生物化学实验讲义Word格式.docx
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1），现用现配。
杜式试剂：
2%间苯三酚乙醇溶液（2g间苯三酚溶于100ml95%乙醇中）3ml,缓缓加入浓盐酸15ml及蒸馏水9ml。
临用时配制。
[实验内容及步骤]
一、莫式实验
于4支试管中，分别加入1ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1ml水中），然后各加莫式试剂2滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5ml（切勿振摇！
），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。
二、塞式试验
于4支试管中，分别加入0.5ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液，然后各加塞式试剂2.5ml，摇匀，同时置沸水浴内，比较各管颜色及红色出现的先后顺序。
三、杜式试验
于3支试管中加入杜式试剂1ml，再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，混匀。
将试管同时放入沸水浴中，观察颜色的变化，并记录颜色变化的时间。
四、实验现象记录
仔细观察实验中的颜色变化，对于塞式试验和杜式试验还需记录下颜色变化的时间。
实验二糖的还原作用
掌握糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。
费林（Fehling）试剂和本尼迪克（Benedict）试剂均为含Cu2+的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的Cu2O，此法常用作还原糖的定性或定量测定。
实验仪器：
水浴锅
实验器皿：
吸管、试管
实验试剂：
硫酸酮、氢氧化钠、酒石酸钾钠、柠檬酸钠、无水碳酸钠、淀粉、蔗糖、葡萄糖。
1.费林试剂
试剂A：
CuSO4·
5H2O34.5g,溶于蒸馏水并稀释至500ml。
试剂B：
氢氧化钠125g，酒石酸钾钠137g，溶于蒸馏水并稀释至500ml。
临用时将试剂A与试剂B等体积混合。
2.本尼迪试剂：
柠檬酸钠（Na3C6H3O7·
11H2O）及50g无水碳酸钠，溶于400ml蒸馏水中。
另溶解8.5g硫酸铜于50ml热水中。
将硫酸铜溶液缓缓加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤。
此混合液可长期使用。
于3支试管中加入费林试剂A和B各1ml，混匀，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化。
另取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1ml，然后每支试管加本尼迪试剂2ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，和上面结果比较。
费林试剂检测:
取一只试管加入费林试剂1ml再加水4ml煮沸,如有沉淀,证明变性.
实验三氨基酸的纸层析
了解并掌握氨基酸纸层析法的原理和方法。
用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。
纸层析所用的展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
溶剂由下向上移动的，称为上行法；
由上向下的，称下行法。
将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。
由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，形成距原点距离不等的层析点，于是便将这些氨基酸分离开来。
溶质在滤纸上的移动速率用Rf表示：
Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
只要条件不变，Rf是常数，故可根据Rf值作定性依据。
实验器材：
滤纸、烧杯、剪刀、层析缸、微量注射器（10l）、电吹风、
氨基酸混合液
展开剂
显色贮备液：
V0.4mol/L茚三酮-异戊醇:
V甲酸:
V水=20:
1:
5
[实验内容及步骤]
一、标准氨基酸单向上行层析法
1．滤纸准备；
2．点样；
3．展层和显色。
二、混合氨基酸双向上行纸层析
1.准备
3．展层和显色；
4．定性鉴定与定量测量。
三、数据记录和处理
1．计算出每种标准氨基酸的Rf值；
2．混合氨基酸的Rf值；
3．对照标准氨基酸的Rf值，指出氨基酸的名称。
[实验注意事项]
１.
必须选用新华1号滤纸。
２.点样时，样点的直径不能超出0.5mm。
实验四蛋白质的颜色反应
掌握鉴定蛋白质的原理和方法。
蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。
颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白质物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果来决定被测物是否是蛋白质。
颜色反应是一些常用蛋白质定量测定的依据。
双缩脲反应：
将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。
双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故能呈此反应。
黄色反应：
蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。
遇硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为黄色的硝苯衍生物。
茚三酮反应：
蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。
此反应为一切蛋白质及α-氨基酸所共有。
含氨基酸的其他物质亦呈此反应。
鸡蛋白、吸管、滴管、试管、水浴锅、电炉。
卵清蛋白、0.1%茚三酮、尿素、10%NaOH、浓硝酸、1%硫酸铜溶液。
1.双缩脲反应
（1）取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩脲，释出的氨可用红色石蕊试纸试之。
至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。
然后加10%NaOH溶液1ml摇匀，再加2滴1%CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。
（2）另取一支试管，加蛋白质溶液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。
2.黄色反应
于一试管内，加入蛋白质溶液10滴及浓硝酸3-4滴，加热，冷却后再加10%NaOH溶液5滴，观察颜色变化。
3.
茚三酮反应
取1ml蛋白质溶液置于烧杯中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。
1．在双缩脲反应中，硫酸铜不能多加。
2．茚三酮反应需在pH5-7下进行。
实验五蛋白质的沉淀反应
[实验目的及要求]
1.熟悉蛋白质的沉淀反应。
2.进一步掌握蛋白质的相关性质。
多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。
蛋白质盐析作用：
向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。
乙醇沉淀蛋白质：
乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质质点的水化层使其沉淀出来。
试管、吸管、吸滤瓶、布式漏斗。
蛋白质试液、硫酸铵结晶体、饱和硫酸铵溶液、95%乙醇、结晶氯化钠、1%硝酸银、1%硫酸铜溶液、1%醋酸溶液。
一、蛋白质盐析作用
1.取蛋白质溶液5ml，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合静置几分钟，球蛋白即析出。
2.将上述混合液过滤，滤液中加硫酸铵粉末，至不再溶解，析出的即为清蛋白。
再加水稀释，观察是否溶解。
二、乙醇沉淀蛋白质
取蛋白质溶液1ml，加晶体NaCl少许，待溶解后再加入95%乙醇2ml混匀。
观察有无沉淀析出。
三、重金属盐沉淀蛋白质
取试管2支，各加蛋白质2ml，一管内滴加1%硝酸银溶液，另一管内滴加1%CuSO4溶液，至有沉淀生成。
实验六肥皂的制作
1.原理
油脂和氢氧化钠共煮，水解为高级脂肪酸钠和甘油，前者经加工成型后就是肥皂。
2.用品
150及300mL烧杯各一个，玻棒、酒精灯、石棉网，三脚架，猪油（或其他动植物脂或油），NaOH，95%酒精，饱和食盐水。
3.操作
（1）在150mL烧杯里，盛6g猪油和5mL95%的酒精，然后加10mL40%的NaOH溶液。
用玻棒搅拌，使其溶解（必要时可用微火加热）。
（2）把烧杯放在石棉网上（或水浴中），用小火加热，并不断用玻璃捧搅拌。
在加热过程中，倘若酒精和水被蒸发而减少应随时补充，以保持原有体积。
为此可预先配制酒精和水的混合液（1∶1）20mL，以备添加。
（3）加热约20min后，皂化反应基本完全。
若须检验，可用玻棒取出几滴试样放入试管，在试管中加入蒸馏水5～6mL，加热振荡。
静置时，有油脂分出，说明皂化不完全，可滴加碱液继续皂化。
（4）将20mL热的蒸馏水慢慢加到皂化完全的粘稠液中，搅拌使它们互溶。
然后将该粘稠液慢慢倒入盛入150mL热的饱和食盐溶液中，边加边搅拌。
静置后，肥皂便盐析上浮，待肥皂全部析出、凝固后可用玻棒取出，肥皂即制成。
4.说明
（1）油脂不易溶于碱水，加入酒精为的是增加油脂在碱液中的溶解度，加快皂化反应速度。
（2）加热若不用水浴，则须用小火。
（3）皂化反应时，要保持混合液的原有体积，不能让烧杯里的混合液煮干或溅溢到烧杯外面。
注：
皂化反应：
油脂在碱性条件下的水解反应
实验七牛奶中酪蛋白的提取
掌握一种提取酪蛋白及检测牛乳质量的方法。
酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，占乳蛋白的80%-82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。
它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。
它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质可以检测牛乳中是否掺假。
酪蛋白在其等电点（pH4.6）时由于静电荷为零，溶解度很低，利用这一性质，将牛乳调到pH4.6，酪蛋白就可从牛乳中分离出来。
酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被用来从酪蛋白粗制品中将脂类杂质除去。
温度计、布氏漏斗、pH试纸、抽滤瓶、水浴锅、烧杯、量筒、表面皿、天平、离心机。
市售全脂牛奶、无水乙醇、无水乙醚、pH4.7乙酸钠缓冲液0.2mol/L。
1、酪蛋白等电点沉淀
将100mL牛乳放到500mL烧杯中，加热到40℃，加入到同样40℃的乙酸钠缓冲液中，调到pH4.7。
此时有絮状的蛋白质沉淀析出。
将悬浮液冷却至室温，放置分层，3000r/min离心15min，收集沉淀。
2、水洗
将pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍，洗涤粗制品三次，离心10分钟，得到沉淀蛋白。
3、去脂
向粗制品中加入10ml无水乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中，用乙醚-乙醇混合液洗涤沉淀两次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。
将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白纯品。
准确称重后，计算出每100mL牛乳所制备出的酪蛋白质量（g/100mL），并与理论产量（3.5g/100mL）相比较，求出实际获得百分率。
实验八酵母RNA的提取
[实验目的]
掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。
酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2％。
RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到粗RNA制品。
用碱液提取的RNA有不同程度的降解。
[器材与试剂]
干酵母粉（市售）、鲜酵母（市售）、pH试纸、电子天平、抽滤瓶500ml、布氏漏斗φ10cm、吸管、离心机。
0.2％氢氧化钠溶液：
2gNaOH溶于蒸馏水并稀释至1000ml。
乙酸、95％乙醇、无水乙醚、氨水。
10％硫酸溶液：
浓硫酸（比重1.84）10ml，缓缓倾于水中，稀释至100ml。
5％硝酸银溶液：
5gAgNO3溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。
苔黑酚－三氯化铁试剂：
将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mgFeCl3·
6H2O。
[操作步骤]
1.RNA的提取
称取8g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2％NaOH溶液40ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌。
冷却，加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（pH5～6，用石蕊试纸试之），离心10～15分钟（4000r/min）。
取上清液，加入2倍体积的95％乙醇，边加边搅。
加毕，静置，待完全沉淀，过滤。
滤渣先用95％乙醇洗2次（每次约10ml），继而用无水乙醚洗2次（每次10ml），洗涤时可用细玻璃棒小心搅动沉淀。
乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可作鉴定和测定含量用。
2.鉴定
取上述RNA约0.5g，加10％浓硫酸5ml，加热至沸1～2分钟，将RNA水解。
①取水解液0.5ml，加苔黑酚－三氯化铁试剂1ml，加热至沸1min，观察颜色变化。
②水解液2ml，加氨水2ml及5％硝酸银溶液1ml，观察是否产生絮状的嘌呤银化合物。
实验九DNA的提取及含量测定
1.学习和掌握用浓盐法从动物肝脏中提取DNA的原理和方法。
2.学习和掌握用二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。
1．DAN的提取
核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于核仁及细胞质中。
动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液，但在0.14mol/l的盐溶液中溶解度很低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/l盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。
2．DAN的含量测定
DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（λmax=595nm）。
在DNA浓度为20-200μg/ml的范围内，吸光度与DNA浓度成正比，可用比色法测定。
猪肝、722型分光光度计、匀浆器、离心机、恒温水浴锅。
0.1mol/lNaCL-0.05mol/l柠檬酸钠溶液、0.015mol/LNaCL-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液、95%乙醇、NaCl固体、5%SDS、氯仿、DNA标准液、二苯胺试剂。
一、动物肝脏中DNA的提取
1．取猪肝8g，用匀浆器磨碎，加入相当2倍肝重的0.1mol/LNaCL-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，研磨三次，然后倒出匀浆物，匀浆物在4000r/min下离心10min；
沉淀中再加入25ml缓冲液，于4000r/min离心20min；
取沉淀。
2．在上述沉淀中加入40ml0.1mol/LNaCL-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液、20mlCHCl3-异戊醇混合液、4mL5%SDS使其浓度为0.41%，振摇30min，然后缓慢加固体NaCl，使其终浓度为1mol/L。
将上述混合液在3500r/min离心20min，取上清水相。
3．在上述水相溶液中加入等体积冷95%乙醇，边加边用玻璃棒慢慢搅动，将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇，即得DNA粗制品。
用蒸馏水溶解并定溶至50ml，用二苯胺法测定DNA含量。
二、DNA的定量测定（二苯胺法）
1．标准曲线的绘制
按下表加入各种试剂，混匀，于60℃恒温水浴中保温45min，冷却后，在595nm波长下，于722型分光光度计上比色测定，以吸光度对DNA浓度作图，绘制标准曲线。
1
2
3
4
标准DNA溶液/ml
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸馏水/ml
二苯胺试剂/ml
4.0
A595nm
2．样品的测定
吸取样品1.0mL，加入蒸馏水1.0ml，混匀。
然后准确加入二苯胺试剂4.0ml，混匀，于60℃恒温水浴保温45min，冷却后，选595nm波长，于722型分光光度计上比色测定，根据测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。
3．计算100g猪肝中DNA含量
ω=m1/m2
式中ω：
DNA的质量分数；
m1：
样液中测得的DNA的质量；
m2：
样液中所含样品质量。
三、实验现象及数据处理
仔细观察所得到的DNA，记录其形状、颜色。
在含量的测定时，绘制出标准曲线，查出其浓度，并换算成质量，然后代入公式中计算出DNA的含量。
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