生物化学之核酸化学.docx

生物化学之核酸化学.docx

《生物化学之核酸化学.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学之核酸化学.docx（14页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

生物化学之核酸化学

第三章核酸化学（NucleicAcidsChemistry）

第一节概述

一、核酸的发现与发展

二、核酸的类别和分布

　　脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacidDNA）

　　核糖核酸（ribonucleicacidRNA）

DNA在生物体内的存在部位和方式：

–原核细胞中DNA集中在核区；

–真核细胞中DNA集中在核内，组成染色体。

–线粒体和叶绿体等细胞器也含有少量DNA。

–原核生物染色体DNA、质粒DNA、真核生物细胞器DNA都是环状双链DNA。

–真核生物染色体是线性双链DNA，末端具有高度重复序列形成的端粒（telomere）结构。

染色体（Chromosomes）、基因（Gene）、DNA

–染色体：

是细胞核内能被碱性染料着色物质的螺旋聚集体，是遗传信息的载体。

–基因：

是存在于染色体上的遗传信息

–DNA：

是遗传信息的载体

RNA（核糖核酸）∶

–主要分布在细胞质中，与蛋白质合成密切相关

　　RibosomalRNAs（rRNA，核糖体RNA）占80%以上：

与蛋白质构成核糖体，是合成蛋白质的场所

　　MessengerRNAs（mRNA，信使RNA）占5%：

合成蛋白质的模板

TransferRNAs（tRNA，转运RNA）占15%：

在蛋白质合成中运输氨基酸

应用与生产：

　　在食品方面∶强力助鲜剂，如肌苷酸和鸟苷酸。

　　在医药方面∶ATP、COA等。

第二节核酸的组成

核酸的化学组成：

除含C、H、O、N外，还含有较多的磷和少量的硫，含磷量在9－10％

一、磷酸（phosphate）

　　OH

HO-P=O

　　OH

二、戊糖（pentose）

三、碱基（nitrogenousbase

碱基∶是一类含氮的有机小分子

嘌呤（purine）：

　　腺嘌呤adenine（A）

　　鸟嘌呤guanine（G）

嘧啶（pyrimidine）：

　　胞嘧啶cytosine（C）.

　　尿嘧啶uracil（U）

　　胸腺嘧啶thymine（T）

（1）含酮基的嘧啶和嘌呤碱都有酮和烯醇式互变异构现象，且处于平衡状态。

（2）在生理PH时，酮式占优势且通过糖苷键与戊糖结合也是这个形式。

烯醇式的-OH的H可以解离，呈酸性。

即酮与烯醇式互变异构现象与核酸解离有关

　　鉴定：

嘧啶与嘌呤碱分子中都有共轭双键，在260nm有强烈吸收，每一碱基具有特殊的UV吸收光谱，利用此性质可鉴定不同的碱基。

由于酮式与烯醇式的互变异构现象，UV吸收光谱随PH的改变而改变。

此外，嘌呤碱可被银盐沉淀，可用于分离嘌呤和嘧啶。

四、核苷（nucleoside）

　　核苷是核糖与碱基（嘌呤碱或嘧啶碱）结合物。

　　嘌呤核苷是嘌呤的第9位N与核糖或脱氧核糖第1´位碳连接；

嘧啶核苷是嘧啶的的第1位N与核糖或脱氧核糖第1´位碳连接；

五、核苷酸（nucleotide）

核苷酸是核苷的磷酸酯。

核糖核苷酸的磷酸酯有三种形式（2´、3´和5´位）；

脱氧核糖核苷酸的磷酸酯有两种形式3´和5´位）。

　　M-单（D-二、T－三）；P-磷酸

　　RNA的名称为某（单、二、三）苷酸，DNA在某（单、二、三）前加脱氧两字。

如AMP称腺苷—磷酸（或腺苷酸），dAMP称为脱氧腺苷—磷酸（脱氧腺苷酸）。

稀有核苷酸与上类似；

　　许多激素是通过cAMP发挥功能的，所以它被称为激素作用的第二信使，激素是第一信使。

六、稀有组分（Minorcomponents）

　　稀有组分是稀有碱基和稀有核苷的总称。

1、稀有碱基（Minorbases）∶

　　次黄嘌呤（I）、黄嘌呤（X）、5-甲基胞嘧啶（m5C）、二氢尿嘧啶（Dhu）、5-羟甲基胞嘧啶（hm5C）

2、稀有核苷（Minornucleoside）

　　假尿嘧啶核苷（Ψ）、次黄嘌呤核苷、二氢尿嘧啶核苷。

第三节核酸的结构

一、DNA的一级结构

DNA的一级结构是指DNA上的核苷酸排列顺序。

（核苷酸相当于氨基酸、单糖的角色）

核酸的一级结构

　　核酸的一级结构是指单核苷酸之间的连接方式。

　　DNA、RNA都是由许多核苷酸通过3´、5´磷酸二酯键将前一个核苷酸与后一个核苷酸连接起来，形成无分支的多核苷酸链。

　　在链的一端的一个戊糖的3´位上OH是游离存在的，另一端的戊糖其5位上连有一个磷酸基团呈单磷酸酯状态，这两个末端分别称为3´末端及5´末端。

DNA一级结构的简写形式

核苷酸顺序又称碱基顺序，是蛋白质与RNA结构的生物语言。

二、DNA的空间结构

1、DNA的二级结构

DNA双螺旋结构模型的要点∶

（1）DNA分子是由两条反平行的多聚脱氧核苷酸链，绕同一中心轴盘旋形成的右手螺旋结构；

（2）每条主链由脱氧核糖与磷酸通过3´、5´磷酸二酯键连接而成，并位于螺旋外侧。

碱基位于螺旋内侧，碱基平面与螺旋中心轴垂直。

螺旋表面有两条螺旋形的凹槽∶大沟和小沟。

　　（3）双螺旋的直径是2nm，沿中心轴，每一个螺旋周期有10个核苷酸对，螺距是3.4nm，碱基对之间的距离为0.34nm。

　　（4）两链间的碱基以氢键互相配对。

A与T配有两个氢键，G与C配有三个氢键。

　　DNA分子所含嘌呤碱基的总数等于嘧啶碱基的总数（即A+G=T+C）－－－碱基当量定律。

DNA碱基组成的Chargaff规则

（1）腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，即A＝T

（2）鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔数也相等，即G＝C

（3）含氨基的碱基（腺嘌呤和胞嘧啶）总数等于含酮基的碱基（鸟嘌呤和胸腺嘧啶）总数，即A+C=G+T

（4）嘌呤的总数等于嘧啶的总数，即A+G=C+T

　　所有DNA中碱基组成必定是A=T，G=C这一规律暗示A与T,G与C相互配对的可能性，为Watson和Crick提出DNA双螺旋结构提供了重要根据。

　　大部分DNA所具有的双螺旋结构，亦称为B型

双螺旋结构的稳定因素

DNA双螺旋在生理状态下十分稳定，结构不发生变化。

提问：

起稳定作用的有哪些力呢？

疏水作用力（主要）（又称碱基堆积力）、氢键、范德华力

　　稳定DNA双螺旋的力∶碱基间的氢键、碱基堆积力（每条链上相邻碱基平面之间的疏水作用）

DNA双螺旋的种类∶A-DNA、Ｂ-DNA（右旋DNA）、C-DNA、Z-DNA（左旋DNA）

2、DNA的三级结构

DNA的三级结构是指双螺旋DNA的扭曲或再螺旋。

　　开环形----由直链双螺旋DNA分子两端连接而成，其中一条链留有一个小缺口。

　　闭环超螺旋形----是双链环形DNA扭曲成麻花状。

　　发夹形----DNA变性后在反相重复序列时，可形成发夹形。

　　DNA也可聚合成二聚体和三聚体。

Ⅱ、RNA的结构

一、RNA的一级结构（以mRNA为例）

　　RNA分子的基本结构是一条线性的多核苷酸链，由四种核糖核苷酸以3‘，5’-磷酸二酯键连接而成。

1、原核mRNA的一级结构的特点∶

　　在5‘末端和3’末端无特殊结构，原核mRNA一般为多顺反子。

　　顺反子∶是指mRNA上对应于DNA上一个完整基因的一段核苷酸序列。

　在mRNA分子内部，每一个顺反子的编码区是从起始密码（AUG）开始，到终止密码（UAG）为止。

各个顺反子的编码区之间、5‘端的第一个顺反子的编码区之前以及3’端的最后一个顺反子编码区之后，都含有一段非编码区。

2、真核mRNA的一级结构的特点∶

　　真核的mRNA一般为单顺反子，即一条mRNA链只翻译产生一条多肽链。

其结构模式为∶

5’-帽子-5’非编码区-编码区-3’非编码区-多聚A

　　多聚腺苷酸（多聚A）的尾的作用是延长mRNA的寿命，从而可以增加蛋白质合成的数量。

此外，还有助于mRNA穿过核膜，进入细胞质执行其模板功能

二、RNA的空间结构（以tRNA为例）

　　RNA的二级结构是指单链RNA分子自身回折，链内的互补碱基配对，形成局部双螺旋区，未配对的部分则形成突环相间分布成花形结构。

1、tRNA的二级结构

　　tRNA的二级结构呈三叶草形。

tRNA的结构特点：

（1）、分子量在25kd左右，由70－90个核苷酸组成，沉降系数在4S左右；

（2）、碱基组成中有较多的稀有碱基；

（3）、3‘末端都为…CpCpAOH用来接受活化的氨基酸。

所以这个末端称接受末端；

（4）、5‘末端大多为pG…,也有pC…的；

（5）、tRNA的二级结构都呈三叶草形。

双螺旋构成了叶柄，突环区好象是三叶草形的三片小叶。

　　由于双螺旋结构所占比例甚高，tRNA的二级结构十分稳定。

三叶草形结构由氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码环、额外环和TψC环等5个部分组成。

（1）、氨基酸臂（aminoacidarm）由7对碱基组成，富含鸟嘌呤，末端为CCA，接受活化的氨基酸。

（2）、二氢尿嘧啶环（dihydrouridineloop）由8一12个核苷酸组成，具有两个二氢尿嘧啶，故得名。

通过由　　3－4对碱基组成的双螺旋区（也称二氢尿嘧啶臂）与tRNA分子的其余部分相连。

　　（3）、反密码环（anticodonloop）由7个核苷酸组成。

环中部为反密码子，由3个碱基组成。

次黄嘌呤核苷酸（也称肌苷酸，缩写成I）常出现于反密码子中。

反密码环通过由5对碱基组成的双螺旋区（反密码臂）与tRNA的其余部分相连。

反密码子可识别信使RNA的密码子。

（4）额外环（extraloop）由3一18个核苷酸组成。

不同的tRNA具有不同大小的额外环，所以是tRNA分类的重要指标。

（5）假尿嘧啶核苷－胸腺嘧啶核糖核苷环（TψC环）由7个核苷酸组成，通过由5对碱基组成的双螺旋区（TψC臂）与tRNA的其余部分相连。

除个别例外，几乎所有tRNA在此环中都含有TψC。

2、tRNA的三级结构∶

　　RNA的二级花形结构在细胞中进一步回折扭曲，使分子内部的自由能达到最小，在二级结构中突环上未配对的碱基由于RNA链的再度扭曲与另一突环上的未配对碱基相遇，形成新的氢键配对关系，其结果是平面花形结构变成立体花形结构。

　　rRNA的二级结构也为三叶草形

第四节核酸及核苷酸的性质

一、一般理化性质∶

　　DNA的相对分子量很大（106-109），白色絮状；

　　RNA的相对分子量较小（1-10万），白色粉末或结晶状。

均为极性化合物，难溶于有机溶剂。

核苷酸含有碱基和磷酸基故为两性电解质，在一定条件下能形成两性离子。

因磷酸基的酸性比碱基的碱性强，故核苷酸的等电点偏酸性。

在PH相当低的情况下仍然保留其阴离子性质。

核酸和核苷酸一样是两性电解质，PI偏酸性，在中性和碱性溶液中呈阴离子，能与金属离子，碱性染料或其它碱性物质相结合。

　　0.14mol/L法分离DNA蛋白（DNP）和RNA蛋白（RNP）：

DNP在0.14mol/L的NaCl中溶解度最小，而RNP在0.14mol/L的NaCl中溶解度最大达到分离。

二、紫外吸收性质∶

嘌呤碱和嘧啶碱均含有共轭双键，因此，核苷、核苷酸、DNA和RNA在240nm～290nm范围内均有紫外吸收。

最大吸收峰在258nm～260nm。

核酸的紫外吸收强度常用吸光度（A）和E（p）来表示。

　　E（p）表示每升含有1摩尔磷的核酸溶液（pH=7）的消光系数。

在260nm波长天然RNA的E（p）在7000～10000之间；而DNA的E（p）在6000～8000之间。

核酸的紫外吸收性质可以用于鉴定DNA和RNA的纯度，常用A260/A280比值来判断。

纯DNA∶A260/A280=1.8

纯RNA∶A260/A280=2.0

若样品的蛋白质含量增加，A260/A280比值下降。

增色效应（hyperchromiceffect）∶当核酸变性或降解时，其紫外吸收显著增强，这就是核酸的增色效应。

减色效应（hypochromiceffect）∶当变性的核酸在一定条件下恢复其原有的性质时，其紫外吸收的强度又可恢复到原有的水平，这种现象称为减色效应。

三、核酸和核苷酸的两性解离∶

　　在核酸和核苷酸分子中，既含有可以给出H+的磷酸基团，又含有可以得到H+的碱性基团（碱基上的-N=，如嘌呤的N1和N7，胞嘧啶的N3），所以核酸和核苷酸是两性化合物，有等电点。

四、核酸的变性、复性和分子杂交

1、变性∶

（1）概念∶

　　核酸变性是指核酸分子中双螺旋区域的碱基对之间的氢键受某些理化因素的作用而破坏，变成单链的过程。

核酸变性不涉及共价键的断裂，所以变性后相对分子量不变，但其理化性质和生物功能都会发生变化，最重要的表现为∶

溶液粘度降低

沉降速率增加

紫外吸收显著增强∶DNA可增加20-25%

RNA可增加10%左右。

生物功能丧失或减弱。

（2）引起核酸变性的因素∶

高温

极端pH（pH>10或pH<4）

变性剂（如∶尿素等）

（3）DNA的变性温度（Tm）:

　　DNA的变性不是随温度升高而逐步发生的，而是当温度达到某一数值时，在很窄的温度范围内，变性突然发生并迅速完成，就象晶体物质达到熔点时突然融化一样，这一温度就称为DNA的变性温度，也称为DNA的熔点，用Tm来表示。

实际上，Tm是增色效应达到最大值的50%时的温度。

也就是说，DNA溶液的温度达到Tm时，将有50%的DNA双链处于解链状态。

DNA的Tm一般为70～85℃。

Tm随DNA分子中G-C碱基对含量的增加而升高。

它也与溶液的离子强度有关，一般情况下，离子强度低，Tm值小。

2、DNA的复性∶

　　变性的DNA在适当条件下，两条彼此分开的互补单链又可以恢复碱基配对，重新成为双螺旋，这个过程称为DNA的复性（DNArenaturation）。

　　复性后的DNA的某些理化性质和生物活性也可以得到部分或全部恢复。

如∶减色效应。

退火（annealing）:

　　即DNA由单链复性变成双链结构的过程。

来源相同的DNA单链经退火后完全恢复双链结构，同源DNA之间、DNA和RNA之间退火后形成杂交分子。

　　一定条件下，去除变性因素后，核酸恢复二级结构及生物活性的现象；

与复性有关的因素∶

（1）降温速度。

若热变性的DNA从高温（Tm）迅速冷却至低温（4℃以下），则不能复性，此过程称为淬火。

（2）DNA溶液的浓度越大，互补DNA链片段碰撞机会越多容易发生复性。

　　（3）DNA片段越大，DNA内部的顺序越复杂，扩散速度也越慢，互补链的相遇机会也越小，复性也越难。

3、分子杂交（ThehybridizationofDNA）∶

　　不同来源的变性DNA，若彼此之间有部分互补的核苷酸顺序，当它们在同一溶液中进行热变性和退火处理时，可以得到分子间部分配对的缔合双链，这个过程称为分子杂交。

应用类似的方法也可用于分析RNA、蛋白质。

将RNA变性后转移到硝酸纤维素膜仁再进行杂交，这方法称Northern印迹法（Northernblotting）。

　　根据抗体与抗原可以结合的原理，也可以分析蛋白质。

这个方法称Western印迹法（Westernblotting）

应用核酸杂交技术，可以将含量极少的真核细胞基因组中的单拷贝基因钓出来

六、核酸的呈色反应

　　分子中含有核糖和磷酸，它们可以分别与专一性的化学试剂发生颜色反应，作为定性、定量检测核酸的依据。

（1）核糖的地衣酚（3，5-二羟基甲苯）反应∶

用于定量测定RNA的含量。

（2）脱氧核糖的二苯胺反应∶

　　用于定量测定DNA的含量。

（3）核酸中磷酸的定量测定∶经典的钼蓝法

一般情况下RNA和DNA的含磷量分别为9.2%和9.5%。

核酸的分离和纯化

　　核酸的分离视用途不同采用不同的方法，如稀碱提取法，盐溶液提取法等。

核酸的纯化主要有超离心法、凝胶电泳法、柱层析法等。