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1.2石斛多糖 1

1.3铁皮石斛的其他化学成分 3

1.3.1氨基酸类 5

1.3.2微量元素 5

1.3.3木脂素类 5

1.3.4酚酸类 5

1.3.5苯丙素类 6

1.3.6芪类其衍生物 6

1.3.7菲类和联苄类化合物 7

1.4石斛的药理作用 7

1.4.1增强机体免疫作用 7

1.4.2抗氧化作用 7

1.4.3抗肿瘤作用 7

1.4.4抗疲劳作用 8

1.4.5降血糖作用 8

1.4.6生津作用 8

1.4.7其他药理作用 8

2实验 8

2.1材料和试剂、仪器 8

2.1.1仪器 8

2.1.2材料及试剂 9

2.2试验方法 9

2.2.1预处理与纯化过程 9

2.2.2样品制备及试剂配制 9

2.2.3测定 9

2.2.4铁皮石斛多糖抗氧化性测定 10

2.2.5多糖提取的正交试验 10

2.2.3计算 11

2.2.5结果与分析 11

3结论 13

4外文翻译 17

1论文综述

石斛是我国传统常用名贵中药材,为兰科(Orchidaceae)石斛属(DendrobiumS.w)多种植物的干燥茎的统称。

在我国已有2000多年的药用历史,早在《神农本草经》、《本草纲目》等著作中就有记载,并列居上品。

著名的有金钗石斛(D.nobileLindl)、铁皮石斛(D.officinaleKimuraetMigo)、霍山石斛(D.huoshanense)[1]等。

目前我国76种石斛属植物中,有近40种被作为药用。

传统中医常将其用于滋阴清热、生津益胃、止咳润肺、清音明目等[2]。

现代药理研究表明石斛具有多种医药功效,可预防和治疗白内障、增强免疫功能、治疗肿瘤、降血糖、抗氧化等,在临床中应用相当广泛。

化学成分分析显示,药用石斛所含的化学成分类型多样,包括生物碱、多糖、菲类、联苄类、黄酮类、倍半萜类、香豆素、甾体及挥发油等[3]。

1.1石斛生物碱

生物碱是石斛药材中最重要的活性成分之一,也是最早分离并进行结构确认的化合物。

1932年,日本人铃木秀干在中药金钗石斛(D.nobile)中首次分离获得一种生物碱,命名为石解碱(Dendrobine)[4]。

1935年,陈克恢等再次在金钗石斛中分离得到石斛碱,并测定金钗石斛中总生物碱的含量为0.52%[5]。

1964年,犬伏康夫等确定石斛碱具有倍半萜骨架结构[6]。

迄今为止,已经从16种石斛属植物分离得到32种生物碱,主要骨架共分为四大类即石斛碱型、八氢中氮茚型、四氢比咯型和咪唑型[7]。

石斛碱型石斛碱是石斛属植物中存在最多的一类重要生物碱,共有19种;

其基本骨架是含有15个C的picrotoxane型倍半萜;

它含有一个五元内酯环,N与picrotoxane倍半萜的2位与11位形成五元杂环,N上通常连有甲基等官能团。

按其骨架结构变化,石斛碱型石斛碱又分为七种骨架类型[7-10]。

1997年,台湾学者Sha等首次通过α-羰基游离基环化反应全合成了纯手性的石斛碱(—)-dendrobine[8]。

2000年,日本学者Morita等从金钗石斛中分离得到一种很少见的五元内酯开环的石斛碱型生物碱—MubironineC(C17H29O3N),其15位与3位的γ内酯断开。

八氢中氮茚(octahydroindolizone)类[7,10-12]石斛碱是一种含有一个氮原子的五元和六元并环体系的生物碱,该类生物碱共有6种。

四氢比咯型[7,13-16]生物碱共有5种,Leete等用放射性标记化合物[1—14C]-醋酸钠和[4,2′—14C]邻琥珀酰基苯甲酸加入报春石斛的生长过程,发现[1—14C]-醋酸钠中的14C主要存于该类石斛碱的第5位C上,提出琥珀酰苯甲酸是其合成前体,Breuer等[16]以邻羧基苯基环丙酮为原料水解得到了一种四氢比咯型生物碱石斛宁(shihunine)。

咪唑型[17,18]生物碱有一个典型的咪唑环结构,该类生物碱有2种,1993年,Hemscheidt等[18]根据标记的3C和15N研究其生物合成途径,推测该类生物碱可由D,L-赖氨酸生物合成。

前期研究报道,铁皮石斛的生物碱含量只有金钗石斛的1/20[1]。

金钗石斛含较多生物碱,其一年生含量最高,为0.5489%,随年份增加,其含量依次减少;

铁皮石斛中几乎不含生物碱,三年生最高也仅含0.0121%[3]。

此外,文献报道野生石斛茎叶中总生物碱的含量仅有0.3%[2],文中发现人工培植的金钗石斛中总生物碱含量高于野生品种,为0.5489%,因此,预测人工培植品将可替代野生品。

铁皮石斛中总生物碱含量较低,诸燕等[19]研究发现,人工栽培的铁皮石斛与市场购买的铁皮枫斗药材总生物碱在0.0190%~0.0430%;

浙江省11个铁皮石斛种质一年生、二年生、三年生样品平均总生物碱为0.0253%、0.0270%、0.0326%,云南产一年生铁皮石斛平均总生物碱为0.0343%。

1.2石斛多糖

石斛多糖是石斛类中药材的主要有效成分,为大分子化合物,是铁皮石斛的主要药效成分。

目前对中药多糖的分析以含量和单糖组成分析为主,特别是后者,在分析仪器的普及、色谱及色谱联用技术的发展等因素的推动下,已经成为2010年版药典铁皮石斛质量标准的检测方法之一。

多糖类成分的化学结构复杂:

一级结构主要反映糖链的糖基组成、各种组成单糖的分子数比例、单糖残基的构型、残基之间的连接次序等内容,单糖残基的排列顺序对多糖的活性有影响;

二级结构反映多糖骨架链的构象;

三级结构反映了单糖残基中各官能团之间非共价作用形成的有序、规则而粗大的空间构象;

四级结构指多聚链间非共价键结合形成的聚集体。

多糖的高级结构与其生物学功能密切相关。

目前铁皮石斛多糖研究以含量测定和一级结构研究为主,在此基础上2010年版《中国药典》制定了专属性更强的铁皮石斛鉴别和含量测定方法;

同时,铁皮石斛多糖的指纹图谱分析、高级结构、构效关系、生物化学等方面的研究还有待继续深入地开展。

相信随着色谱、电泳等现代分离技术的发展,质谱技术在生物大分子质量与结构分析中、色谱-质谱联用技术在化学成分定性、定量分析中的广泛应用,铁皮石斛多糖的活性成分及结构功能通过相关药效学的研究将能够得到明确的界定。

在此基础上,铁皮石斛的质量标准会有质的提高[20]。

多糖其含量多少是评价药材品质的重要指标之一。

王建[21]等人的实验结果显示,广西6个产地的马鞭石斛中多糖的含量差异较大,其中以田阳县的马鞭石斛的多糖含量最高,达11.85%,其他产地的马鞭石斛多糖含量分别为10.93%、10.08%、4.18%、4.39%、5.20%。

因石斛为多年生植物,有效成分的积累与其生长年限、生长环境等都存在着密切的联系。

不同产地的马鞭石斛之间多糖含量差别较大,可能与以上因素有一定的关系。

诸燕等[19]研究浙江人工栽培的铁皮石斛,发现二年生铁皮石斛多糖平均质量分数达34.47%;

不同种质、生理年龄的铁皮石斛多糖质量分数存在显著差异。

李彩霞[20]比较不同采收期铁皮石斛多糖含量,春季(3月)、夏季(6月)、秋季(9月)和冬季(12月)的铁皮石斛多糖含量分别为4.59%、5.37%、5.92%和6.24%,以冬季采收为佳。

尚喜雨[23]对铁皮石斛的组培苗、野生植株、栽培植株中多糖的含量及分布进行系统分析和研究,发现铁皮石斛的多糖含量很高,尤以茎段为最多;

不同部位的含量存在一定差异,茎部的差异大于根和叶;

人工栽培的两年生植株的多糖含量比一年生的多,野生型的比栽培型的多;

杀青后烘干处理可以有效地减少多糖在处理过程中的损失。

在前人研究基础上,近10年从铁皮石斛中分离得到更多的多糖。

杨虹等[24]分离得到两个多糖,即DT2和DT3,分子量分别为7.4×

10.5和5.4×

10.5;

DT2和DT3的结构主要以α-(1→4)-D-Glc缩合而成,末端糖为—1Gal,—1Glc及—1Ara,葡萄糖和半乳糖上含有少量的分支,并含少量的木糖、阿拉伯糖和甘露糖。

Hua等[25]分离得到一个结构为O-乙酰葡萄甘露聚糖类型的多糖,主链由β-(1→4)-甘露型吡喃糖基和β-吡喃葡萄糖基重复构成,支链由(1→3)-甘露糖基、(1→3)-葡萄糖基和少量的阿拉伯呋喃糖基组成,支链连接在主链末端糖基的6位上;

(1→4)-甘露糖基和葡萄糖基的2位被乙酰化;

单糖组成为甘露糖、葡萄糖和阿拉伯糖按40.2∶8.4∶1的摩尔比例组成。

何铁光等[26]从铁皮石斛原球茎分离得到均一组分多糖DCPP3c-1,相对分子质量为72.4,由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成,其分子物质的量之比为1.1204∶1∶1.046∶23.354∶3.828∶1.046,DCPP3c-1中1→6键连接的残基占14.0%,1→2或1→4键连接的残基占40.7%,1→3键连接的残基占45.3%。

铁皮石斛多糖的结构特点见表1.1[27]。

表1.1从铁皮石斛中分离得到的多糖

序号

多糖名称

分子量

单糖组成

参考文献

黑节草多糖Ⅰ

100000

β0甘露糖型吡喃糖、β露糖型吡喃糖、β喃糖、葡萄糖、其他戊糖

[28]

黑节草多糖Ⅱ

500000

黑节草多糖Ⅲ

120000

β2甘露糖型吡喃糖、β露糖型吡喃糖、β喃糖、葡萄糖、其他戊糖

2-O-乙酰葡萄糖甘露聚糖

甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖(40.4∶8.4∶1)

[29]

DT2

740000

葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖(5.9∶1.0∶0.8∶0.5)

[30]

DT3

540000

葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖(7.9∶1.3∶1.0∶0.5∶0.7)

DCPP1a-1

189000

甘露糖、葡萄糖(7.015∶1)

[31]

多糖含量测定的方法有很多。

一类是利用多糖的还原性,如3,5-二硝基水杨酸盐比色法和Somogyi-Nelson法;

另一类是普遍使用的利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物,再与酚类或胺类化合物缩合,生成有特殊颜色的物质这一性质进行测定,如苯酚-硫酸法和蒽酮硫酸法[32]。

苯酚-硫酸法是常用测定多糖含量的方法,可用于甲基化糖、戊糖和多聚糖的测定,方法简单、灵敏度高,试验时基本不受蛋白质存在的影响。

蒽酮-硫酸法几乎可以测定所有的碳水化合物,所以用该法测出的多糖含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。

1.3铁皮石斛的其他化学成分

利用先进的检测技术对中药材或其来源植物的化学成分进行定性和定量分析,并结合多元统计分析的方法实现对中药的基源鉴定[20],陈晓梅等利用此方法对铁皮石斛茎中分离鉴定,其中所含化合物如表1.2所示。

表1.2铁皮石斛茎中分离鉴定的化合物

化合物类别

化合物

成分

芪类

铁皮石斛素A

dendrocandinA

[33]

铁皮石斛素B

dendrocandinB

铁皮石斛素C

dendrocandinC

[34]

铁皮石斛素D

dendrocandinD

铁皮石斛素E

dendrocandinE

铁皮石斛素F

dendrocandinF

[35]

铁皮石斛素G

dendrocandinG

铁皮石斛素H

dendrocandinH

铁皮石斛素I

dendrocandinI

4,4'

-二羟基-3,5-二甲氧基联苄

-dihydroxy-3,5-dimethoxybibenzyl

3,4-二羟基-5,4'

-二甲氧基联苄

3,4-dihydroxy-5,4'

-dimethoxybibenzyl

3'

-羟基-3,4,5'

-三甲氧基联苄

3-O-methylgigantol

-二羟基-3,3'

5-三甲氧基联苄

dendrophenol

3,4'

-二羟基-5-甲氧基联苄

-dihydroxy-5-methoxybibenzyl

[36]

4-二羟基-3,5'

gigantol

二氢白藜芦醇

dihydroresveratrol

dendromonilisideE

denbinobin

2,4,7-三羟基-9,10-二氢菲

2,4,7-trihydroxy-9,10-dihydrophenanthrene

4,5-二羟基-3,3-二甲氧基联苄

4,5-dihydroxy-3,3-dimethoxybibenzyl

[37]

2,3,4,7-四甲氧基菲

2,3,4,7-tetramethoxyphenanthrene

[38]

1,5-二羧基-1,2,3,4-四甲氧基菲

nakaharain

2,5-二羟基-3,4-二甲氧基菲

2,5-dihydroxy-3,4-dimethoxyphenanthrene

2,7-二羧基-3,4,8-三甲氧基菲

Confusarin

2,5-二羧基3,4-二甲氧基菲

nudol

3,5-二羧基-2,4-二甲氧基菲

bulbophyllanthrin

酚类

N-p-香豆酰酪胺

paprazine

[39]

反-N-(4-羟基苯乙基)阿魏酸酰胺

moupinamide

二氢松柏醇二氢对羟基桂皮酸酯

dhydroconiferyldihydro-p-cumarate

二氢阿魏酰酪胺

dihydro-feruloyltyramine

对羟基苯丙酰酪胺

p-hydroxyphenylpropionyltyramine

丁香酸

syringicacid

丁香醛

syringaldehyde

香草酸

vanillicacid

对羟基苯丙酸

p-hydroxy-phenylpropionicacid

[37,39]

对羟基桂皮酸

p-hydroxycinnamicacid

阿魏酸

ferulicacid

对羟基苯甲酸

4-hydroxybenzoicacid

松柏醇

3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propen-1-ol

香草醇

4-hydroxy-3-methoxybenzylalcohol

穆坪马兜铃酰胺

N-trans-feruloyltyramine

顺式阿魏酰对羟基苯乙胺

反式桂皮酰对羟基苯乙胺

木质素类

(+)-丁香脂素-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

(+)-syringaresinol-β-D-glucopyranoside

[40]

IcariolA2-4-O-β-D-glucopyranoside

(+)-lyoniresinol-3a-O-β-D-glucopyranoside

裂异落叶松脂醇

(-)-secoisolariciresinol

左旋丁香脂素

(-)syringaresinol

[37,40]

丁香脂素-4,4-O-双-β-D-葡萄糖苷

syringaresinol-4,4-O-bis-β-D-glucoside

二氢丁香苷

Dihydrosyringin

酚苷类

koaburaside

3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-β-D-芹糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷

khaephuouside

4-羟基-2,6-二甲氧基苯基葡萄糖苷

leonurisideA

2-甲氧基苯基-1-O-β-D-芹糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷

2-methoxyphenyl-1-O-β-D-apiofuromosyl-(1→1-ap-D-glucopyranoside

4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯基葡萄糖苷

金盏花苷Ⅱ

ErigesideⅡ,dictamnosideA

核苷类

腺苷

adenosine

尿苷

uridine

鸟苷

guanosine

内酯类

钩状石斛素

aduncin

洋地黄内酯,金盏菊花素

digiprolactone,calendin

黄酮类

柚皮素,4'

5,7-三羟基二氢黄酮

naringenin

5,5'

7-四羟基二氢黄酮

7-tetrahydroxyflavanone

甾类

胡萝卜苷

daucosterol

β-谷甾醇

β-sitosterol

脂肪酸酯

反式阿魏酸二十八烷基酯

n-octacostylferulate

对羟基反式肉桂酸三十烷基酯

defuscin

对羟基顺式肉桂酸三十烷基酯

n-triacontylcis-p-coumarate

脂肪酸

十六烷酸

hexadecanoicacid

十七烷酸

heptadecanoicacid

脂肪醇

三十一烷醇

hentriacontane

苯丙素苷

(1R)-1-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-1-丙醇-4-O-β-D-葡萄糖苷

(1R)-1-(4-hydroxy-3,5-dimethoxylphenyl)propan-1-ol-4-O-β-D-glucopyranoside

糖类

蔗糖

sucrose

其他

5-羟甲基糠醛

5-hydroxymethyl-furaldehyde

在植物化学研究方面,李燕等[33-35,37,41]从铁皮石斛茎中分离鉴定了27个联苄类化合物。

杨莉等[42]报道,用HPLC分析了31种石斛属植物(不包括铁皮石斛)中的11个酚性成分(包括联苄化合物5个,菲和芴酮化合物各3个),发现联苄化合物在石斛属植物中普遍存在,其中3'

-二甲氧基联苄(gigantol)和4,4'

5-三甲氧基联苄(moscatilin)在检测植物中的分布最广。

陈晓梅等[43]分析了包括铁皮石斛在内的24种石斛属植物62份样品的化学成分,得到了类似的结果,并发现野生铁皮石斛的联苄含量高于人工栽培的,说明人工栽培铁皮石斛中小分子化学成分的积累与野生铁皮石斛的存在差别。

联苄成分在铁皮石斛样品中的含量均较低,3,4-二羟基-4'

5-二甲氧基联苄的平均含量最高,仅为0.05‰;

且目前还没有关于该化合物药理活性研究的报道。

研究联苄成分与铁皮石斛功效的关系,将有助于明确铁皮石斛的药效成分,提高药材的质量控制标准。

根据陈晓梅等[43]的报道,采集自云南省、浙江省和贵州省的12个铁皮石斛样品中均能检测到柚皮素(4,5,7-三羟基黄烷酮,naringenin)和3,4-二羟基-4'

5-二甲氧基联苄。

此外,这两个成分在石斛属植物中也有较广泛的分布:

柚皮素在20种植物的56份样品中存在;

3,4-二羟基-

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