克隆载体与表达载体.docx
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克隆载体与表达载体
根本性质
根本特征〔或成体的构建〕
原理机制
常用的载体
质粒载体
质粒能利用寄主细胞的
〔1〕具有适宜的复制起始位点〔ORI〕
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后,受体
pSC101
DNA复制系统进行自
〔2〕具后适宜的选择性标记基因〔3〕
菌才能生长.不带用抗菌素抗性基因的殳体菌小能
ColE1
主复制；不相容性；可
假设干限制性内切酶的单一位点〔4〕具
在含有抗菌素的培养基〔选择培养基〕中生长.〔抗
pBR322
克
转移性〔基因工程中米
后较小的分十里和较图的拷贝数.
菌系选择原埋〕
pUC18
隆
用非接合性质粒〕
pUC19
载
TA载体
体
噬入噬
其DNA两端的5'末端
〔1〕基因组大小；去除非必需区,建立外
1〕通过裂解过程增殖载体2〕载体与外源DNA的酶
插入式载体
菌菌体
各带有12个碱基的互
源DNA片段的克隆或替换位点〔2〕在
切3〕外源DNA与载体的连接4〕重组噬菌体的体
体
补单链,即cos位点.
DNA的非必需区插入选择标记：
lacZ
外包装5〕包装噬菌体颗粒的感染6〕筛选〔入噬菌体
置换型载体
载
有可替代区,即非必需
基因；基因c1失活〔CI基因：
溶源
载体的克隆原理〕
〔取代型载
体
区.用外源DNA片段
过程限制基因〕；Spi筛选〔野生型入
体〕
替代这个区域,不会影
噬菌体在带后P2原噬菌体的溶源性
响噬菌体颗粒的形成.
E.coli中的生长会受到限制的表型,称
作Spi+,即对P2噬菌体的干扰敏
感〕
M
M13噬菌体的基因组
基因间隔区〔intergenicregion,IG区〕
1、以〔+〕链DNA为摸板,合成互补〔―〕链,
M13mpn
13
为单链DNA.噬菌体
基因II与基因IV之间存在一段507bp
该双链称复制型DNA〔RFDNA〕.2、RFDNA在
n代表系列数
噬菌
颗粒的大小受其DNA
的基因间隔区,内含有复制起始位点,
宿主细胞内能快速增殖,可增加到每个细胞约200
字②对
体载
端点制约的,不存在包
是实施改造、构建人工载体的重点区
个拷贝.3、单链特异的DNA结合蛋白结合在〔+〕
M13mp1的
体
装限制.只感染雄性大
域.②IG区内只有一个BsuI切点.
链上,从而阻断了其互补链,即〔―〕链的合成,
改良加上常
肠杆菌
〔2〕参加酶切位点,在IG区内参加单
这样,细胞就会不断的合成〔+〕链DNA4、游离
用的酶切位
一内切酶位点.M13mpi在IG区内插
出来的〔+〕链DNA先与基因V的编码产物形成
点.
入一个大肠杆菌的LacZ'〔-肽序列〕.
特异的DNA-蛋白质复合物,然后转移到寄主细胞
M13mp2:
使克隆的DNA片段以特定单链的形式
膜,同时基因V的蛋白质从〔+〕DNA链上脱落下
LacZ'5'端
输出受体细胞外,M13重组分子筛选简
便,被M13噬菌体感染的受体细胞生
来,余下的M13〔+〕链DNA那么是从其感染的寄
主细胞的细胞膜溢出的过程中,被外壳蛋白包装成
的第13个核
甘酸G突变
长缓慢,形成混浊斑,易于识别挑选.
病毒颗粒的.〔M13噬菌体产生单双链DNA的
成A,产生了
而且重组分子越大,混浊斑的混浊度亦
机制〕
一个EcoRI
越大但M13-DNA载体的最大缺陷是
切点
装载量小,只有1.5kb
噬
考斯质粒是一类人工构
粘粒〔cosmid〕是带后cos序列的质
设计构建的柯斯质粒一般长4〜6kb.其上的cos
菌
建的含有入-DNAcos序
粒.cos序列是噬菌体DNA中将
位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白.凡
体-
列和质粒复制子的的特
DNA包装到噬菌体颗粒中所需的
具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于
质
黏粒
殊类型载体.能像
DNA序列.黏粒的组成包括质粒复制
噬菌体基因组,就可以向外壳蛋白结合而被包装成
粒
载体
-DNA那样进行体外包
起点〔colE1〕,抗性标记〔ampr〕,cos
类似噬菌体入的颗粒.因此,插入柯斯质粒的外源
杂
装,并高效转染受体细
位点,因而能象质粒一样转化和增殖.
DNA可大于40kb.重组的柯斯质粒可象噬菌体入
合
胞；能像质粒那样在受
克隆的最大DNA片段可达45kb.
一样感染大肠杆菌,并在细菌细胞中复制.
载
体细胞中自主复制具有
有的粘粒载体含有两个cos位点,在
体
较高容量的克隆水平：
45kb;具有与同源性序
列的质粒进行重组的能
力
某种程度上可提升使用效率.
能像质粒那样在受体细
噬菌粒载体综合了质粒载体和M13噬
1.具有较小分子量基因组DNA,可克隆10kb的
pUC118
和
胞中自主复制能像
菌体载体优点,含有ColEl复制起始位
外源DNA片段,并易于进行别离与操作；2.编码
pUC119
M13-DNA那样体外包
点、抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌
一个amp基因作为选择记三,便于转化子的选择；
装,并高效转染受体细
体DNA间隔区〔含有噬菌体DNA复制
3.拷贝数含量高4.存在着一个多克隆位点区,因
噬菌
胞装载量比常规的
起始、终止以及噬菌体颗粒形态发生所
此多种不向类型的外源DNA片段,不经修饰便可
M13mp系列要大很多
必需的全部顺式作用元件〕
直接插入到载体分子上；5.多克隆位点区阻断了大
体
〔10kb通过克隆双链
它具有质粒的复制起点、选择性标记、
肠杆菌lacZ基因的5'-端编码区,可根据IPTG显
DNA能获得同等长度
多克隆位点等,方便DNA的操作,可
色反响试验筛选6.lacZ基因是置于lac启动子的控
的单一单链DNA
在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体
制之下,插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式
重组操作简便,筛选容
的复制起点,在辅助噬菌体的存在下,
表达；7含有质粒的复制起点,可复制形成大量的
易
可进行噬菌体的繁殖,产生单链的子代
噬菌体
双链DNA分子8.带一个M13噬菌体的复制起
点,在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中,可以合成
出单DNA拷贝,并包装成噬菌体颗分泌到培养基
中；9.;在pUC118和pUC119这两个载体中,多
克隆位点区的核甘酸序列取向是彼此相反的,于是
它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA,另一
个那么可转录出负链DNA
人工染色
体
染色体具有复制功能,
利用染色体的复制元件
来驱动外源DNA片段
复制的载体称为人工染
色体载体
其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌体和噬菌体-质粒杂台载体等后很大的拓展,甚至可以跟染色体的大小相媲美.
人工染色体载体拷贝数少,制备困难,
通常采取“穿梭载体〞的策略来解决
含有质粒载体所必备的第一受体〔大肠杆菌〕质粒复
制起始位点,这样的载体在大肠杆菌内可以按质粒
复制形式进行高拷贝复制,含有第二受体〔如酵母〕
端粒〔TEL〕、DNA复制起始位点〔ARS〕和着丝粒
〔CEN〕以及适宜的选择标记.载体在体外与目的
DNA重组后转化到第二受体细胞,根据染色体复制
的形式进行复制和传递.筛选ITT体的克隆一
酵母人工染
色体载体
YAC
细菌人工染
色体载体
BAC
P1噬菌体人
般采用抗生素抗性选择标记；筛选第二受体的克隆
子常用与受体互补的营养缺陷型.
工染色体载
体PAC
质粒载体总结
长度
选择标记
克隆位点
天然质粒,属严紧型、低拷贝型
9.09
四划、素抗性
7个克隆位点：
EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、
pSC101
kb
Tetr
BamHI、SalI、SamI
主要使用EcoRI
天然质粒,属松弛型多拷贝型
6.3kb
大肠杆菌素
EcoRI位于E1内部,插入外源DNA会导致E1
质
（colicin）E1
失活,使受体菌不能合成E1〔ColE1-〕,但仍然
ColEI
粒
和对E1免疫的
表现出对E1免疫型〔ImmE1+〕
载
基因〔immE1〕
体
兀件来源①复制起点orip
4363b
基卜日每系和
24个克隆位点.
MB1系列〔来源于ColEI〕的高拷贝型复制起点②
p
四环素抗性
其中9个会导致Tetr基因失活〔如BamHI、
pBR322
Ampr基因pSP2124质粒的Ampr基因③Tetr基因
Hindm、SalI）;
pSC101的Tetr基因.
3个会导致Ampr基因失活〔ScaI、PvuI、PstI〕.
pUC系歹U
〔i〕来自pBR322质粒的复制起点〔ori〕;〔ii〕氨节青
2.7kb
Ampicillin抗
10个连续的单一限制酶切位点,位于lacZ'基
霉素抗性基因〔ampr〕,但它不再含后原来的核酸内切
性和lacZ的
因的5'端.
限制酶的单识别位点；〔iii〕大肠杆菌3-半乳糖酶基因
〔lacZ〕的启动子及其编码“-肽链的DNA序列,此结
构特称为lacZ'基因；〔iv〕位于lacZ'基因中的靠近5-
端的一段多克隆位点〔MCS〕区段,但它并不破坏该基
因的功能
a肽互补〔蓝
白斑〕相结合.
TA载体
耐热聚合酶可在PCR广物的3'端加上一个非配对
的脱氧腺喋吟核甘〔A〕.根据这一特点研制出线性TA
质粒载体,其5'端各带一个不配对的脱氧胸腺喀
咤〔T〕,用该载体可进行PCR产物的直接克隆.
TA载体构建：
在一般质粒载体的根底上构建.
方法1:
先采用限制性内切核酸酶酶切使质粒载体线性化,再通过Klenow片
段将酶切的线性载体末端补平
方法2：
利用产生平末端的限制性内切核酸酶酶切产生平末端,最后将线性化
钝末端质粒载体加T反响形成.目前有很多公司推出了TA质粒载体.
X噬菌体载体
分类
入噬
菌体
载体
插入式载体
一种只具有一
个可供外源
DNA插入的克
隆位点的派生
载体
入噬菌体载体相对于质粒载体来说,克隆片段较大,所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建.
cl基因插入失沽：
如入gt10、入NM1149等载体,在cl基因上有EcoRI及HindIII的酶切位点.外源基因插入后将导致cI基因的失活.cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化,产生清楚的噬菌斑.相反,产生混浊的噬菌斑.
LacZ基因插入失活：
如charon16A载体,在非必须区段引入lacZ基因,在lacZ基因上有EcoRI位点,插入失活后利用X-gal法筛选〔蓝白筛选〕
置换型载体
〔取代型载
体〕
具有成对的克隆位点,在这两个位点之间的入DNA区段可以被外源
DNA片段所取代.
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的,外源DNA可以取代这一片段
这些载体是用Lac5替换入噬菌体的中间区段,同时将Lac5作为选择标记
使用时用EcoRI水解,去掉中间的片段,再与欲克隆片段在体外进行重组、包装.而后,感染E.coli使之在E.coli
内繁殖,并裂解E.coli,形成空斑.
置换型入噬菌体是使用最广泛的载体.
人工染色
体
类别
元件
优点
酵母人工染色体
载体
YAC
是最常用来克隆
很大DNA片段
（2Mb）的系统.
为构建YAC需要结合四个短序列：
即二个端粒、一个着丝粒和一个ARS元件,并将一适当大小的外源DNA连接成一线性DNA分子,而端粒序列位于正确的末端.
YAC的构建有比在细菌中克隆的一些优点,由于某些真核
细胞的序列,特别是重复序列是难以甚至不可能在细菌中
繁殖的,酵母细胞却具有这样的水平
细菌人工染色体
载体
BAC
是基于大肠杆菌
的F质粒构建
的,高通量低拷
贝的质粒载体
每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标
记,一个来源于大肠杆菌F因子（致育因子）
的严谨型限制的复制子oriS（Shizuyaetal.
1992）,一个易于DNA复制的由ATP驱动
①以大肠杆菌为寄主,转化率高,构建BAC文库比YAC
文库更容易；②BAC载体以环型超螺旋状态存在,从大肠
杆菌中提取质粒较方便,川从酵母中分禺DNA较困难；
③BAC的复制子来源于F因子,可稳定遗传,嵌合及重组
的解旋酶〔〔RepE〕以及三个保证低拷贝质
粒精确分配至子代细胞的基因座〔parA,
parB,和parC〕
现象少；④可以通过菌落原位杂交来筛选目的基因,方便
快捷；⑤BAC载体在克隆位点的两侧具有T7和Sp6聚合酶启动子,可以用于转录获得RNA探针或直接用于插入
片段的末端测序.
表达载体
分类
结构组成及表达元件
特点或优点
备注
质
原核表达载
1启动子、
表达方式后:
启动子类型：
根据作用方式及功能分类①组成
粒
体
2转录终止子〔预防克隆的外源基因表达干
组成型表达,
型启动子
表
扰载体的稳定性〕
诱导型表达.
②组织特异启动子又称器官特异性启动子.
达
3核糖体结合位点
融合型表达,
③诱导型启动子
载
体
分泌型表达.
酵母表达载
体
来自pBR322根本骨架含有该质粒复制起始位点（ori）,lacZ基因、bla或ampr、tetr等基因.含有URA3、HIS3、LEU2、TRPI、LYS2与特定的宿主营养缺陷突变体互补筛选或禾用zeocin、basticidin（杀稻MWS）的抗性基因筛选.启动子有GAP、AOXl、AUGl和GAL1等.
GAP是组成型启动子.其余是诱导型启
动子.酵母表达载体多为穿梭载体：
既可
以在大肠杆菌中繁殖,获得足够的载体
DNA进行体外操作,又可以在酵母中复
制、表达和选择.融合蛋白表达载体：
于
外源基因插入位点的C端或N端插入了
1个6XHis标签,或在5'端插入了--
因子作为分泌信号
由于原核生物和真核生物存在糖基化、酰基化等译后修饰反响机制的差异,真核基因的原核表达难以获得有活性的蛋白.酵母成为真核表达的首选系统.
Ti
质
粒
表
达
一元
载体
一兀载体就是含目的基因的中间表达载体
与改造后的受体（Ti质粒）通过同源重组所
产生的一种复合型载体,也称为共整合载
体.由于］建体的T-DNA区与Vir区紧密
连锁,也称为顺式载体（cis-vector）
Ti质粒是根癌农杆菌中发现的可引发植
物产生冠瘤瘤的质粒.根据冠瘤瘤合成的
冠瘤碱种类,Ti质粒可分为章鱼碱、农杆
碱、农杆菌素和琥珀碱4种不同类型Ti
质粒可分为T-DNA、Vir、Con和Ori4
构建的根本原理：
引入分子质量较小的中间载体,将欲转化的目
的基因及抗性标记基因构建到中间载体上.
将Ti质粒上T-DNA的致瘤基因全部去掉,
仅保存具两边界及与T-DNA转移所必需的
载
体
个功能区.T-DNA区是Ti质粒中能转
移到植物细胞内的区域.Vir区位于
T-DNA区的上游,其表达产物可激活
T-DNA向植物细胞的转移,这一个区域
也称为致病区.
Con区该区含有与农杆菌之间接合转
移后关的基因（tra）,这些基因受佰主细胞
合成的冠痹碱激活,使Ti质粒在细菌之
间转移.
Ori区调控Ti质粒的自我复制,为复制起始区
25个碱基序列,构建成所谓卸甲载体.在卸
甲载体的T-DNA区被删除致瘤基因位点插入
中间载体同源的质粒序列,将中间载体转入含
有卸甲载体的根癌农杆菌中,构建在中间载体
上目的基因可通过向源重组整合到卸甲载体
Ti质粒的T-DNA区,并与卸甲载体Ti质粒
一起复制.
二元
载体
双元表达载体系统主要包括两个局部：
一
局部为卸甲Ti质粒,这类Ti质粒由于缺失了T-DNA区域,完全丧失了致瘤作用,主要是提供Vir基因功能,激活处于反式位置上的T-DNA的转移.另一部份是微型
Ti质粒,它在T-DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及LacZ
双元载体系统的卞^建的原理是Ti质粒上的Vir
基因可以反式激活T-DNA的转移.
与共整合载体所不同的是,它不依赖两个
质粒之间的同源序列,不需要共整合过程就能
在农杆菌’内独立复制
双元表达载体构件方便,转化效率高于一
元载体.
基因等.
病
杆状病是表
杆状病毒表达系统的根本兀件：
①重组蛋白具后完整的生物学功能：
接近
杆状病毒科病毒,杆状病毒颗粒,双链闭合环
毒
达载体
（1）启动子：
多个启动子同时表达多个外源
天然蛋白.②能进行译后的加工修饰：
状DNA病毒,专一性感染无脊椎动物
表
基因.
（2）polyA加尾彳百号：
（3）同源重组
研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方
将外源基因先克隆到转移载体上,再与病毒基
达
序列.（4）穿梭载体必需元件.除带有病毒
面的理想模型.③表达水平高：
最局可使
因组共同转染细胞,通过细胞内的同源重组获
载
自身的复制起始位点外,还带有pUC质粒
目的蛋白的量到达细胞总蛋白的50%.
得带有外源基因的重组病毒的策略.
体
的复制子及以ampr,可以在细菌内进行扩
④能容纳大分子的插入片段：
上限未知.
增.（5）筛选标记.
⑤能同时表达多个基因：
在同一细胞内同
时表达多个基因.⑥能表达基因组DNA:
昆虫杆状病毒表达系统具有剪切的功能.
⑦对重组蛋白进行定位的功能：
如将核蛋
白转送到细胞核上,膜蛋白那么定位在膜
上,分泌蛋白那么可分泌到细胞外等.
腺病母载体
腺病毒DNA末端结构突出特点1）带有
腺病毒载体是目前最为、泛应用的基因
首先构建一个含多克隆位点和筛选标志的转
100bp反向的末端重复序列〔ITR〕,而且在
载体,也是唯一基因约物的载体双链
移质粒,该质粒含有病毒基因组某段早期序
每一条单链的5'-末端还共价地连接着末
DNA的分子大小约为36kb.
歹U;然后将一个含有启动于一外源基因-poly
端结合蛋白,对病毒的复制有重要作用.2〕
口」应附于1.基因治疗2.表达真核基因3.
A的表达盒插入到上述质粒中腺病毒E1、E3
当它从病毒颗粒中别离出来之时,便会自发
研制疫苗
或E4至右侧的ITR区之间,构建成载有外源
地环化起来,此后许多环形分子又聚合成多
基因的穿梭质粒.
聚体
反
泡沫
从5'端开始依次是：
①5'长末端重复序
一类含单链RNA的动物病毒.它的基因
载体的构建：
转
病毒
列〔5'-LTR〕,带有增强子和启动子序列；
组含有2条相同的正链RNA分子,包装
别离原病毒DNA一删去局部序列一组入选择
录
类
②psi序列,又称少序列,是病毒包装所必
成二倍体病毒颗粒.〔1〕在大多数情况下,
性标记基因、目的基因和调控兀件一克隆到含
病
慢病
须的彳百号序列；③gag,编码病毒衣壳蛋白；
反转录病毒的肿瘤基因〔onc〕都能够在正
有大肠杆菌复制起始位点的克隆载体一转化
毒
母失
④pol,编码反转录酶和整合酶〔Int〕；⑤
常的细胞中转录.2〕反转录病毒的寄主
大肠杆菌一获得反转录病毒克隆载体一辅助
载
致癌
env,编码病毒颗粒外层包装蛋白；⑥3'
范围相当广,包括无脊椎动物和脊椎动
细胞系〔包装细胞系〕一扩增
体
病毒
长末端重复序列〔3'-LTR〕,带有polyA加
物.3〕反转录病毒具有强启动子,外源
类
尾信号序列.
基因可得到启效表达.4〕反转小病是不
但感染效率高,而且不招致寄主细胞的死
亡
SV40病毒
型转化载体
根据SV40DNA进入敏感动物细胞的转方向,分为早期转录区和晚期转录区.
早期转录区包括与病毒感染相关的t抗原
基因（smallT-antigen）和T抗原基因
（largeT-antigen）等；含有BamHI等限制
性内切核酸酶识别位点；晚期转录区包括与
病毒壳蛋白合成相关的基因,含有EcoRi
等限制性内切核
酸酶识别位点.
①含有能够被真核细胞识别的有效的启动子.②有许多种动物病毒,在其感染周期中都能够持续地复制,使其基因组拷贝数到达相当高的水平.③有些动物病毒具有限制自己复制的顺式元件和反式作用因子.④有些动物病毒,在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主核基因组上.⑤病毒的外壳蛋白质能够识别细胞接及器.用病毒外壳蛋白质包装重组质粒DNA形成的假病毒颗粒,即构成了一种高效的转化体系
猿猴空泡病毒40（Simianvacuolating
virus40,SV40）基因组是一种环形双链的
DNA,其大小仅有5243bp,很适于基因操
作.导致人体癌变的可能性极低,对人体是安
全的.一些质粒型表达载体带有来自
SV40DNA的个别调控区,位于病毒的早期与
晚期转录单位之间,包括1、DNA复制起始
位点2、早期与晚期mRNA转录的起始位点
3、能激活复制起始位点并可自动调节早期转
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