引物合成常规问题.docx
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引物合成常规问题
瞬成常规问题
LGGROUPsystemofficeroom[LGA16H-LGYY-LGUA8Q8-LGA162]
Q1.引物是如何合成的？
U前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
（1）去保护：
加入Deblocking脱去碱基上5'-0H的保护基团DMT,获得游离的5'-0H:
（2）耦合：
同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-0H仍然被DMT保护，3'端被活
化与溶液中游离的5'-0H发生耦合反应；
（3）封闭：
耦合反应中极少数5'-0H没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生
反应；
（4）氧化：
加入氧化剂使其山核昔亚磷酸酯形成更稳定的核昔磷酸酯。
Q2引物合成后如何处理？
切割与脱保护基：
将合成好的寡核昔酸链从支持物上化学切割下来。
常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核甘之间的酯键。
断裂下来的寡核昔酸带有自山的3'羟基。
纯化：
根据所合成寡核昔酸的组成和应用来选定纯化的方法。
常用的纯化方法有：
C1
8、
0PC、PA
GE
和
H
PLCo
定量
:
根据
寡核昔酸在260n
m处的
紫外
吸
收来定量。
储
存
:
分
装
抽
干。
长度要求
HEP
的质量是不是
难度最大
四种碱基的性质和各自保护基的性质都有差别。
所以合成难度是不一样的。
的当属GC重复多的和序列中还有多个连续的G的引物。
尤其对于后者，国内公司一般都做不了20个G以上的引物。
实验证明，如果引物中有超过三个连续G的结构，传统方法得到的产物质量就会开始下降。
而且LI前通用的脱盐、0PC和PAGE方法都无效。
鼎国昌盛生物公司拥有的HEPD专利技术能够克服高GC或者高G含量引物的合成和纯化障碍，对普通引物、高GC引物和无论长短的oligod（G）都能得到同样的非常好的结果。
Q5^需要合成多少0D数
根据实验口的确定。
一般PCR扩增，20D引物，可以做500-1000次50ul标准PCR反应。
如果是做基因拼接或退火后做连接，10D就足够了。
Q6如何计算引物的浓度
引物保存在高浓度的状况下比较稳定。
一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成100Pmol/ul,称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ulo加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方式计算：
V（微升）二0D数x33x10000/引物的分子量
引物的分子量可以从合成报告单上获得。
注意：
10D260二33ug/mlo
Q7如何IT算引物的Tm值
引物设计软件都可以给出Tm,与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有
对于
更长
的
寡聚核昔酸，
Tm计算公式为：
Tm=
+
X
LoglO[Na+]+
（GC%）-600/size*
*公
式
中
Size
=引物长度。
Q8・
引物
（
含修饰）的分
子量是如何确定的？
非修饰的引物的分子量（MW）在随引物提供的报告单上可以找到。
如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为，引物的分子量二碱基数x碱基的平均分子量，或按下列公式计算MW二（NA*WA）+（NC*WC）+（NG*WG）+（NT*WT）+（Nmod*Wmod）+（Nx*Wx）+（XI*WI）+16*Ns-62.
NA,NG,NC,NT,NI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA,WG,WC,WT,WI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod,Wmod分别为修饰基团的数目和分子量。
对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（+）/2二。
Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。
常规碱基分子量
BaseMolecularWeight
G
T
I
u
3，
-Amino
3，
-Amino
3'-Thiol
分子量
3,-TAMARA
3-Dabsy1
-（6FAM）
ModifierC3
ModifierC7
ModifierC3
Q9如何溶解引物？
干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好瞬时离心一下，或管垂直向上在桌面上敲
敲，将引物粉末收集到管底。
根据计算出的体积加入去离子无菌水或TE缓冲液，室温放置儿分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。
溶解引物用的水一般不要用蒸镭水，因为有些蒸镭水的pH值比较低（pH4-5），引物在这种条件下不稳定。
Q10.如何保存引物？
引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成无色或口色絮状干粉。
干粉：
运输时常温运输，-20°C可以保存一年。
储存液：
配好后分装成儿管，避免反复冻融，-20°C可以保存半年。
工作液：
常规使用，4°C保存，也可-20°C保存，但应避免反复冻融。
修饰荧光引物：
需要避光保存，尽快使用为宜。
Q11.最长可以合成多长的引物
我们合成过lOObase的引物，但是产率很低。
除非需要，建议合成片段长度不要超过
80baseo引物越长，出现问题的概率就越大，按照日前的引物合成效率，大于SObase
的粗产品，全长引物的百分比不高，后续处理还有丢失很多，最后的产量很低。
Q12.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高
主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。
修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。
修饰引物使用的原料是一般引物原料的儿百倍，所以产品的价格也高。
Q13.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题
连接反应需要引物的5'磷酸基团。
如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。
磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。
SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。
Q14.为什么引物的0D260/0D280小于
需要指出的是0D260./0D280的比值不能用来衡量引物的纯度。
0D260/0D280的比值过低一般是由于引物中C/T的含量比较高所致。
下表是一个20base同聚体引物的0D260/0D28Q的比值，清楚表明0D260/0D280的比值与引物的碱基组成密切相关。
A260/280ratiosofCrude20-mer
OligosofDifferingBaseCompositions
Q15.同样的0D用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量（如质粒DNA）,因为EB可以嵌合到双链DNA中。
而合成的单链DNA,山于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo（dT）等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。
所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。
Q16.如何检测引物的纯度
实验室方便的做法是用PAGE方法。
使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
取的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95°C,2mins）o加入尿素的LI的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。
600V电压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
如果条件许可，也可以用银染方式染色。
Q17.已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？
如果您溶解引物的水pH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。
使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。
建议分装引物，避免反复冻溶。
建议使用10mMTris缓冲液溶解引物，因为有些蒸憎水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。
还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。
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