检验医学专业实验IV 临床生物化学检验部分Word文档下载推荐.docx

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LD催化反应式为：

L-乳酸+NAD+（LD）→丙酮酸+NADH+H+

在反应过程中，乳酸被氧化生成丙酮酸，同时NAD+还原为NADH。

因NADH在340nm处有吸收峰，反应会引起340nm吸光度的增高。

吸光度增加的速率与样本中LD活性呈正比关系。

NADH正向反应的最适pH偏碱性，可使反应平衡偏向产生丙酮酸的方向。

【参考范围】成人血清LD：

109U/L~245U/L

【临床意义】

1.LD活性增高：

目前临床测定LD活性常用于心肌梗塞、肝病和恶性肿瘤的辅助诊断。

2.LD活性降低：

目前没有发现重要的临床意义。

3.LD的特异性差，几乎存在各种组织中，如：

心、肺、肾、肝、骨骼肌以及恶心肿瘤等疾患时均致此酶增高。

1.LD活性测定可用抗凝血浆，肝素的影响不大，而草酸盐抗凝剂、EDTA都是LD的竞争性抑制剂，能抑制LD活性。

2.不同的LD同工酶对温度的敏感性有差异。

组织提取液若放于-20℃过夜，LD4和LD5会丧失全部的活性。

3.严禁使用溶血标本，红细胞、血小板中含有大量的LD。

4.比色应在5~15min内完成，否则吸光值会降低。

【评价】

LD能可逆地催化乳酸（lactate,L）和丙酮酸（pyruvate,P）之间的氧化还原反应。

1.正向反应最适pH是8.8~9.8，能使平衡偏向生成丙酮酸的方向。

其优点是乳酸和NAD+稳定性好。

且NAD+纯品价格较低，过量乳酸对LD活性的抑制较小，反应线性较宽,重复性较好，特异性高。

缺点是需要较高的底物浓度，反应速度较慢。

2.逆向反应的最适pH为7.4~7.8，与生理性pH相同。

其显著的优点是NADH用量少，仅为正向反应的3%，且反应速度比正向快3倍，灵敏度高。

缺点是但丙酮酸与NADH的稳定性较差，过量的丙酮酸对LD活性的抑制作用较大。

二、连续监测法测定血清ALT

【实验原理】

L-丙氨酸+α-酮戊二酸（ALT）→α-丙酮酸+L-谷氨酸

α-丙酮酸+NADH（LD）→乳酸+NAD+

在340nm处连续监测到NADH的消耗量，从而计算出ALT活性浓度。

在双试剂测定中，首先使血清与缺少α-酮戊二酸的底物溶液混合，37℃保温5min，将样品中所含的α-酮酸（如丙酮酸）消耗完，然后加入α-酮戊二酸启动ALT催化的反应，在波长340nm处连续监测吸光度下降速率。

【参考范围】：

成人血清ALT5U/L～40U/L。

1．ALT是肝细胞损伤的诊断指标

①急性肝细胞损伤的灵敏指标。

②慢性活动性肝炎或脂肪肝时，转氨酶轻度增高（100U～200U），或在正常范围，且AST＞ALT。

③肝硬化、肝癌时，ALT有轻度或中度增高，提示可能并发肝细胞坏死，预后严重。

④其它原因引起的肝脏损害，如心功能不全时，肝淤血导致肝小叶中央带细胞的萎缩或坏死，可使ALT、AST明显升高。

⑤某些化学药物如异菸肼、氯丙嗪、苯巴比妥、四氯化碳、砷剂等可不同程度地损害肝细胞，引起ALT的升高。

2．其他疾病或因素亦会引起ALT不同程度的增高。

如骨骼肌损伤、多发性肌炎等亦可引起转氨酶升高。

3．ALT活性降低见于磷酸吡哆醛缺乏症。

1．试剂空白测定值以蒸馏水代替血清，测定ALT活性单位，规定测定值应小于5U/L.

2．血清不宜反复冰冻保存，以免影响酶活性。

3．ALT测定中存在着两个副反应。

4．在AACC（美国临床化学学会）或IFCC（国际临床化学学会）推荐的试剂盒中，含有磷酸吡哆醛（P-5'

-P）。

国家卫生部临床检验中心的推荐方法试剂中不加P-5'

-P。

5．NADH在Tris缓冲液中稳定性较高；

P-5'

-P在Tris缓冲液中能显示有效的激活作用；

磷酸盐缓冲液有延缓与脱辅基酶蛋白的结合作用。

本法由于测定上限在酶促反应的线性范围内，偏差小，准确性好；

测定条件较赖氏法易于控制，CV值比赖氏法小，精确性好；

标本测定中不需要标准对照，测定结果计算方便，操作简便。

但实验条件要求严格，成本高。

液中仅含有HDL。

HDL主要包括HDL2和HDL3。

pH7.5的条件下，适量增加PEG20000的浓度，可使血清中的HDL2与含有apoB的脂蛋白一同沉淀，离心后的上清液中仅含有HDL3。

血清中总胆固醇（TC）包括游离胆固醇（FC）和胆固醇酯（CE）两部分。

胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸（FFA），胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成Δ4-胆甾烯酮和过氧化氢，H2O2在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生成红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC含量成正比。

胆固醇酯+H2O（胆固醇酯酶）→胆固醇+脂肪酸

胆固醇+O2（胆固醇氧化酶）→Δ4-胆甾烯酮+H2O2

H2O2+4-氨基安替比林（过氧化物酶）→醌亚胺+H2O，此步即为Trinder反应

1．HDL是一种抗动脉硬化的脂蛋白，心血管疾病的发病率与血清HDL-C水平呈负相关。

在预测心血管疾病的危险因素中，HDL-C下降比TC和TG升高更有意义。

2．HDL包括HDL1、HDL2和HDL3。

HDL2在各种疾病中变化较大。

研究表明，HDL2-C亚类与心血管疾病的相关程度比HDL-C更密切。

1．沉淀后的上清液应清澈。

2．离心最好用低温离心机，且离心后应立即吸取上清液并在4h内完成胆固醇测定。

3．聚乙二醇的黏度较大，吸取时应用吸水纸擦净吸管外壁并缓慢放入试管中。

4．血清分离后应及时测定，否则应冰冻保存。

5．应空腹至少12h采血并避免溶血。

1．HDL及亚组分的分离：

常用的方法是选择性化学沉淀分离法。

根据沉淀剂的不同又有多种方法，合理选用沉淀剂是保证分离准确的重要环节。

2．HDL-C及其亚组分中胆固醇的测定方法：

常规方法主要有化学沉淀法和均相测定法。

化学沉淀法包括HDL及其亚组分的分离及分离所得HDL及其亚组分中胆固醇含量的测定，其缺点是对温度和pH改变敏感，沉淀离心后放置时间不宜过长。

均相测定法标本用量少，不需沉淀处理，操作简便，便于在自动生化分析仪上进行测定。

免疫透射比浊法测定血清载脂蛋白AⅠ和B100

【实验原理】血清中ApoA或ApoB100与试剂中特异性的抗ApoAⅠ或ApoB100的抗体结合，在适当条件下形成细小颗粒状的、不溶性的抗原抗体复合物并使溶液混浊。

光线通过这一混浊溶液时，光线被吸收，吸收的量与浊度成正比。

浊度高低在一定范围内与血清中ApoAⅠ或ApoB100的含量成正比。

根据免疫比浊法原理，吸光度与浓度之间一般是3次方程曲线关系，应取多点制作校准曲线，以合适的数学模型如Logit-Log拟合成校准曲线。

或以校准液的吸光度值与校准液浓度的对数为坐标作图，制备校准曲线。

所以需要多点定标

【参考范围】

ApoAⅠ：

1.00g/L～1.50g/L。

ApoB100：

0.50g/L～1.10g/L。

ApoAⅠ/ApoB100：

1.0~2.0。

1．血清ApoAⅠ主要存在于HDL中，一般情况下，它可反映HDL的水平，与HDL-C呈明显正相关，其临床意义与HDL-C基本相同。

2．ApoB100主要存在于LDL中，其含量主要代表LDL水平，与LDL-C成显著正相关，其临床意义与LDL-C基本相同。

此外，临床上常将ApoAⅠ/ApoB100﹤1.0作为冠心病的危险指标。

1．标本应是及时分离的空腹血清。

2．抗血清中不含杂抗体，效价不低于1∶16。

3．应注意抗原和抗体的比例。

4．比浊法测定（终点法）中宜选用多点定标，按曲线回归方程计算结果。

5．免疫比浊法的干扰主要来自血清，手工单一试剂法应设标本空白管。

6．应用定值血清作校准物以减少基质效应的影响。

【评价】：

免疫浊度法为临床实验室测定ApoAⅠ和ApoB100的常规方法。

其又分为免疫透射比浊法和免疫散射比浊法。

免疫透射比浊法是目前实验室最常用的方法，该法操作简单，结果准确，可在自动生化分析仪上作批量测定。

但该法对抗体的质量要求高，消耗抗体较多。

琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶

乳酸脱氢酶同工酶的一级结构和等电点不同，在一定的电泳条件下，使其在支持介质上分离。

然后利用酶的催化反应进行显色：

L-乳酸+NAD+（LD，pH8.8~9.8）→丙酮酸+NADH+H+

NADH+H+2PMS→2PMSH+NAD+

2PMSH+INT→2PMS+INTH+H+

【操作步骤】

1、样本制备：

取小鼠一侧肾脏，用0.9%生理盐水洗涤干净，加入1ml生理盐水于匀浆器中末5min。

将匀浆液移入Ep管中2000rpm离心5min（实际上这个时间和转速都不够），取上清作为样品。

2、制备琼脂糖凝胶玻片：

琼脂糖微波炉中加热至沸腾，吸管吸取融化的凝胶液2ml，均匀铺在玻片上。

冷却凝固后，于一端约1~1.5cm处制槽。

用0.5cm滤纸条，吸去琼脂中水分，形成加样槽。

3、加样：

剪长约1cm，宽约0.2~0.3cm的滤纸，浸入样本液中完全湿润，置于加样槽中央。

跑电泳前将滤纸揭去。

4、电泳：

恒压70V跑1h，样本由负极向正极泳动。

5、显色：

用显色液覆盖整个玻片，置于托盘中37°

避光孵育10min。

6、双蒸水漂洗后观察结果，光密度扫描。

健康成年人血清中LD同工酶百分比有下述规律：

LD2＞LD1＞LD3＞LD4＞LD5。

1.LD同工酶电泳分析在临床上常用于急性心肌梗死的诊断，在急性心肌梗死时LD1与LD2活性均升高，但LD1升高更早、更明显，导致LD1/LD2比值增大。

2.溶血性疾病、幼红细胞贫血症、肾坏死、以及假性肥大性肌营养不良、活动性风湿性心肌炎、急性病毒性心肌炎患者血清LD1和LD2的活性也可增高。

3.肝炎、急性肝细胞损伤时LD5增高。

急性肺损伤、白血病、胶原病、心包炎以及病毒感染时LD2和LD3增高。

4.胃癌、结肠癌和胰腺癌患者血清中五种LD同工酶均可升高，但以LD3增高最为显著。

骨骼肌损伤时LD4和LD5增高。

1．严禁溶血。

2．LD4与LD5（尤其是LD5）对热很敏感，因此底物-显色液的温度不能超过50℃，否则易使LD5等变性失活。

3．LD4和LD5对冷不稳定，容易失活，应采用新鲜标本测定。

如果需要，血清应放置于25℃条件下保存，一般可保存2d～3d。

4．PMS对光敏感，故底物显色液需避光保存，否则显色后凝胶板背景颜色较深。

5．因乳酸钠长期放置后可产生酮类物质，对酶促反应造成抑制作用，可用乳酸锂代替上述溶液。

操作简便、重复性好、标本用量少。

明显的溶血会导致假阳性。

临床生化检验方法学评价试验

一、重复性试验

批内重复性试验是指在同一条件下（用同样的方法，同一种试剂和标准品，同一台仪器，在同一实验室由同一人操作，并保持实验期间准确度不变）对同一标本在尽可能短的时间内进行m轮，每轮n次重复测定，以获得批内精密度数据的试验方法。

其结果能反映测定方法的随机误差大小。

本试验将血清标本用GOD-POD法作5轮，每轮4次血糖测定，即可获得20个测定数据。

【计算】

1.检验20次测定数据中的离群值如存在异常值时应剔除。

对小样本测定来讲，可采用Grubbs检验，该方法是最合理的检验方法。

2.按照批内精密度的计算公式计算5轮每轮4次测定值的平均数（X）、标准差（s）和变异系数（CV%）。

首先计算出每轮测定值的均数、标准差（Si）及方差S1、S2、S3、S4，并将数值填入表27-1内，再将5轮Si总和代入公式即可算出批内标准差Sw。

最后计算出变异系数（CV%）

1、血糖的医学决定水平值为2.8mmol/L、6.7mmol/L和8.9mmol/L。

分析物浓度应选择医学决定水平才更具价值。

2.用于评价方法精密度的变异系数应该是剔除离群值后的计算结果。

【评价】批内不精密度的判断限是1/4允许误差范围。

批间不精密度的判断限是1/3允许误差范围。

允许误差范围可以根据CLIA88规定的能力比对试验的TEa确定。

二、回收试验

回收试验是用以发现分析方法比例系统误差的有效评价方法。

即通过测定GOD-POD法测定血糖的回收率，能较确切地判断该分析方法比例系统误差的有无或大小，从而评价方法的准确性。

1.标本加入标准液后，总浓度应在该方法的分析范围内。

最好使被测标本的浓度达到医学决定水平，血糖测定的医学决定水平为2.8mmol/L、6.7mmol/L、8.9mmol/L。

2.纯标准品溶液的加入体积不得超过血清样品的10%，若稀释过大，误差将发生改变。

3.准确加量是本试验最主要的技术关键。

一般检验方法，要求回收率在95~105%之间，最理想的回收率应为100%

三、干扰试验

干扰试验是测定特异性和干扰两者引起的误差。

干扰物浓度一定时，产生的误差是恒定系统误差，误差的实际大小随干扰物的浓度而异。

选用尿酸作GOD-POD法测定血糖的干扰试验，尿酸可疑和GOD反应生成的H2O2发生反应，使部分H2O2不能参与第二步POD的耦联反应，从而降低显色强度，产生负的测定误差。

尿酸对该反应有干扰，但不是尿酸被测定。

干扰试验既用于检测某方法的特异性，也用于检测干扰物质对方法的干扰作用，以评价分析方法的准确性。

1.可疑干扰物浓度加入可疑干扰物的浓度应明显高于通常所见浓度的上限，最好达到病理标本的最高值，尿酸升高的变动范围在0.42mmol/L~0.9mmol/L之间。

2.干扰物对测定的影响与被分析物浓度无关，而与干扰物本身的浓度有关，所以产生的误差是恒定系统误差。

3.其他注意事项与回收试验相同。

偏差Bias<

允许误差（EA）的临界值，表明由于干扰物引起的偏差对临床诊断和治疗不产生不良影响，是可以被接受的。

血2.8mmol/、6.7mmol/和8.9mmol/L时的EA为0.56mmol/L。

四、方法比较试验

用两种方法同时检测一批样本，计算出两种方法间测定结果的差异，用以估计试验方法在检测样本时可能引入的误差。

当选择准确度已知的常规方法作为比较方法时，部分误差来自比较方法，其他部分误差则来自试验方法。

若选择准确度高的参考方法作为比较方法，可把方法间的任何分析误差都归于试验方法。

本实验以HK法测定血糖的参考方法作对比来评价GOD-POD法测定血糖的总系统误差。

1、将实验结果作散点图，图中以x轴代表比较方法的测定值，y轴代表实验方法的测定值，在坐标纸上作图应散布于整个测定范围之内。

通过散点图可以观察到，测定数据的分布趋势，若所有测定值在坐标图中大致呈45°

角的直线分布，提示被实验方法与比较方法的测定结果之间存在密切的相关关系；

若呈明显的曲线分布，则此实验方法被采用的可能性极小。

2、如果x、y之间呈直线关系，可作直线回归的统计处理，计算：

回归方程y=a+bx和相关系数r。

其结果可以显示实验方法的测定结果有无系统误差存在。

截距a反映恒定系统误差的大小；

斜率b反映比例系统误差的大小；

相关系数r反映两种方法相关性的密切程度。

1.选择试验样品：

一般作40~100例，包括常规工作中可能遇到的整个分析范围（其中25%的标本低于参考范围下限，50%标本在参考范围之内，25%标本高于参考范围），选择合适的样品分析范围比增加样品的数目更为重要。

2.试验方法：

一般每个样品用两种方法各测一次，最好每个样品用两种方法各测定两次，在做双份第二次测定时，标本顺序应全部倒过来，最好在4h内完成。

3.对比方法：

对比方法的选择十分重要，一般应选参考方法或决定性方法，这样方法间的任何分析误差都可归于被评价的候选方法。

在评价一个实验方法时，最理想的情况是回归直线呈45°

角通过零点，这时a=0，b（x/y比值）=1.0，表明恒定系统误差和比例系统误差均不存在。

但x和y都会有随机误差，a和b只是估计值，会有所波动，只要偏离程度比较小，该方法就能用于临床检验的常规分析。

根据计算出的回归方程的a、b值，可以计算候选方法系统误差（SE）的大小，并与不同医学决定水平（Xc）的允许误差（EA）作比较，对被评价方法的系统误差的可接受性作出判断。

SE的可接受性判断指标为

血糖测定的Xc=2.8mmol/L、6.7mmol/L、8.9mmol/L时，Barnett提出的EA值为0.56mmol/L。

4.作相关分析在方法比较试验中，相关系数（r）可作为被评价方法可否被接受的一项统计学指标。

对相关系数还应作相关系数的t检验。

相关系数（r）的t检验统计学公式是：

5.方法比较试验的数据属于配对资料，因而可作配对t检验，其统计学公式是：

在计算t值公式中的分子部分是两种方法的偏差值，表明方法间系统误差的大小。

分母是平均偏差标准误，反映方法比较实验中随机误差的大小。

因此t值是方法比较试验中系统误差和随机误差的比值。

临床生化检验试剂盒性能评价实验

一、线性范围试验

线性范围是指系统最终的输出值（浓度或活性）与被分析物的浓度或活性呈比例，并在允许的非线性误差以内的范围。

线性评价是测定被测物质浓度/活性的反应曲线接近直线的程度。

本试验配制不同浓度的葡萄糖标准溶液，用GOD-POD法试剂测定相应其吸光度，以标准浓度为横坐标，测得的吸光度为纵坐标，在坐标纸上作图，即可绘制出一条直线，即剂量反应曲线（dose-responsecurve）。

【计算】：

以葡萄糖浓度值为横坐标，测定的吸光度值为纵坐标，在坐标纸上作图，若所有梯度浓度实验测试点在坐标纸上呈直线趋势，即可建立回归方程y=a+bx。

要求a接近于0，b在0.97~1.03之间。

若满足此条件，则可直接判断该测定方法是否在所要求的线性范围。

若a偏大，b<

0.97或b>

1.03则认为在低浓度或高浓度处的实测值与预期值间存在较大偏差。

可舍去某一组数据，另作回归分析，直到a接近于0，b在0.97~1.03之间，此时变窄的线性范围即为真实的可报告范围。

1.应以葡萄糖浓度的预期值作为横坐标，测定值为纵坐标作图，而不能以葡萄糖浓度的预期值和对应的吸光度值作图。

2.有的测定特别是酶法测定，当酶量相对不足时，用标准液所作的线性范围可以达到指定的上限，但在测定同样高值样品时，结果却明显偏低，这通常是由样品中的介质效应所致。

3.线性评价方法还可参照EP6文件进行。

1.根据浓度与对应测定值作直线回归分析，建立方程y=a+bx；

使a尽量接近0，b在0.97~1.03时的测定范围为该方法的线性范围。

理想的情况是该方法的分析范围的上限应能使95%的临床标本不经稀释均能得到正确的测定结果。

2.试剂盒测定项目的线性范围要求能覆盖该项目常见医学决定水平。

3.若线性范围变窄该方法应废弃。

造成线性范围变窄的主要原因有：

①生产中组分投料不足；

②生产后组分稳定性差；

③运输和贮存不当等。

必要时应寻找原因，以利改进。

二、时间反应曲线实验

（一）终点法时间反应曲线实验

终点法是测定化学反应达到平衡时的产物生成量，这样才能较准确地反映待测物的量。

用略高于参考值上限的标准液或定值血清进行测定，以观察反应达到平衡期的时间以及反应持续和终止的时间，即可分析有关试剂盒的性能指标。

1.若试剂空白的吸光度大于规定标准，表示试剂质量有了变化不能使用，否则会影响测定的精密度和准确度。

2.试剂空白的反应速度时间曲线应平坦，吸光度在整个反应期间无明显波动，否则，说明试剂本身不稳定，会导致测定偏差。

3.反应能否在规定的时间内到达平衡，达到平衡的时间应在临床生化自动分析仪终点法读取测定吸光度的时间之前。

4.反应达到平衡后，吸光度最大并维持不变，这一期间为反应稳定期。

终点法测定应在这一期间读取吸光度，尤其是对显色不稳定的反应，应严格控制比色测定在稳定期内完成。

（二）连续监测法时间反应曲线实验

连续检测法测定的是酶促反应的初速度。

本实验用ALT法试剂盒进行测定，连续观察该反应中的延迟期、线性期和混合期的整个过程，即可分析连续监测法试剂盒的性能指标。

1、2与终点法基本一致；

反应速度上升型的试剂，空白吸光度越低越好。

3、观察试剂的延滞期、线性反应期与设定的实验参数是否符合，不符的需要修正

4、可用定值血清，由酶促反应速度曲线的斜率分析试剂盒的灵敏度。

三、补充

1、试剂盒按组合方式可分为：

单一试剂、双试剂

①单一试剂：

除标准品外只有一个试剂，优点是操作简单。

缺点是稳定性、抗干扰能力差

②双试剂：

除标准品外有两个试剂，优点是抗干扰能力强，可在一定程度上消除内源性物质的干扰；

试剂稳定、均一

2、方法学比较

①平衡法/终点法：

指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小之时，只是反应信号逐渐达到稳定，以达到该平衡点的信号计算待测物浓度的方法。

②速率法/连续监测法：

当底物消耗量较小之时，酶促反应呈一级反应，此时反应速度与待测物浓度成正比；

连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率，求出酶活性浓度。

实验操作技能考核评价

【实验原理】室间质量评价（externalqualityassessment，EQA）是在室内质控的基础上，通过实验室间的比对，观察各实验室结果的准确性、一致性。

具体方