人用狂犬病疫苗地鼠肾细胞Word文档格式.docx

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规定。

2.1.2细胞制备

选用12~14日龄地鼠，无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，分散细胞，接种培养瓶，用适宜的培养液进行培养。

来源于同一批地鼠、同一容器消化制备的地鼠肾细胞为一个细胞消化批。

源自同一批地鼠、于同一天制备的多个细胞消化批为一个细胞批。

2.2毒种

2.2.1名称

生产用毒种为狂犬病病毒固定毒aG株或其他经地鼠细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。

2.2.2种子批的建立

生物制品生产和检定用菌毒种管理规程"

原始种子批为2aG1，主种子批应不超过4aG。

毒种在地鼠肾原代细胞和豚鼠脑内交替传代制备工作种子批，在地鼠肾原代细胞的传代应不超过第6代，即不超过10aG；

在豚鼠脑内传代应不超过第5代，即10aG5。

2.2.3种子批的检定

主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行2.2.3.1-2.2.3.5项检定。

2.2.3.1鉴别试验

用小鼠脑内中和试验鉴定毒种的特异性。

将毒种作10倍系列稀释，取适宜稀释度病毒液与等量狂犬病病毒特异性免疫血清混合，同时设立正常血清对照组，试验组与对照组的每个稀释度分别接种11-13g小鼠6只，每只脑内接种0.03ml，观察14天，中和指数应不低于500。

2.2.3.2病毒滴定

取毒种作10倍系列稀释，每个稀释度脑内接种体重为11-13g小鼠至少6只，每只脑内接种0.03ml，观察14天，病毒滴度应不低于8.0LgLD50/ml。

2.2.3.3无菌检查

依法检查（附录XIIA），应符合规定。

2.2.3.4支原体检查

依法检查（附录XIIB），应符合规定。

2.2.3.5病毒外源因子检查

依法检查（附录XIIC），应符合规定。

2.2.3.6免疫原性检查

用主种子批毒种制备灭活疫苗，腹腔注射体重为12-14g小鼠，每只0.5ml。

7天后重复接种1次作为试验组，未经免疫小鼠做对照组。

第一次免疫后的第14天，试验组和对照组分别用10倍系列稀释的CVS病毒脑腔攻击，每只0.03ml，每个稀释度10只小鼠。

保护指数应不低于100。

2.2.4毒种保存

冻干毒种应置-60℃以下保存。

2.3原液

2.3.1细胞制备

同2.1.2项。

2.3.2培养液

培养液为含适量灭能新生牛血清的乳蛋白水解物、MEM、199或其他适宜培养液。

新生牛血清的质量应符合规定（附录XIIID）。

2.3.3对照细胞外源因子检查

依法检查（附录XIIC），应符合规定。

2.3.4病毒接种和培养

当细胞培养成致密单层后，毒种按0.01－0.1MOI接种（同一工作种子批应按同一MOI接种），置适宜温度下培养一定时间后，弃去培养液，用无菌PBS或其他适宜洗液冲洗去除牛血清，加入适量维持液，置33-35℃继续培养适当时间。

2.3.5病毒收获

经培养适宜时间收获病毒液，即为病毒单次收获液。

根据细胞生长情况，可换以维持液进行多次病毒收获。

同一细胞批的同一次病毒收获液经检定合格后可合并为单次病毒收获液；

2．3．6单次病毒收获液检定

按3.1项进行。

2．3．7单次病毒收获液保存

于2-8°

C保存不超过30天。

2．3．8病毒灭活

病毒收获液中按1：

4000的比例加入甲醛溶液（应在规定的蛋白浓度范围内进行病毒灭活），置适宜温度、在一定时间内灭活病毒。

病毒灭活到期后，每个灭活容器应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验。

2.3.9合并及超滤、浓缩

同一细胞批制备的多个单次病毒收获液检定合格后可合并为一批，经超滤或其他适宜方法浓缩至规定的蛋白质浓度范围。

2.3.10纯化

经浓缩后的病毒液采用柱色谱法或其他适宜的方法纯化。

纯化后可加入适量人血白蛋白作为稳定剂，即为原液。

2．3．11原液检定

按3.2项进行。

2.4半成品

2.4.1配制

用疫苗稀释液将原液按同一蛋白质含量及抗原量进行配制，总蛋白质含量应不高于80μg/剂，并加入适宜浓度的稳定剂和一定量的硫柳汞作为防腐剂，即为半成品。

2．4.２半成品检定

按3.3项进行。

2．5　成品

2.5．1分批

生物制品分批规程"

2.5．2分装

生物制品分装和冻干规程"

2.5．3规格

每瓶1.0ml。

每1次人用剂量为1.0ml，狂犬病疫苗效价应不低于2.5IU。

2.5．4包装

生物制品包装规程"

3检定

3.1单次病毒收获液的检定

3.1.1病毒滴定

按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于5.5LgLD50/ml。

3.1.2无菌检查

依法检查（附录XIIA）,应符合规定。

3.1.3支原体检查

依法检查（附录XIIB）,应符合规定。

3.2原液检定

3.2.1无菌检查

3.2.2病毒灭活验证试验

取病毒灭活后供试品经透析后，接种25ml于原代地鼠肾细胞或其他适宜敏感细胞，每3cm2单层细胞接种1ml供试品，37℃吸附60分钟后加入细胞培养液，与供试品量比例不超过1：

3，每7天传1代，将培养21天后的培养液混合取样，分别进行动物法和酶联免疫法检测。

动物法为脑内接种体重为11-13g小鼠20只，每只0.03ml，观察14天，应全部健存（3天内死亡的不计，动物死亡数量应不超过试验动物总数的20%）；

采用酶联免疫法检查，应为阴性。

3.2.3蛋白质含量

取纯化后未加稳定剂的供试品，依法测定，应不高于80μg／剂（附录VIB第二法）。

3.2.4抗原含量

采用酶联免疫法，应按批准的标准执行。

3.３半成品检定

无菌检查

3.４成品检定

3.４.1鉴别试验

采用ELISA法检查，应证明含有狂犬病病毒抗原。

3.４.2外观

应为无色澄明液体，无异物。

3．4．3装量

按附录IA装量项进行，应不低于标示量。

3.４.4化学检定

3.４.4．1 pH值

应为7.2-8.0（附录VA）。

3.４.4．2 硫柳汞含量

应不高于50ug/ml（附录VIIB）。

3.４.4．3 游离甲醛含量

应不高于100ug/ml（附录VIL）。

3.4.4．4牛血清白蛋白残留量

应不高于50ng/剂（附录VIIIF）。

3.4.4．5地鼠肾细胞蛋白残留量测定

采用酶联免疫法，应不高于24ug/ml，并不得超过总蛋白质含量的30%。

3.４.5　效价测定

应不低于2.5IU/剂（附录XIA）。

3.４.6热稳定性试验

疫苗出厂前应进行热稳定性试验。

于37℃放置14天后，按3.４.5项进行效价测定。

如合格，视为效价测定合格。

3.４.6无菌检查

3.４.7异常毒性检查

依法检查（附录XIIF），应符合规定。

3.４.8细菌内毒素检查

应不高于50EU/剂（附录XIIE凝胶限量试验）。

3.4.11抗生素残留量检查

细胞制备过程中加入抗生素的应进行该项检查，采用酶联免疫法，应不高于10ng/ml。

4保存、运输及有效期

于2-8℃避光保存和运输。

自生产之日起，有效期为12个月。

5说明书