细胞复习题.docx
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细胞复习题
第一部分
一．绪论
（一）1.细胞工程：
是按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行的实验操作，获得重构的细胞、组织、器官以及个体，创造优良品种和产品的综合性生物工程。
2.细胞工程按照生物类型可以分为动物细胞工程、植物细胞工程、和微生物细胞工程，按试验操作对象可以分为细胞与组织培养、细胞融合、细胞核移植、染色体操作、转基因生物等。
（二）细胞工程发展历史一些重要事件。
二．实验室设置及一般技术
（一）基本要求
1、动物细胞工程实验室：
无菌操作、培养、制备、清洗、消毒灭菌和储藏
2、植物细胞工程实验室：
光照条件、试管苗室温移植驯化室等
（二）一般组成：
基本实验室和辅助实验室
基本实验室：
准备实验室：
要求宽敞明亮，通风条件好
接种室：
要求封闭性好、干燥清洁，保持无菌环境，防止空气流
培养室：
要求控制光照和温度，保持干燥和清洁
辅助实验室：
细胞生物学实验室、理化分析实验室。
（三）常用设备：
基本设备、灭菌设备、无菌操作设备、光照培养室设备、生化检测设备、细胞学鉴定设备
主要包括1．无菌室、实验室、超净工作台
2．CO2培养箱、恒温箱、旋转培养架
3．倒置显微镜、普通显微镜、实体显微镜
4．离心机、高速及超速低温离心机
5．普通冰箱、低温冰箱、液氮罐
6．药品、器械柜
（四）细胞工程常用仪器的清洗及使用规则
1.玻璃器皿的清洗：
水、5%盐酸、重铬酸钾洗液浸泡等
2.塑料制品的清洗：
2%NaOH、5%盐酸
（五）细胞工程概述
1.基本概念
（1）动物细胞培：
将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。
（2）组织培养：
将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称为组织培养。
（3）器官培养：
是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原有结构和功能的培养技术。
（4）原代培养期:
也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周
（5）传代:
体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。
当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。
初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系
（6）一代：
指从细胞接种到分离再培养的一段时间。
（7）原代培养：
也叫初代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的首次培养物。
（8）细胞系：
由原代培养经初步纯化，获得的以一种细胞为主的能在体外长期生存的不均一的细胞群体。
即称之为细胞系。
（9）细胞株：
细胞系经过进一步的克隆化，得到的由一种细胞组成的细株。
（10）有限细胞系：
即使培养条件均能满足细胞增殖生长，它们也只能在有限的时间内生存，经过运动世代后细胞将逐渐死亡。
：
（11）无限细胞系：
细胞遗传性状发生改变（或永生性或恶化改变）时，细胞可以无限制的传代和生长。
2.体外细胞培养生长和增殖过程与特点
（1）单个细胞的生长
分为G1期、S期、G2期、M期
（2）细胞系的生长
分为：
原代培养期特点：
细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。
与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。
是药物测试很好的对象。
传代培养期特点：
在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型
衰退期特点：
此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。
（3）“一代”细胞的生长
分为：
潜伏期特点：
胞质收缩，细胞圆形。
然后细胞开始贴壁、运动、代谢恢复其原来形态。
无增殖发生
指数增生期特点：
细胞增殖旺盛，不断生长繁殖，细胞数量增加，活力最佳，一般持续3-5d，适于实验。
停滞期特点：
细胞停止增殖，贴满支持物表面，活力减弱。
细胞仍可存活一段时间。
此时应及时传代，否则细胞中毒死亡。
3.动物细胞培养常用的培养基以及溶液、方法。
（1）天然培养基
①血清：
常用胎牛血清（FBS）、小牛血清（CS）。
一般浓度10％
②鸡血浆：
含纤维蛋白原和一些营养成分
③水解乳蛋白（LH）
④鼠尾胶原
（2）合成培养基
MEM培养液（MinimumEarleMedium）、109培养液、NCTC培养液、DMEM培养液（Dulbecco改良设计）RPMI－1640培养液、199培养液、F12培养液
（3）无血清培养基
①基础营养液大多使用F12、DMEM培养液、RPMI－1640培养液、199培养液等
②附加成分（补充成分）
如为促贴壁成分、胰岛素、转铁蛋白。
胰高血糖、其他生长因子、蛋白酶抑制物等
（4）动物细胞培养必需的溶液
①平衡盐水（BBS）常用有Hanks液、Earle液。
②培养基pH调整液常用3.7%、5.6%、7.4%NaHCO3溶液、HEPES液（二羟乙基派嗪乙烷磺酸）
③细胞消化液：
常用胰蛋白酶溶液，乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液
④抗生素溶液
（5）动物细胞培养的方法
①培养瓶培养方法：
指将培养对象直接接种于培养瓶内培养。
②培养板培养法：
又称微量培养法，一般是一次性使用。
③悬滴培养法：
又称植块悬滴培养法，即将组织或器官植块接种在一张盖玻片上滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂于盖玻片下，再置于一凹形载玻片上，最后用熔蜡密封后放于培养箱中培养。
④旋转管培养法：
是培养中组织块或细胞交替地与培养液和空气直接接触。
包括旋转管、旋转鼓、支架等
⑤灌注小室培养法：
在盖玻片悬滴法基础上发展而来，可用于连续观察细胞动态变化，研究各种因素影响作用及活细胞反应
4．动物细胞大规模培养有哪些方法以及特点
1.悬浮培养技术
2．微载体培养技术
3．多孔载体培养
4．微囊化培养技术
5．中空纤维法
（四）细胞融合与单克隆抗体
4.1基本概念
细胞融合：
又称体细胞杂交（somatichybridiazation），是指将不同来源的原生质体相融合并使之分化再生,形成新物种或新品种的技术
单克隆抗体：
单一抗原表位特异性B细胞克隆经融合、筛选，和克隆化而获得单克隆杂交瘤细胞，其所产生的同源抗体称为单克隆抗体。
多克隆抗体：
由于天然抗原常含有多种不同抗原表位，导致体内多个B细胞克隆被激活并产生针对多种不同抗原表位的抗体，同时抗血清也多未经免疫纯化，故所获抗血清是含多种抗体的混合物，即多克隆抗体。
4.2单克隆抗体的制备原理
单一抗原表位特异性B细胞与骨髓瘤细胞经融合、筛选，获得单克隆杂交瘤细胞，将所得杂交瘤细胞经培养产生同源抗体
4.3HAT培养基如何实现对杂交瘤细胞的选择
HTA培养基是根据细胞由次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸合成DNA途径而设计的。
正常细胞合成DNA有主要途径和补救途径。
在主要途径中，叶酸及其衍生物是必不可少的媒介，参与嘌呤环和嘧啶甲基的合成，氨基喋呤抑制二氢叶酸还原酶活性，从而阻断正常细胞中DNA合成主要途径中二氢叶酸到四氢叶酸合成，因此只有利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷酸等前体的野生型细胞才能从补救途径合成DNA而不会死亡。
利用HGPRT—和TK—两种类型的细胞进行杂交，在一般培养条件下，细胞可利用主要途径合成DNA，这些突变细胞能正常生长。
当主要途径被氨基喋呤阻断时，这两株细胞不能增值。
如将两类细胞融合，则只有异核体杂交瘤细胞能在HAT培养基上存活，因为两种细胞相互补充了另一种细胞缺失的酶；而没有融合的细胞或自身融合的同核体细胞仍然是HGPRT—和TK—
（五）胚胎工程
5.1基本概念
胚胎工程：
是以生殖细胞和胚胎细胞为对象进行的细胞工程操作，主要包括体外受精、胚胎移植、胚胎切割等。
胚胎分割:
指通过对胚胎的显微外科操作，把一个胚胎分割成两个或多个，由于胚胎发育早期，每个卵裂球都具有发育成一个完整个体的潜在可能性，因此通过胚胎分割技术，可以人工制造同卵双胎或多胎，可成倍地增加胚胎数和产犊数。
胚胎移植：
也称受精卵移植，是指一头母畜发情排卵并经过配种后，在一定时间内从其生殖道取出受精卵或胚胎，然后把它们移植到另外一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜的输卵管或子宫角。
这个来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继续生长和发育，最后产下供体的后代
超数排卵：
是指在母畜发情周期的适当时间用人工的方法促使其有更多的卵泡发育,成熟,排卵的一项技术
（六）干细胞研究及组织工程
6.1干细胞分为哪些类型，各有何重要生理功能。
根据干细胞组织发生的名称进行分类:
胎胎干细胞、造血干细胞、骨髓间质干细胞、肌肉干细胞、成骨干细胞、内胚层干细胞、视网膜干细胞、胰腺干细胞
按照分化潜能：
全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞
按照发育状态：
胚胎干细胞、成体干细胞
全能干细胞：
具有形成完整个体的分化潜能
多能干细胞;具有分化出多种细胞组织的潜能
单能干细胞：
只能向一种或两种密切相关的细胞类型分化
胚胎干细胞：
ES（embryonicstemcell）胚胎干细胞，是一种高度未分化细胞。
从附置前早期胚胎内细胞团分离而得到，它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。
（七）核移植技术与动物克隆
1）基本概念
核移植技术：
所谓核移植技术就是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术
动物克隆：
不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。
2）克隆羊“多莉”诞生的重要生物学意义
第一，它证明了一个已经完全分化了的动物体细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息，并且经此技术处理后，体细胞恢复了失去的全能性形成完整个体。
第二，多利是世界上首例利用成年哺乳动物体细胞作为供体细胞繁殖的克隆羊，即成体母羊的复制品。
它的成功提示我们可以进一步做到，在培育体细胞成为核供体之前，利用“基因靶”技术精确地诱发核基因的遗传改变或精确地植入目的基因，再用选择技术准确地挑选那些产生了令人满意变化的细胞作为核供体，从而生产出基因克隆体。
也就是说，我们可以按照人的意志去改选、生产物种。
第三，在现代生物学领域中，沿有任何一项研究成果能够比通过对基因进行有规律地控制而解决更多的问题的先例。
多利羊的诞生及生长表明，利用克隆技术复制哺乳类动物的最后技术障碍已被突破，在理论上已成为可能
（八）转基因动物与动物反应器
（1）动物转基因技术的主要步骤。
外源目的基因的制备外源目的基因的有效导入胚胎培养和移植外
源目的基因表达的检测
（2）动物转基因技术有哪些方法和技术线路，各有何特点。
1.基因显微注射法，
技术路线：
目的基因的制备与纯化卵供体母鼠和假孕母鼠的准备超排卵与取卵基因显微注射受精卵移植目的基因的表达整合鉴定和检测建系
特点：
优点：
外源DNA分子大小基本不受限制，外源DNA在宿主动物染色体上的整合率高，方法简单，导入过程直观。
缺点：
试验周期跨度较长，整合位点随机，易造成胚胎或动物死亡；整合多为多拷贝首尾串联相接，不利于研究基因的结构、功能及表达调控。
2.逆转录病毒感染法，
技术路线：
逆转录载体的构建包装细胞重组逆转录病毒感染早期胚胎
特点：
优点：
能高效感染宿主细胞；缺点：
被导入的外源基因大小受限制，安全性不可靠。
3胚胎干细胞导入法，
技术路线：
特点：
4.精子载体导入法
5.YAC介导的基因转移
优点：
保证巨大基因的完整性，保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率提高，，，，，，，，，，
第二部分
（九）植物细胞工程
9.1基本概念
植物细胞工程：
植物细胞工程是植物生物技术的一个重要组成部分，是在离体培养条件下，细胞水平上对植物材料进行遗传操作的技术，即对植物体的任何一个部分（器官、组织、细胞、原生质体）进行离体诱导使其称为完整植株的技术。
植物细胞工程的理论基础：
（1）细胞是构成植物有机体的结构和生命活动的基本结构单位。
（2）植物细胞的全能性，即植物细胞是在生理上和发育上具有潜在全能性（totipotent）的功能单位
外植体：
指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。
愈伤组织：
从植物各种器官的外植体增殖而形成的一种无特定结构和功能的细胞团。
脱分化：
已分化的细胞在一定因素作用下重新恢复分裂机能并改变其原来的发展方向而沿着一条新的途径发育的过程。
再分化：
脱分化的细胞团或组织经重新分化而产生新的具有特定结构和功能的组织或器官的一种现象。
极性（polarity），是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理分化上的梯度差异。
细胞分化（differentiation）,是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式的过程
植物细胞培养：
指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养。
得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，而获得大量的细胞群体的一种技术。
9.2植物细胞培养常用培养基分类、组成和各营养成分作用
根据目前常用培养基配方中含盐量多少可将培养基分为以下四大类。
（一）含盐量较大的培养基
（1）较高浓度的硝酸盐、铵盐和钾盐，微量元素种类也很多
（2）MS培养基以及改良的MS培养基。
LS（Linsmaier和Skoog，1965）、BL（Brown和Lawrence，1968）、ER（Eriksson，1965）。
（3）该类培养基有利于愈伤组织的诱导、生长和细胞培养。
其中MS培养基在各类植物的组织、器官、细胞和原生质体培养中都取得很好的效果，是应用范围最广和适应性最强的培养基。
（二）硝酸钾含量较高的培养基
（1）这类培养基盐浓度也很高，尤其是硝酸钾的含量较高，如B5（Gamborg等，1968）、N6（朱至清等，1975）、SH（Schenk和Hildebrandt，1972）。
培养基中的和由NH4H2PO4提供。
（2）B5培养基含有较低的铵。
实践证明，有些植物的愈伤组织和悬浮培养物在B5培养基上更适宜，比在MS培养基上生长得要好，尤其是那些对铵比较敏感的植物组织和细胞的离体培养效果更好。
（三）含盐量中等的培养基
这类培养基中大量元素为MS的1/2，微量元素种类减少，但含量增加，维生素种类比MS多，
（四）低盐浓度的培养基
这类培养基包括White培养基（1943）、WS（Wolter和Skoog，1966）和HE培养基（Heller，1953）等，其中White培养基由于无机盐的数量比较低，更适合木本植物的组织培养。
组成：
糖：
提供碳源和能源
氮：
提供氮源，氮参与核酸及蛋白质的合成，对胚状体和芽的形成有良好的促进作用。
生长激素：
包括生长素、细胞分裂素、赤霉素
9.3植物单细胞制备方法、单细胞培养方法及其特点
1）．制备方法
机械法：
指通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。
酶解法：
指用专一的水解酶在温和条件下分解胞间层，分离细胞
愈伤组织诱导法：
指将愈伤组织反复继代，再转移至液体培养基振荡培养。
添加生长素或酶。
2）单细胞培养方法
（1）．平板培养法
指将一定量细胞接种到或混合到一薄层固体培养基里进行培养的方法。
平板培养的优点是便于在显微镜下对细胞进行定点观察,选择单细胞株和筛选突变体。
（2）．看护培养与饲养层培养法
看护培养：
是指用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的培养方法。
该方法的优点是简便易行，效果好。
但不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程
饲养层培养：
是用处理过的、无活性或分裂慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。
（3）．液体浅层静置培养法
液体浅层静置培养法：
指将一定密度的悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层，封口静止培养，该方法优点：
易于补加新鲜培养基，便于镜检。
9.4植物组织培养类型
1、种子培养
种子培养（Seedculture）是指在离体条件下通过种子获得苗或植株的培养。
2、胚培养
胚培养（Embryoculure）是指离体成熟胚或幼胚的培养。
3、器官培养
器官培养（Organculture）是指离体植物器官的培养，可以包括不同的类型，如茎尖（shoottip）、芽培养、根培养和花药培养
4、细胞培养
细胞培养（Cellculture）是指保持较好分散性的离体细胞或很小的细胞团的液体培养。
5、原生质体培养
原生质体培养（Protoplasmculture）是指利用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞壁而获得的完整的具有活力的原生质体的培养
（十）植物快速繁殖
（1）植物脱毒基本原理、方法
基本原理：
病毒在植物体内分布具有不均匀性
方法：
微茎尖培养法、株心组织培养法、热处理法
（2）对植物病毒鉴定方法和特点。
（十一）植物愈伤组织
11.1基本概念
愈伤组织：
是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖所形成的无特定结构的具有再分化能力组织
继代培养：
11.2愈伤组织形成过程及其特点
愈伤组织形成包括诱导期，分裂期，分化期。
诱导期特点：
改变原来的分化方向和代谢方式，合成代谢加强，合成大量蛋白质和核酸物质为细胞的分裂和增殖奠定基础
分裂期特点：
外植体外层细胞开始分裂，细胞脱分化，愈伤组织结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明
分化期特点：
Callus表层细胞分裂逐渐停止，而转向其内部的局部地区，并改变分裂面的方向，出现瘤状结构外表，Callus中可以发现维管组织，但不形成维管系统
11.3）愈伤组织形成影响因素。
基因型：
基因型是控制愈伤组织形态建成的关键，同属不同种，甚至同一物种不同品种的愈伤组织器官分化的能力也不同。
外植体：
分化水平较低的薄壁细胞和处于分裂的分生组织细胞较易诱导出愈伤组织
外植体的生理年龄：
外植体的生理年龄也影响愈伤组织器官发生的能力，
培养基的类型：
诱导愈伤组织常用的培养基为MS和B5。
高盐浓度的培养基可能对培养过程中愈伤组织数量及鲜重增加有益。
培养基的成分：
生长调节物资;培养基中生长调节物质对愈伤组织的诱导及增殖起着重要的调节作用。
（十二）体外单细胞诱导与单倍体育种
12．1单倍体诱种
单倍体育种是指将具有单套染色体的单倍体植物，经过人工染色体加倍，使其成为纯和二倍体，从中筛选出优良个体，直接繁育成新品种；或选出具有单一优良性状的个体，作为杂交有种的原始材料
12.2花粉培养
是指将花粉从花药中分离出来，放在无菌的人工环境中，使其进一步生长发育的技术。
12.3花药培养
指将成熟或未成熟的花药从母体植株上取下，在无菌条件下，生长发育的技术。
（十三）植物体细胞胚胎发生
（1）植物体细胞胚
体细胞胚即胚状体，指在组织培养中，由一个非合子细胞（体细胞），经过胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成的具有双极性的胚状结构。
（2）植物体细胞胚发生特点。
特点:
1）胚状体产生的数量比不定芽多；2）胚状体可以制成人工种子，便于运输和贮藏；3）胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。
（十四）人工种子
14.1人工种子：
所谓人工种子（artificialseed）是将细胞培养中形成的体细胞胚或不定芽包埋在能提供养分（人工胚乳）的胶囊里，再在胶囊外包上一层具有保护功能和防止机械损伤的外膜（人工种皮），造成一种类似于天然种子的结构。
14.2人工种子的组成
体细胞胚、人工胚乳、人工种皮
14.3人工种子的特点
1）可对一些自然条件下不结实的或种子很昂贵的植物进行繁殖。
（2）固定杂种优势，使Fl杂交种可多代利用，使优良的单株能快速繁殖成无性系品种，从而大大缩短育种年限。
（3）节约粮食。
（4）在人工种子的包裹材料里加入各种生长调节物质、菌肥、农药等，可人为地影响控制作物生长发育和抗性。
（5）可以保存及快速繁殖脱病毒苗，克服某些植物由于长期营养繁殖所积累的病毒病等。
（6）与试管苗相比成本低，运输方便（体积小），可直接播种和机械化操作。
（十五）、植物原生质体融合技术
（1）植物原生质体制备方法、培养基及培养方法。
1.材料预处理：
目的是提高原生质体的分裂率，暗处理、预培养、低温处理
2.外植体灭菌处理
渗透压调节
除试管苗、Callus和培养细胞外，其它外植体均需灭菌处理。
静止于黑暗中酶解间或轻摇
3．酶解处理
植物材料与酶液（1g（10-30ml）混合）
酶解几小时到24小时，25℃
4.原生质体收集和纯化：
过滤和离心相结合的方法
培养基及培养方法
禾谷类：
MS、N6等为基本培养基
十字花科和豆科：
B5、KM、K8p、KM8p
茄科：
MS、NT、K3
培养方法：
①固体培养法
纯化后悬浮在液体培养基中的原生质体悬液与热融并冷却至45℃的含琼脂糖的培养基等量混合，并迅速轻摇，混匀，冷却后原生质体被埋在固体培养基中
②液体培养法：
常用液体浅层培养法和悬滴培养法。
液体浅层培养法是将原生质体悬浮液2－3ml于三角瓶或培养皿中培养，初期每天轻摇动2－3次，防原生质体沉积皿底
悬滴培养法用刻度滴管原生质体培养液以50－100μL的小滴分开接种在无菌干燥的培养皿皿盖“反面”上，且以滴间不相碰为准，底皿加保湿液，将皿盖盖于底皿上，封口培养
③固液结合培养法
固液结合培养法即双层培养法，在底皿先铺一层固体培养基，其上进行原生质体的液体浅层培养
（2）植物体细胞融合方法有哪些。
诱导体细胞融合的方法主要有电融合法和聚乙二醇（PEG）高钙高pH值法
电融合法：
电融合法与PEG融合法相比具有三大优点：
一是不存在对细胞的毒害问题，二是融合效率高；三是融合技术操作简便
电融合的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间、直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。
聚乙二醇（PEG）高钙高pH值法
优点是：
融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。
缺点是：
融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害
（3）植物体细胞融合后杂种细胞筛选方法。
1.遗传互补选择法：
采用缺陷型亲本融合后产生野生型杂种。
当非等位隐性基因控制的两个突变体融合后，由于每个亲本贡献一个功能正常的等位基因，纠正了另一个亲本的缺陷，从而使杂种细胞表现为正常
包括：
营养缺陷型互补法
抗性互补选择法：
即利用抗生素、除莠剂或其他毒性物质的抗性等显性性状来选择杂种细胞。
2.可见标记法：
包括：
凹穴皿分离法：
根据融合构异核体和亲本原生质体的形态特征之间的区别，将异核体挑选出来，在加强培养基上用带凹穴的培养皿培养单个细胞杂种。
微吸管分离法：
用一种微吸管根据可见标记吸取异核体，进行“看护培养”以获得杂种细胞
（十六）植物转基因技术
1.植物转基因方法。
i.植物遗传转化法：
载体法和非载体法
载体法是以农杆菌（Agrobacterium
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