细胞传代实验报告Word文件下载.docx

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总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。

每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：

健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。

多做，熟能生巧篇二：

细胞生物学实验传代培养

一、【实验目的】

1、了解动物细胞传代培养的基本原理。

2、掌握动物细胞传代培养的基本操作，并对hela细胞进行传代培养。

二、【实验原理】

hela是henriettalacks的简称，henriettalacks是一位患有子宫颈癌的美国妇女的名字，在她死后，该细胞走被广泛散发到各研究机构，并无限次地繁殖分裂下去。

培养细胞的特性：

贴附生长：

必须贴附于支持物表面才能生长。

见于各种实体瘤细胞。

悬浮生长：

于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。

见于各种造血系统肿瘤细胞。

每代贴附生长细胞的生长过程：

1、游离期细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。

此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。

10分钟一4小时

2、贴壁期细胞附着于底物上，游离期结束。

细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。

3、血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，

悬浮细胞再与吸附有促贴

壁因子的附着。

4、潜伏期此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。

细胞株潜伏期一般为6～24小时。

5、对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。

6、停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂

细胞传代方法

1、悬浮生长细胞传代

离心法传代：

离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。

直接传代法：

悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。

2.悬浮生长细胞传代（hela细胞）

此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。

3、贴壁生长细胞传代

采用酶消化法传代。

常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。

细胞培养用液的配制

1、d-hanks原液试剂配方

氯化钠80.0g磷酸氢二钠（nahpo·

2ho）0.6g氯化钾4.0g磷酸二氢钾0.6g三蒸水1000ml

2、d-hanks工作液试剂配方

d-hanks原液100ml三蒸水896ml0.5%酚红液4ml

3、消化液：

胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。

胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。

胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无ca2+、mg2+的pbs缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。

用滤器过滤除菌。

胰蛋白酶液消化时间：

2-10分钟。

用含血清培养液终止其对细胞的消化作用

完全培养基的组成

基础培养基80％一95％

血清5％一20％（一般加10％）

碳酸氢钠2.0g/l

青、链霉素各100卑位／毫升

血清质量好坏是实验成败的关键。

常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。

优质血清的标准：

透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。

血清的灭活（消除补体活性）：

56℃，30分钟

血清的消毒：

过滤除菌

三、【实验材料】

实验用具：

离心管（2支），移液枪（每个台面一把），枪头，吸管（4根），培养皿（每组2个）

实验药品：

0.25％胰酶，d－hanks，1640培养基

四、【实验操作】

1.用75%乙醇擦手，取离心管一个，打开超净台（照明、风机），把离心管置于架子上。

然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。

取尖吸管、吸量管各一支，套好吸球，放置在专用的架上。

2．从冰箱中取出0.25％胰酶、d－hanks、培养基。

可以把胰酶和d－hanks的瓶盖打开或者拧松。

3.取待传代的细胞，用尖吸管弃去旧的培养基，加入d－hanks。

轻轻摇动后将hanks弃掉。

4.用尖吸管吸取适量胰酶加入，加入的量以覆盖整个细胞培养面为宜，轻轻摇动。

2－5分钟后迅速将消化液吸出。

消化时间长短是实验成败的关键，宁可短消化，不能过消化。

否则细胞会变死。

在倒置显微镜下观察，当细胞质回缩，胞间间隙加大为消化适宜。

5．取培养基加入细胞，反复轻轻吹打培养皿壁，制备细胞细胞悬液。

吹打的部位均匀，从上到小，从左到右，顺序进行吹打，保证各个部位的培养细胞均能吹打

到，成片的细胞已经分散成小的细胞团或者单细胞便停止吹打。

吹打时用力不要过猛，尽量不要出现气泡，以免损伤细胞。

6．至所有细胞从培养皿底部脱落下来，然后吸取至离心管中。

1000rpm离心5分钟。

（无需准确计数时离心可略）

7．细胞离心毕，尖吸管弃去上清，吸取培养基适量，加入离心管，将细胞重悬、吹匀。

8．吸量管吸取适量培养基1.5ml加入新的培养皿中。

细胞悬液0.5ml加入新的培养皿中，培养密度为1×

105－×

106/ml。

显微镜下观察，摇匀，放入37度c02培养箱孵育。

9．待培养基（本身为红色），当ph值降低，培养基呈偏淡红色时，一般2天以后，将旧的培养基吸掉，更换新鲜培养基继续培养。

五、【实验现象】

培养基：

rm1640培养基＋10%胎牛血清

六、【实验讨论】

注意事项

1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。

所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。

每次最好只进行一种细胞的操作。

每一种细胞使用一套器材。

培养用液应严格分开。

2．每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：

3．如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞

，

如果必须挽救，可加含有抗生素的bss或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等篇三：

原代细胞培养实验报告

实验：

细胞培养

1.实验目的

初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。

2.实验原理

从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。

细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。

近年来，在体细胞遗传、分化、胚胎发生、肿瘤发生、免疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕的成果。

细胞培养可分为原代培养和传代（继代）培养。

直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；

当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：

2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。

细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。

所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。

3.实验用品

3.1.材料和标本乳兔、hela细胞（人宫颈癌细胞）

3.2.器材和仪器手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管（灭菌后备用）、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。

2.3试剂含有5％小牛血清的mem培养液、0.01mol／lpbs，0.25％胰蛋白酶一0.02％edta混合消化液、75％乙醇。

4.实验方法

4.1.原代细胞培养

4.1.1.原理

细胞培养（cellculture）是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。

近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。

由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。

原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。

一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：

动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。

4.1.2.操作

①．取材

用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。

然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。

用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。

置于无菌平皿中。

②．切割

用灭菌的pbs液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用pbs清洗，洗到组织块发白为止。

移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

③．消化、接种培养

吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％edta混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的mem培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。

4.1.3.结果

细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。

4.2.传代细胞培养

4.2.1.原理

体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。

培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:

2或l:

3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。

细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。

在一代中，细胞培增3～6次。

细胞传代后，一般经过三个阶段：

游离期、指数增生期和停止期。

常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。

一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。

细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期（对数生长期），适宜进行各种试验。

4.2.2.操作

①．将长成单层的原代培养细胞或hela细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。

（以液面盖住细胞为宜），静置5～10分钟。

②.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即

在超净台中将消化液倒掉，加入3～5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。

③．将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。

4.2.3.结果

一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。

4.3.器材及液体的准备和无菌操作的注意事项

4.3.1.器材和液体的准备

细胞培养用的玻璃器材，如：

培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，120℃，2小时干烤灭菌后备用；

手术器材、瓶塞、配制好的pbs液用灭菌锅15磅，20分钟蒸气灭菌；

mem培养液、小牛血清、消化液用g6滤器负压抽滤后备用。

4.3.2.无菌操作中的注意事项

操作前20～30分钟起动超净台吹风。

操作时，严禁说话，

严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。

培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。

5．实验报告

（1）.原代细胞和传代细胞培养有哪些区别?

（2）.总结一下你自己的经验，怎样才能既迅速，又保证无菌操作。

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