毕业论文拟南芥突变体的鉴定 精品Word格式.docx
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而且早先对组蛋白上的甲基的修饰半衰期的研究认为甲基的半衰期与组蛋白的半衰期相近。
因此很久以来组蛋白的甲基化被认为是不可逆的（10）。
最近的研究发现。
单甲基化的精氨酸可以被PADI4/PAD4脱去氨甲基从而形成瓜氨酸，这是最早的报道能脱去甲基化的组蛋白上的甲基的酶。
然而PADI4/PAD4不能对双甲基化的精氨酸起作用，而且脱去甲基的产物并不是原来的精氨酸而成了瓜氨酸，所以该酶仍然不是真正的去甲基化酶（11，12）。
LSD1的发现打开了对组蛋白去甲基化研究的大门。
LSD1可以通过氧化反映去处组蛋白H3第4位和第9位单或双甲基化的赖氨酸上的甲基（13，14）。
然而LSD1只是很小的一个基因家族，与已知的甲基转移酶的数量相比是很少的。
同时YiZhang实验室通过生物化学手段跟踪去甲基化酶的活性发现了含有JMJC结构域的组蛋白去甲基化酶，并且证明是JMJC结构域是去甲基化的催化中心，随后对JMJC结构域的晶体结构的研究使人们确信了这一点（15，16）。
随后对哺乳动物和酵母中包含JMJC结构域的蛋白的研究又鉴定了一大批的组蛋白去甲基化酶。
这些发现使得我们对于组蛋白上甲基的动态平衡有了更深刻的理解（16）。
1.4拟南芥中组蛋白去甲基化酶
然而在植物中对组蛋白的去甲基化酶仍然没有任何认识。
更不知道组蛋白去甲基化酶在植物的生长发育和对环境的响应中起什么样的作用。
在拟南芥中，我们通过基因组的注释以及序列比对发现了21个基因编码含有JMJC结构域的蛋白。
在这21个基因中有两个基因REF6和ELF6有报道表明参与到植物开花时间的决定中。
虽然这两个基因从编码的蛋白质序列上来说非常接近。
然而遗传学的分析表明这两个基因参与了不同的开花时间决定的通路中（17）。
不过没有报道证明REF6和ELF6具有组蛋白去甲基化酶的活性。
对于其他19个包含有JMJC结构域的功能仍然是一无所知。
我们期望通过对编码包含JMJC结构域蛋白的基因的突变体的研究来阐述组蛋白去甲基化对维持甲基化的动态平衡以及在植物生长发育中所起的作用。
2材料和方法
2.1实验材料
来自SALK库的拟南芥AtPRMTsT-DNA插入突变杂合子种子。
包括：
SALK_021260（A1）、SALK-021253（A2）、SALK-014109（B1）、SALK-048786（B2）、SALK-037361（B3）、SALK-037362（B4）、SALK-043417（B5）、SALK-043403（B6）、SALK-048777（B7）、SALK-089978（B8）、SALK-089985（B9）、SALK-019427（C1）、SALK-068986（C2）、SALK-024168（C3）、SALK-014455（D1）、SALK-135712（D2）SALK-136058（D3）、、SALK-122006（E1）、SALK-001018（E2）、SALK-074694（E3）、SALK-024613（F1）、SALK-024612（F2）、SALK-109924（L1）、SALK-071534（G1）、SALK-029755（G2）、SALK-120904（G3）、SALK-103092（H1）、SALK-020986（H2）、SALK-092672（H3）、SALK-027723（H4）、SALK-056556（H5）、SALK-044594（H6）、SALK-061686（I1）、SALK-036420（I2）、SALK-000651（J1）、SALK-004652（K1）、SALK-049065（K2）、SALK-023533（K3）、SALK-006042（K4）、SALK-035608（K5）、SALK-049697（M1）、SALK-052790（M2）、SALK-073422（N1）、SALK-025269（P1）、SALK-041728（P2）、SALK-041737（P3）、SALK-029530（Q1）、SALK-093345（Q2）、SALK-003313（X2-3）
注：
（括号）内为实验室内种子编号。
为方便说明，以下主要以括号内编号为主。
2.2主要药品试剂
2.2.1常用试剂与药品
氯仿、异丙醇、无水乙醇、国产分析纯
琼脂糖，上海YITO公司。
2.2.2试剂配制
2.2.2.1ArabidopsisThaliana营养液
大量元素25X3L单位：
g
NaH2PO4·
2H2O
12.72
KNO3
225
（NH4）2SO4
10.05
MgSO4·
7H2O
37.5
CaCl2
8.496
铁盐200X1L单位：
g
Na2-EDTA
7.46
FeSO4·
5.56
微量1000X1L单位：
mg
NaMoO4·
250
CuSO4·
5H2O
25
CoCl2·
6H2O
KI
750
H3BO3
3,000
MnSO4·
H2O
10,000
ZnSO4·
2,000
2.2.2.2CTAB溶液配方：
2xCTAB
200ml
2L
2%CTAB
4.0g
40g
100mMTris（pH8.0）
20ml*1MEDTA
200ml*1MEDTA
20mMEDTA
16ul*0.25molEDTA
80ul*0.5molEDTA
1.4MNaCl
16.4g
164g
2%PVP40
使用前加入2%的β-巯基乙醇，20ul/10ml。
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中，CTAB可与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但不能沉淀核酸。
因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体中制备纯化DNA.
2.2.2.3PCR10xbuffer配方：
a.500mmol/LKCl,b.100mmol/LTris-Cl（pH8.3），c.15mmol/LMgCl2
在1.05KG/CM2高压下蒸汽灭菌10min。
分装后贮存在-20。
C。
2.2.2.4电泳缓冲液50xTAE储存液/L配方：
a.242gTris碱，b.57.1ml冰醋酸，c.100ml0.5mol，d.LEDTA（pH8.0），e.ddH2O，
用时稀释50倍用
2.2.2.5溴化乙锭贮存液：
在100ml水中加入1g溴化乙锭，溶解后于4℃棕色瓶内保存。
2.2.2.66×
凝胶加样缓冲液：
0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃保存。
2.2.2.710mMdNTP,从-80度冷柜中取出10mMdGTP,dCTP,dATP&
dTTP,各10ul加入60ulddH2O混匀，配得100ul10mMdNTP,，保存于-20度，减少反复冻融。
2.3主要仪器设备
电泳仪：
DYY－6C电泳仪，DYY－7B电泳仪,北京六一仪器厂
超净工作台：
北京昌平长城空气净化工程公司制造
-80℃超低温冰箱：
Hetoultrafreeze
制冰机：
日本SANYO公司
超纯水仪：
ELGA
高速冷冻离心机：
EppendorfCentrifuge5417R
凝胶成像系统：
KODAK,EDAS290,Transilluminnator2020D,Coldspring.
高压灭菌锅：
江明滨江医疗设备厂，手提式压力蒸汽消毒器，YX-280型
37℃恒温水浴仪：
北京通达科技有限公司
PCR仪：
Eppendorf
2.4实验方法及原理
2.4.1植物材料准备
2.4.1.1配制营养液，160ml大量元素+20ml铁盐+4ml微量元素+水=12升营养液
2.4.1.2往小盆里倒入蛭石，营养液浸润使其湿润，轻压实。
2.4.1.3将种子倒于EP管中，用移液器逐粒种于土中，每碗5颗
2.4.2总DNA提取方法（CTAB法）
2.4.2.1取2-3片叶片置于含液氮的研钵中，用研棒研磨。
研磨的过程中加入适当的液氮保持低温。
2.4.2.2加入700ul的CTAB溶液（0.2%BME）,融化后转入EP管中。
2.4.2.365。
C煮0.5小时（使核蛋白复合物完全解体）
2.4.2.4离心5-10min,13000rpm
2.4.2.5取上清加入等体积氯仿，颠倒混匀2-3min（去蛋白等杂质）
2.4.2.6离心5min,12000rpm
2.4.2.7转移上层无色水相加入等体积异丙醇，颠倒混匀2-3min，—20。
C沉淀30min
2.4.2.8弃上清，75%乙醇洗涤沉淀一遍
2.4.2.9充分干燥后，加100ul的纯水溶解沉淀，-20℃保存。
2.4.3PCR筛选
2.4.3.1PCR技术的基本原理
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①变性：
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②退火（复性）：
模板DNA经加热变性成单链后，温度降低，由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③延伸：
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。
互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR反应受到很多因素的影响，如PH值、各种盐离子的浓度等，在这些影响因素都是最适条件的情况下，即使模板和引物的条件稍差，也可扩增出近乎完美的产物。
在做PCR实验之前，最好先对实验做优化设计，然后再对每一个影响因素一一进行实验分析，以确定每一个因素对实验结果是如何影响的。
一般情况下，优化实验要做各个因子的正交组合，通过这样的大量的组合试验，来确定一个相对来说最优的实验条件，只有这样，试验结果才有很大程度的重复性。
2.4.3.2PCR反应体系和流程图
20ul体系
3primers
2primers
10Xbuffer
2ul
10umdNTP
0.4ul
14.2ul
14.6ul
E.TAQ
1ul
Primer1
Primer2
Primer3
无
模板DNA
1.2ul
表2-2PCR反应体系图2-2PCR反应流程图
2.4.4PCR产物的检测
PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。
PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。
PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预计的大小。
2.4.5T-DNA单拷贝插入突变体
T-DNA单拷贝插入突变体筛选示意图：
A
图2-1T-DNA单拷贝突变体筛选示意图
A,B,C分别表示了野生型基因组，T-DNA单拷贝插入杂合子和T-DNA单拷贝插入纯合子的情况。
绿色部分表示可以被插入的GENE，蓝色部分表示插入的T-DNA，A，B代表基因组上与引物结合的位点，I代表T-DNA上与引物结合的位点，为了解释的方便，我们用a,b,i用来代表与A，B，I位点结合的引物。
每组两条带表示同源染色体上的一对等位基因。
A图表示野生型基因组，无T-DNA插入。
当反应体系中同时加入三种引物a,b,i时,引物a,b与基因组上A，B位点结合，扩出1KB左右的特异性片段。
当反应体系中加入两两组合的引物时，只有同时含有a,b引物的体系才能扩出野生型片断。
B图表示T-DNA单拷贝插入杂合子，一条同源染色体上GENE无T-DNA插入，可在同时含有a,b引物的体系中扩出900BP左右的片段;
另一条同源染色体上GENE有T-DNA插入，此时A，B间距相对延长，超过1KB，而根据反应流程，72度延伸一分钟只能扩出1KB以下的片段，这时，即使A，B位点结合引物，但由于二者距离过远，没有办法扩出插有T-DNA的GENE全长。
同时，I位点结合引物i,与A或B位点搭配，可扩出相对较小的片段。
因此，在含有三种引物的反应体系中，杂合子的一对等位基因可扩出大小两个片段；
而在含有两两组合的引物的不同反应体系中，杂合子将在含a,b引物的体系中扩出和野生型大小相同的片断，在含有a,i或b,i引物的体系中扩出一条小于野生型的片断。
C图表示T-DNA单拷贝插入纯合子。
与杂合子同理。
在含有三种引物的反应体系中，杂合子的一对等位基因可扩出一条小于野生型的片断；
而在含有两两组合的引物的不同反应体系中，只在含有a,i或b,i引物的体系中扩出一条小于野生型的片断。
因此，当反应体系中同时加入三种引物时，我们根据扩出片断大小可以反映有无T-DNA插入。
而当反应体系中加入两两组合的引物时，我们根据扩出片段的引物组合可以反映T-DNA插入的方向和基因组的类型（杂合或纯合）。
1，D图是通过含有三种引物的反应体系PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定植株类型的示意图，
3结果与讨论
我们从SALK突变体库中拿到了所有21个基因的37个T-DNA插入突变，即T-DNA插入到基因的中间的株系。
利用分子标记，寻找纯合的T-DNA插入株系。
然后通过分子生物学的手段检测T-DNA的插入是否破坏了基因的正常表达。
基因名称
T-DNA插入突变体
编号
引物（LPRP）
At1g09060
SALK-021260
A1
Cx1816/cx1817
SALK-021253
A2
CX1816/Cx1817
At1g63490
SALK-014109
B1
Cx1818/cx1819
SALK-048786
B2
Cx1820/cx1821
SALK-037361
B3
Cx1820/Cx1821
SALK-037362
B4
SALK-043417
B5
Cx1824/cx1825
SALK-043403
B6
Cx1825/Cx1826
SALK-048777
B7
SALK-089978
B8
Cx2301/Cx2302
SALK-089985
B9
At4g21430
SALK-019427
C1
Cx1827/cx1828
SALK-068986
C2
Cx1829/Cx1830
SALK-024168
C3
Cx1829/cx1830
At4g20400
SALK-014455
D1
Cx1831/Cx1832
SALK-135712
D2
Cx1833/cx1834
SALK-136058
D3
Cx2303/Cx2304
At3g48430
SALK-122006
E1
Cx1835/cx1836
SALK-001018
E2
Cx1837/Cx1838
SALK-074694
E3
Cx1803/cx1839
SAIL-747-A07CS876460
E4
Cx2305/Cx2306
At5g63080
SALK-024613
F1
Cx1840/Cx1841
SALK-024612
F2
Cx1840/cx1841
SALK-109924
L1
At5g19840
SALK-071534
G1
Cx1846/Cx1847
SALK-029755
G2
Cx1846/Cx1848
SALK-120904
G3
Cx1846/Cx1848
At4g00990
SALK-103092
H1
Cx1849/Cx1850
SALK-020986
H2
Cx1851/Cx1852
SALK-092672
H3
SALK-027724
H4
Cx1853/Cx1854
SALK-056556
H5
Cx1855/Cx1856
SALK-044594
H6
At1g119501
SALK-061686
I1
Cx1857/Cx1858
SALK-036420
I2
Cx1859/Cx1860
At1g78280
SALK-000651
J1
Cx1861/Cx1862
At3g07610
SALK-004652
K1
Cx1863/Cx1864
SALK-049065
K2
Cx1865/Cx1866
SALK-023533
K3
Cx1867/Cx1868
SALK-006042
K4
Cx1867/Cx1868
SALK-035608
K5
Cx1869/Cx1870
At1g62310
SALK-049697
M1
Cx1871/Cx1872
SALK-052790
M2
Cx1872/Cx1873
At1g30810
SALK-073422
N1
Cx1874/Cx1875
At2g38950
SALK-025269
P1
Cx1876/Cx1877
SALK-041728
P2
Cx1878/Cx1879
SALK-041737
P3
WiscDsLox376H12CS853364
P4
Cx2313/Cx2314
At1g08620
SALK-029530
Q1
Cx1880/Cx1881
SALK-093345
Q2
At3g20810
SAIL-811-H12
R1
Cx1882/Cx1883
At2g34880
GABI-257F10
S1
Cx1884/Cx1885
SAIL-563-F10CS874918
S2
Cx2311/Cx2312
At5g06550
SAIL-680-G02CS829824
T1
Cx2299/Cx2300
At5g04240
SAIL-371-D08CS873586
U2
Cx2309/Cx2310
At3g45880
SALK-003312
X1
Cx1949/Cx1950
SALK-003313
X2
Cx1949/Cx1950
表1来自SALK库的拟南芥AtPRMTsT-DNA插入突变体
所用引物
结合位点所在的位置
序列
CX0101
LBb1
GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT
CX0102
LBa1
TGGTTCACGTAGTG
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