繁（micropropagation）、快速繁殖（rapidcloneprogagation）。
2、繁殖系数（breedingcoefficient）：
也叫增殖率，指每块外植体在一个培养周期内增殖的倍数.
3、简述离体无性繁殖的程序。
（1）无菌培养物制备，包括：
外植体的选择－外植体灭菌－接种－培养等基本过程。
（2）培养物的增殖
腋芽增殖：
培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖
不定芽增殖：
繁殖系数高，非洲紫罗兰用常规叶插法，每片叶只能产生几个或十几个芽，但在组培条件下可一次形成几十至几百个芽，一年可以培养成千上万个小植株。
遗传稳定性较好。
但继代次数有限。
培养物继代一定次数以后，不定芽形成能力即减弱，需要重新建立起始无菌培养物。
此外，不定芽需要进行生根培养才能形成真正的植株。
诱导不定芽一般需要同时加入外源生长素和细胞分裂素，二者的配比一般是细胞分裂素要略高于生长素，其二者的总体使用浓度应尽可能的低，以免产生过多的愈伤组织。
以保证繁殖品种的遗传稳定性。
胚状体增殖：
增长率高，双极性免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率仍不高。
目前除一些特殊用途外（人工种子），这一途径还没有用于快繁技术。
愈伤组织增殖：
所有的植物通过组织培养的方法均可以诱导愈伤组织，再进一步分化即可获得小植株。
这一途径经历了组织培养技术的所有过程（愈伤组织诱导－愈伤组织增殖－芽分化－生根－完整植株），它属于真正意义上的组织培养。
一切通过其它增殖方式不能成功的植物，均可以通过此途径获得组培苗。
其特点是成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差。
对品种要求遗传稳定性高的作物一般不采用这一途径快繁
原球茎增殖：
细胞或组织培养经原球茎途径分化成植株。
大部分兰花属于这一类型，即兰花的各个部分的离体组织都能诱导形成原球茎，再经培养分化形成植株。
原球茎是兰花种子萌发时产生的呈珠粒状、缩短的、类似嫩茎的器官。
（3）生根培养：
一种是在固体培养基上诱导生根。
当试管苗长到2～3厘米高时，将它从基部切下，转移到固体培养基上生根（生根培养基一般要求降低矿物营养的浓度，提高生长素的浓度，具体应根据植物不同而定）
另一种是浸泡的方法，将切下的无根试管苗泡在含有高浓度生长素溶液中，生长素浓度为100毫克/升左右，浸泡时间从几小时到1天，然后取出接种于不加任何激素的MS培养基上或者扦插在人工基质上，十天左右即可生根。
（4）炼苗和移栽：
将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成新的功能强的根和叶片。
一般炼苗时间为2—3d。
移栽时应注意的问题：
a、防止菌类滋生；
b、保持小苗水分供给平衡
（5）再生植株的鉴定
4、简述当前脱除植物病毒的方法及原理。
茎尖培养脱毒法；
热处理脱毒法；
微体嫁接离体培养脱毒法；
珠心组织培养法；
愈伤组织脱毒
茎尖脱毒：
依据：
病毒在植物体内分布是不均一的，越接近生长点约（区域），病毒浓度越稀，因此有可能采用小的茎尖离体培养而脱除植物病毒。
热处理脱毒法：
①热处理不能杀死病毒。
只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去浸染能力。
②热处理是一种物理效应，可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。
微体嫁接离体培养脱毒法：
同茎尖脱毒。
珠心组织培养法：
一般认为病毒是通过维管组织传播的，珠心组织与维管系统没有直接联系，
因此珠心组织培养可获得无病毒植株。
愈伤组织脱毒：
病毒在植物体内不同器官或同一器官不同组织中分布不均匀，由那些无病毒细胞产生的愈伤组织就是获得无病毒苗的基础。
5、简述脱毒效果如何检测
A指示植物鉴定（indicatortestplants）所谓指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物。
每种病毒都有自己敏感的植物，指示植物鉴定病毒的方法：
a.摩擦接种法：
通过汁液传播的病毒，
b、嫁接法：
通过专门的介体传播的病毒，
B血清鉴定（serologictest）试管沉淀反应；
免疫双扩散；
酶联免疫吸附测定（ELISA）。
C电镜检查法
采用电子显微镜，可直接观察样品材料有无病毒存在，还可以进一步鉴定病毒颗粒大小、形状和结构，这些特征相当稳定，因此电镜检查法即准确又有效，但需要有一定的设备和技术。
D分子检测法
例如RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReation）将待测的样品的总RNA与cDNA合成的试剂盒进行反应，合成cDNA，然后利用病毒DNA特有的序列设计引物进行PCR反应，即可知道在寄主中是否有病毒基因的表达
6、脱毒苗的保存与繁殖。
脱毒苗的离体保存与繁殖:
一般是在实验室进行，一般每月继代一次，可以在培养基中加入生长延缓剂，如B9和矮壮剂可2-3个月继代一次，也可放到液氮或4℃冰箱中保存。
建立脱毒种苗生产繁殖网络体系：
如果试管苗生产成本过高或移栽困难，可将试管苗选择种植在一定的控制区域，从繁殖技术和环境隔离上保证较高水平，使得繁殖的种苗能有效的防止病毒的再侵染。
7、什么是花药培养什么是花粉培养
8、花药培养的基本程序是：
外植体选择－外植体（花蕾）预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养-移栽
9、花药培养中如何选择外植体
基因型的选择
通过花药培养成功获得单倍体植株最多的是茄科植物，其次是十字花科、禾本科、百合科等植物。
同一植物的不同类型、不同品种对花药培养的反应也是不同的。
因此在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培养成功的材料来做。
供试材料的生理状态
在多年生植物中，幼年植株比老龄植株的花药诱导频率高。
草本植物生长健壮、且处于生殖生长高峰期的花药诱导频率高，徒长或营养不足的植株花药培养的诱导频率低。
花粉的发育时期：
最适期：
单核花粉—双核花粉
涉及到具体的植物，花药培养的取材时期并不绝对相同，如番茄以减数分裂期的幼嫩花药为好，而云苔属植物的某些材料则以花粉成熟时的花药为好。
10.花药培养与花粉培养的区别
11、影响花药培养的因素有哪些
①基因型
②发育时期
③植株的生理状态
④预处理
⑤培养基和培养条件
⑥花药的接种密度（密度效应）
⑦培养的方法与方式：
固体培养、液体培养（Ficoll）、双层培养、分步培养、条件培养
12单倍体植株的染色体加倍方法（P155）
方法：
用的多的为化学诱变法，常用的诱变剂有秋水仙素、富民农、对二氯苯、8-羟基喹啉等，其中加倍效果最好的为秋水仙素。
秋水仙素：
地中海一带生长的一种百合科植物秋水仙，秋水仙素是由秋水仙的种子和球茎提取出来的物质，分子式为C22H25NO8。
秋水仙素的特性：
能溶于水、酒精、三氯甲烷，可以阻止细胞有丝分裂时纺锤丝的形成。
a．小苗浸泡法：
将再生小植株从试管中取出，在无菌条件下用秋水仙素直接浸泡，然后再至新鲜培养基中培养。
烟草：
浓度%～%，时间24～48hr，加倍率35%
大麦：
浓度%～%，时间1～5d，加倍率40%～60%
b．生长锥处理：
将适宜浓度的秋水仙素，调和在栽体羊毛脂中，然后将羊毛脂涂抹在单倍体植物的顶端分生组织和次生分生组织上，诱导分生组织细胞染色体加倍；
也可将秋水仙素配成水溶液，用蘸满溶液的棉球置于顶芽和腋芽上诱导生分组织细胞染色体加倍。
两种方法均需加盖塑料布以防止蒸发。
浓度%～%（羊毛脂），时间24～48hr，加倍率25%
茄子：
浓度%～%（水溶液），时间40～42hr，每隔4hr滴加一滴水，加倍率为%
c．培养基加倍：
将单倍体植株的任何一部分做为外植体，使其在附加一定浓度的秋水仙素的培养基中诱导成株，在植株再生过程中加倍。
第五章人工种子（教材第三章）
什么是人工种子
狭义的概念是指植物离体培养中产生的胚状体（包括体细胞胚和性细胞胚），包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。
广义而言，人工种子是在胚状体或一块组织（顶芽、腋芽）、一个器官（小鳞茎等）之外加上必要的营养成分（人工胚乳）后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成的与天然种子相似的颗粒体
人工种子的结构
人工种子分类
根据Redenbaugh对人工种子的分类方法，可将人工种子分为三大类：
裸露的或休眠的繁殖体如微鳞茎，微块茎等。
它们在不加包被的情况下也具有较高的成株率。
人工种皮包被的繁殖体一些体细胞胚、原球茎等不能过度干燥，但只需要用人工种皮包被即可维持良好的发芽状态，如胡萝卜体细胞胚。
水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体大多数体细胞胚、不定芽、茎尖等均需要先包埋在半液态凝胶中，再经人工种皮包裹才能避免失水，从而维持良好的发芽能力。
第六章细胞培养（教材第五章）
1、分离植物细胞的方法有哪些
a）由完整的植物器官分离单细胞：
叶片是分离单细胞的最好材料。
有机械法和酶解法。
只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功
b）由培养组织分离单细胞：
诱导产生愈伤组织；
愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；
将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物
2、植物单细胞培养的方法有哪些
c）细胞平板培养
d）看护培养
e）微室培养
f）其它单细胞培养技术
A饲养层培养基技术
B双层滤纸植板培养方法
3、细胞悬浮培养中，如何计量细胞的生长量
A、细胞记数
B、细胞大小的测定技术（用显微测微计）
C、细胞体积：
D、细胞的干重和鲜重。
E、有丝分裂指数
4、一个成功的悬浮细胞培养体系的特征。
悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。
均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。
悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。
细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。
5、影响悬浮细胞生长的因素。
起始愈伤组织的质量：
松散性好、增殖快、再生能力强。
其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。
接种细胞密度：
接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在～×
105个细胞/毫升，低于这一密度则会使细胞生长延迟。
培养条件：
方式、温度、继代周期
6悬浮培养细胞同步化方法。
物理方法
1）分选法
通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。
2）冷处理法。
低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度
化学方法
1）饥饿法
悬浮培养细胞中，若断绝供应一种细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当在培养基中重新加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。
2）抑制剂法
通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期的细胞。
常用的抑制剂有5-氟脱氧尿苷，5-氨基尿嘧啶、羟基尿等。
3）有丝分裂阻抑
用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度一般控制在%，处理时间以4-6小时为宜
7、悬浮细胞系在继代培养中其群体生长规律
细胞生长各个时期的特点：
滞后期（延迟期）:
细胞很少分裂，其长短与接种量，大小和继代时原种细胞所处的生长期有关
对数生长期:
细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变
直线生长期:
细胞生长和发育最明显的时期
缓慢期:
生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少
静止期:
生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。
8、植物细胞规模培养技术要点
细胞系的建立和选择
悬浮细胞系
单细胞养与筛选
种细胞增殖
优良细胞系的增殖培养
所选择的优良细胞系，进行大规模繁殖，得到足够的细胞是建立细胞规模化培养体系的中间环节。
大规模培养体系的建立
一步法逐级放大：
对于细胞生长与目的产物合成同步的类型，一般采用此方法建立大规模培养系统。
两步法：
用于目的产物合成在细胞生长发育到一定时期进行，细胞生长和产物合成需要不同的培养基的类型。
先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基中培养。
如果采用固相培养方式生产次生产物，一般均需采用两步法建立体系。
9、在植物细胞规模培养中如何提高植物次生代谢产物的产量（P102）
答：
明确植物细胞生长与产物合成的关系
选择适宜的起始材料
选择合适的培养基成分
加入次生代谢产物合成的前体物质
激发子的应用
培养技术的选择：
固定化培养是植物细胞规模化生产较为理想的系统
第七章细胞融合（教材第六、十三章）
1、细胞融合又称体细胞杂交,是指将不同来源的原生质体相融合并使之分化再生,形成新物种或新品种的技术。
2、诱导原生质体融合的方法
•有三大类：
生物法（病毒法）仙台病毒、新城鸡瘟病毒、流感病毒及疱疹病毒。
•原理：
病毒或其组分在细胞间起粘连作用使细胞聚集成团，致使不同细胞的膜蛋白及膜脂质分子重新排布而结合成一个整体，从而完成细胞融合过程。
PEG诱导融合法：
这种方法是一项培养大批体细胞杂种植株的卓有成效的技术，也是应用最早的化学融合方法。
PEG具有强烈吸水性及凝集和沉淀蛋白质作用，对植物及微生物原生质体和动物细胞的融合均有促进作用。
当不同种属的细胞混合液中存在PEG时，即产生细胞凝集作用，在稀释和除去PEG过程中即产生融合现象。
高[Ca2+]和高pH值诱导
高钙、高pH值及PEG结合诱导法
离子诱导融合法
琼脂糖融合法
电融合诱导法：
交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠；
施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。
磁-电融合法
超声-电融合法
电-机械融合法
3、体细胞杂种的筛选方法
遗传互补筛选法：
利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。
抗性互补筛选法：
利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞
利用物理特性筛选法：
根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞
利用生长特性筛选法：
利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞
第八章动物细胞与组织培养（教材第十二、十四克隆技术、十五章干细胞）
1、相关概念
原代培养：
亦称初代培养，指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程。
原代细胞：
指实效培养的细胞大约增殖10代左右，称为原代细胞
传代培养：
亦称继代培养，从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养。
细胞系：
指由初代培养产生的能进行无限次传代培养的细胞群
组织工程：
是应用细胞生物学和工程学原理，将人体某部分组织细胞种植和吸附在一种生物材料的支架上进行人工培养繁殖、扩增，然后移植到人体内所需要的部位，从而达到器官修复的或再造的治疗目的的一种技术
干细胞：
是一类具有自我复制和分化潜能的细胞。
即是一群尚未完全分化的细胞，同时具有分裂增殖成与本身完全相同的细胞，或分化成为多种特定功能的体细胞两种特性。
克隆：
本意是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。
现指一种实现无性繁殖方式产生克隆群体的操作过程或手段。
2、动物细胞之间主要连接形式
1）．紧密连接
2）．间隙连接
3）．桥粒连接
4）．隔壁连接
5）．中间连接
3、在体外按照培养细胞的形态不同，主要可分为以下几类：
1）．成纤维细胞型细胞
2）．上皮型细胞
3）．游走型细胞
4）．多行型细胞
4、动物细胞培养的传统方法
1）．悬滴培养法
2）．旋转管培养法
3）．灌注小室培养法
4）．培养瓶培养方法
5）．培养板培养法
5、动物细胞大规模培养技术
1）．悬浮培养技术
2）．微载体培养技术
3）．多孔载体培养
4）．微囊化培养技术
5）．中空纤维法
6、简述组织工程的三要素。
细胞、支架、信号
A、细胞必须能不断进行细胞分裂，且必须能被调控分化成特定的组织细胞。
胚胎干细胞、成体干细胞；
组织来源细胞：
自体或异体。
B、组织生长支架需求：
（1）、生物亲和性
（2）、生物可降解性（3）、三维内部连通孔隙（4）、具备支架强度。
常用的有蛋白质支架、多糖支架、磷酸钙基生物材料、硫酸钙基生物材料。
C、生长因子
表皮生长因子：
是对上皮细胞增殖有很
强促进作用的53个氨基酸残基的多肽。
神经生长因子：
为神经细胞特异性分泌的营养蛋白。
肝细胞生长因子：
为728个氨基酸残基单链组成。
骨形态发生蛋白：
能诱导或刺激新骨的生成。
7、组织工程的技术路线。
（1）体外得到工程化组织、移植——目前主要的方式
（2）细胞与支架前体混合注射体内，原位形成凝胶支架，提供新组织形成的空间
8．动物器官培养的特征。
（1）被培养的器官在体外存活较长时间，并保存相对正常的功能，器官内的细胞有正常的代谢甚至增殖。
而器官保存无细胞增殖
（2）被培养物为一完整器官或具有完整功能的某一器官的一部分，如肝
（3）器官培养不能从一
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