综述 质粒DNA生产工艺的研究进展Word文档格式.docx

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RemautE报道的一种由低拷贝发展而来的由温度控制的“失控型”复制子同样具有巨大的应用前景，这种失控的质粒可使质粒DNA大量积聚在大肠杆菌中，其拷贝数可以高达1000[15-16]，AnsorgeM和ChaoY证实这种拷贝数已成功地应用来表达大量的重组蛋白[17-18]，尽管“失控型”复制子的优势非常明显，但还没有使用这个类型复制子来构建DNA疫苗的成功例子，至今不清楚什么是导致此种复制子未得到开发的具体原因[19]。

2.抗性基因的选择

在选择抗生素抗性基因时，由于极少量即可引起部分人群强烈的过敏反应，首先应避免β-内酰胺类抗生素的使用，而应考虑氨基糖苷类的新霉素和卡那霉素[20]，因为这些氨基糖苷类的抗生素在临床上很少使用，且无耳毒性、肾毒性等副作用，所以更为合适[19]。

3.其他元件的考虑

设计、构建DNA疫苗和基因治疗质粒载体的策略已经十分明显，它除了必须包括一个能使质粒在大肠杆菌中维持、分裂的元件；

一个能促使目的基因在机体内表达的元件和选择标记外，还包括其他一些调控元件，以促使转基因的表达和质粒的稳定[21]，这些元件包括真核启动子、终止子及其终止信号等，启动子是外源基因在动物细胞内获得表达的必要前提，常见的有CMVI/E、SV40、EF-1α及UbC和MHCI等，CMV比SV40[22]和UbC[23]等更为有效，其中内含子A更能提高CMVI/E的表达水平[22]，CMV现已被广泛使用在商品化载体上，这对商业开发DNA疫苗来说是十分有帮助的。

另外，一些抗原基因本身来源的启动子也可用来构建DNA疫苗，但对于想同时表达多个抗原基因的质粒而言，此种启动子的效果不明显；

常用的转录终止子及终止信号包括牛生长激素（BGH）、SV40及人β-珠蛋白。

此外，在构建DNA疫苗时，可利用非甲基化的细菌DNA-CpG寡脱氧核苷酸来优化整个质粒，提高DNA疫苗的免疫原性，这是因为真核生物CpG的概率只有原核生物的1/16左右[24]，这种频率上的差异使得其与模式识别受体TLR-9的相互作用，提高了免疫应答水平[25]。

4.目的基因

在选择和构建质粒DNA时，首先应考虑的是质粒DNA可否整合入宿主基因组，因此，在选择目的基因时，须严格避免目的基因同人类基因组之间具有长片断的同源序列；

启动子和终止子同样须认真筛选以严格控制其生物学活性；

此外所有构建质粒DNA的过程需要有详细的记录，且附有基因的序列，宿主菌的表型和基因型鉴定[26-32]。

5.质粒的稳定性

质粒DNA导入宿主细胞后，必将引起宿主菌生理发生改变[33]，质粒的复制增加了宿主菌的负担，引起宿主菌生长速率下降，使得重组工程菌的发酵过程比非重组菌的发酵过程复杂化，进而有可能降低质粒DNA的稳定性；

同时，外源基因的插入也会干扰到质粒本身的稳定性，在以大肠杆菌为宿主的发酵过程，还必须考虑到宿主菌的遗传特性[34-36]，判定其是否存在可以降解重组DNA，或者产生引起重组DNA的不稳定性的蛋白酶或其他一些蛋白分子。

5.1质粒不稳定性的概念

质粒不稳定性，是指工程菌在生长过程中重组质粒发生变化，结果不呈现原有的表型特征。

质粒不稳定可分为两类：

分离不稳定性和结构不稳定性[37]。

分离不稳定是指在细胞分裂中由于缺陷分配引起部分或全部质粒的丢失；

结构不稳定则是由于重组质粒DNA上的缺失、插入或重排引起的，质粒的分配不稳定性和结构不稳定性的结果都将使我们得不到预期的质粒产量和质量。

如果发生质粒分离不稳定，由于部分重组质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是工程菌和不含有质粒的宿主菌的混合培养，Imanaka[38]证实在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的比生长速率（μ+）往往小于宿主细胞的比生长速率（μ-），经过25代后，培养液中几乎都是无质粒的细胞。

5.2质粒拷贝数

质粒拷贝数是体现质粒稳定性的一个重要特征，拷贝数首先决定于自身的遗传特性，同时也受到宿主菌生理状况及生长环境的影响，Enberg&

Nordstorm[39]研究认为宿主菌生长速率增大，质粒的拷贝数下降，这可能是高比生长速率下，质粒的复制速度跟不上细胞分裂的速度，从而质粒拷贝数不断下降。

此外，Koizumi[40]的研究同样证实了营养物质的限制或缺乏也会导致质粒拷贝数的下降。

一般来讲，质粒拷贝数对质粒稳定性的影响因质粒的不同而不同，Futcher&

Cox[41]对几种质粒的稳定性进行了研究，发现质粒稳定性随着拷贝数的增大而增加，但当质粒拷贝数太高时，质粒也往往不稳定，因多次复制，增加了出差错的机会。

5.3培养方式对质粒稳定性的影响

培养基对质粒的稳定性也起着非常重要的作用，Caulcott[42]研究表明质粒在以葡萄糖作为碳源时的丢失频率大于以淀粉为碳源的培养基。

低温往往有利于重组质粒稳定地遗传，而当温度高于50℃时，重组质粒在分批培养的对数后期和连续培养时均呈现遗传不稳定状态[43]。

5.4解决办法

在重组基因工程菌发酵过程中，克服质粒丢失的最广泛使用也是最有效的方法就是添加针对抗性基因的抗生素。

FDA规定不管在生产还是管理上都应用卡那霉素代替氨苄青霉素，其原因是考虑到β内酰胺类抗生素是一种强烈的过敏原；

另外，用抗生素添加法来消除质粒脱落性的不稳定性在大规模生产时并不可取，因为这种选择压力只能维持一段时间，要从根本上解决这个问题，需要研究影响质粒稳定性的各个过程（质粒的复制、质粒的转移及质粒在子代细胞中的分配等）[44]；

此外，质粒的平衡致死系统有可能为彻底摒弃抗生素的使用奠定基础[45]。

二、菌种库的建立

对转化大肠杆菌的条件进行优化。

建立原始种子库。

分析种子库的遗传稳定性，要明确该种子库可以传代的次数。

在此基础上建立主细胞库和工作细胞库，并应保证该类细胞库没有噬菌体和其它外源因子的污染；

并对细菌的遗传背景进行分析和检测，保证细胞库中细菌的遗传背景包括基因型、表型未发生改变；

应检测细菌的形态学，保证细菌的均一性；

应检测导入基因的存在状态。

并对工作细胞库的规模、保存条件、扩增条件、传代过程中质粒的稳定性（拷贝数及表达量）、允许的传代次数等进行研究。

三、含重组质粒基因工程菌的发酵

影响质粒DNA产量的因素最重要的是宿主菌株的遗传背景和质粒分子本身的拷贝数，除此之外，在工业发酵中宿主菌株的生长条件和培养基类型也是不可忽视的条件。

一般建议使用endA基因发生突变的（endA1）大肠杆菌宿主菌株，例如DH5α，JM109，以及XL1-Blue等，因为endA基因突变的结果，使得大肠杆菌宿主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶Ⅰ的能力，从而增进了所含质粒DNA分子的稳定性[46]。

在典型的分子生物学实验中，质粒是由大肠杆菌在摇瓶中发酵生产的，温度、转速和培养基是唯一可控制的因素[47]。

一般培养物的质粒产量在1-10mg之间；

在高密度培养的发酵罐中，诸如培养基组成、温度、pH值、溶解氧、积累的代谢产物，搅拌速度等影响细菌及质粒产量的因素都能得到监测和控制，质粒产量可达摇瓶的10到50倍[48]，LahijaniR[49]的研究数据显示每升培养基可以产出220mg质粒DNA，SchmidtT[50]也表明质粒产量可达225mg/L。

高密度培养技术的出现，不仅能增加产率，而且也为减少发酵罐容积、减轻分离纯化、减少污水、降低能耗和成本带来好处。

3.1培养基的组成

大肠杆菌可以在营养丰富或贫乏的培养基中生长，但是营养物的种类及来源对质粒DNA的质量和数量都产生重大影响[51]。

由于可生产高的细胞密度，丰富的、复合培养物，如酵母膏和/或蛋白水解物很受欢迎，肉膏因为可能含有疯牛病等动物病毒而成为潜在的污染源被排除在外。

除了丰富营养物，还需加入葡萄糖或甘油等碳源物质，Korz[52]研究表明，以甘油为基础的碳源培养基的生长速度较慢，几乎不产生乙酸，终产物也比以葡萄糖为碳源的培养基多，但当它们超过一定的范围时都会阻止细胞的生长，这就解释了为什么在间歇发酵中增加营养物的浓度并不能得到高细胞密度的原因。

目前，常用的有三种形式的培养基：

限制性培养基、半限制性培养基和复合培养基，其可重复性依次降低。

O’Kennedy[53]的研究结果表明，半限制性培养基生产质粒pSV的产量为9.12μg/mg干菌，比复合培养基的4-6μg/mg干菌高一些。

同时，O’Kennedy[54]还证实了用于质粒生产培养基最佳的C︰N为2.78︰1，最大比例不要超过12︰1，因为在此范围内，细菌膜上的肽聚糖的成分没有发生改变，不会影响到化学裂解的特性，在试验过程中，O’Kennedy还发现添加氨基酸后的限制性培养基SDCAS，无论在提高质粒超螺旋的比例上还是在减少质粒的丢失率上都比LB培养基的效果好，且SDCAS经碱裂解后产生的宿主基因组DNA也明显减少。

3.2发酵方式的选择

发酵一般以分批或者流加的方式进行[55]。

在这两种方式中，流加发酵可以提高细胞密度，并因此可能改变质粒的质量，Matsui[56]报道在发酵过程中添加固体葡萄糖，可以使DCW（drycellweight）达到134g/L，质粒在细胞中一般呈现负超螺旋结构，但据了解，宿主菌的生长条件，溶解氧及温度等的改变都可以改变超螺旋质粒的密度[57]。

D.J.Korz[58]研究证实，溶氧不足或CO2过剩都会促进乙酸形成，促使细胞衰老和死亡，降低质粒DNA的产量和质量。

Lahijani[59]探讨了温度和流加操作对质粒产量的影响，培养物在连续流加操作中保持37℃直至OD600达到某个数值后，升温至42℃或45℃，这样可大大提高质粒的产量，补料过程中，可尽量使用氨水来调节pH，这样可以补充氮源。

也有实验指出质粒的生产因为质粒本身而异，相同发酵条件下不同的质粒产量会有很大差异；

但多数研究者认为，控制细菌较低的比生长速率，对质粒的复制有很大的好处，因为，宿主菌过快的直接后果是质粒复制跟不上细菌的生长，导致拷贝数下降或者质粒丢失。

理想的质粒收获阶段应该是在细菌生长进入生长对数后期或静止期前期，此时RNA转录，蛋白质翻译的水平处于最低，质粒的复制达到最高水平。

1989年，Reinikainen[60]研究小组得出结论，pH值介于6.2-6.8之间和30℃的培养温度有利于ColE1类型复制子质粒产量的提高，此外，添加氯霉素[61]，氨基酸饥饿[62]，添加痕量维生素[63]等都可以提高质粒DNA的产量。

四、质粒的分离和纯化

在质粒的最终产物中，宿主基因组片段、高分子量的RNA尤其是核糖体RNA和质粒的异构体不利于质粒的基因转染，因此，如何有效消除这些杂质尤为关键。

因为质粒DNA的这种带负电荷的多形结构使得它的电荷性和亲水性能够与许多分子如内毒素和杂蛋白相结合，加大了其纯化的难度，虽然目前有很多种方法可用来纯化质粒DNA，但迄今并没有一个相关的标准。

在实验室未优化的条件下，质粒产量通常较低，且提取和制备的质粒DNA损失严重，不符合FDA等相关组织机构的条例。

除此之外，质粒的大规模提取要考虑到如何降低生产成本，并按照生物制品评价和研究中心（CenterforBiologicsEvaluationandRrsearch,CBER）下属的疫苗研究和管理办公室已有的章程严格执行[64]。

如前所述，质粒纯化时，主要考虑四种杂质：

gDNA，RNA，蛋白质和内毒素。

质粒的工业化大规模生产除了要除去这些杂质之外，还应该避免使用有毒，有机、易燃试剂和动物源性的酶试剂[65]。

在保证产率和纯度合格的情况下应选择省时、省成本、省纯化工艺的操作流程。

所有的操作都应该能够放大到每批生产克级甚至千克级的质粒。

最重要的是，所有过程要有重复性，这样才能使生产出的质粒一直符合产品规格。

一般的，质粒的大规模纯化包括下面几个或所有步骤：

细胞裂解，沉淀，酶消化，柱层析（一步或多步），脱盐或着改变缓冲液，以及无菌过滤。

质粒的大规模生产纯化的大致流程如下图所示[66]：

4.1细胞收集

细胞培养结束后，必须通过连续流或者微过滤[67]对培养菌体进行浓缩，这不仅仅是要对菌体进行浓缩，而且是为了去除对接下来的纯化有影响的培养基成分。

4.2细胞裂解

细菌细胞裂解是纯化流程中的关键一步。

可以通过多种手段来完成细胞的破

碎：

机械破碎（珠磨法、渗透压冲击等），酶解法，热裂解和碱裂解法。

4.2.1机械裂解

关于机械破碎裂解大肠杆菌以释放质粒的研究表明只有微流体化和珠磨法能获得完整的质粒分子。

当用微流化器破碎细胞达65％时，质粒最多可以回收35％，而用玻璃珠研磨破碎细胞达50％时质粒分子最多可以回收达74％，用微流化和玻璃珠研磨破碎细胞后，超螺旋质粒在总释放质粒中分别为80％和94％，增加细胞破碎频率将使超螺旋质粒减少至10％以下[68]，绝大多数质粒呈现“smear”形状，为获得相对产量较高的超螺旋质粒必须降低细胞破碎率，因此，在规模化生产上，这些破碎方法并不适用。

4.2.2热裂解

ZhijunWang[69]等研究认为热裂解具有不需完全破裂细胞、价格低廉、操作简便快捷等诸多优点，其所需设备一般有蠕动泵、去污剂和循环热水浴等，但是我们的热裂解实验结果表明：

靠蠕动泵将悬浮在Triton、EDTA中的菌液循环于沸水浴一段时间后，得到的菌液粘度太大，不易下一步操作，且含有的宿主基因组DNA太多，因此我们放弃了进一步的尝试。

4.2.3碱裂解

目前最受欢迎的细胞裂解法是由Birnboim&

Doly[70]提出的碱裂解法，它主要是靠0.2MNaOH、1%SDS和pH4.8的KAC来完成的，它的整个步骤包括我们常说的SolutionI、SolutionII、SolutionIII三步，首先是将菌体悬浮在SolutionI中，其中的EDTA比较关键，它起着两个作用：

（1）鰲合细胞膜和骨架上的Ca2+、Mg2+，从而使细胞更易破碎

（2）鰲合Mg2+，使得内源性DNase没有Mg2+不能发挥作用，保持质粒DNA的稳定性，另外SolutionI中的Tris起着稳定pH的作用，葡萄糖起着缓冲防止gDNA断裂的作用。

SolutionII是非常关键的一步，SDS破坏胞膜，释放菌体内容物，同时也能使绝大多数的蛋白质和脂肪变性并溶解，NaOH使质粒DNA和基因组DNA都变性，而质粒DNA由于有特有的拓扑超螺旋结构，可以在下一步中自然复性，而基因组DNA则永久变性，在这一步中注意事项是在混匀过程中动作必须轻柔，原因是防止局部pH大于13而导致质粒DNA不可逆变性和粗暴操作导致的基因组断裂，局部高浓度的SDS也会形成鬼带（ghoastband）[71]。

接下来的是用SolutionIII进行中和，使质粒DNA复性，同时高浓度的KAC也起到了盐析的作用，最终形成的SDS-gDNA-蛋白不可溶复合物而被去除，这一步使得变性的蛋白质和脂质变成不溶的，凝乳状的沉淀，同时一部分染色体DNA也沉淀出来，而质粒DNA仍然呈溶解状态。

这是因为染色体DNA和一些蛋白质及脂质是部分相连的，而质粒通常没有这种连接状态。

在最终的沉淀步骤，考虑到质粒DNA双螺旋结构是由两条带磷酸基的骨架构成，存在着互相排斥的可能性，所有可以在其中加入一些NaCl和NaAC等使得DNA更易沉淀，天气炎热时还可降低温度，以抵消布朗运动效应带来的质粒不易沉淀的后果。

由于SolutionIII中KAC的成本非常昂贵，为了降低生产成本，我们根据溶液III的原理，摸索了许多种新配方，同样也能达到相似的效果，成本却大大降低，为大规模生产质粒DNA提供了有力的保证。

4.2.4苯酚、氯仿直接抽提法

1999年，JunSong[72]等人报道了用苯酚和氯仿直接抽提培养菌液来获得质粒DNA的技术，这项技术可以大大节约质粒提取的时间，尤其体现在通量筛选重组克隆时优势明显，但其不能去除宿主基因组DNA。

4.3质粒制备液的净化和浓缩

在实验室水平上，去除细胞碎片、变性蛋白和核酸沉淀物的办法通常是离心。

然而，这并不适用于质粒DNA的工业化生产。

在工业操作中，这应该由被证明是产生剪切力低的操作来完成。

这是因为：

第一，应避免将染色体DNA剪切成片段，否则染色体DNA将从沉淀中释放并污染质粒；

第二，质粒在分离过程中也要受到剪切，如果质粒分子较大，则可能发生分子链的断裂。

工业上的离心机通常采用连续流加方式操作以达到高的处理量。

进入离心机的流体所产生的离心加速度可能导致剪切，从而打散已经沉淀的物质和gDNA。

因此，过滤成为比较理想的操作，但是如何防止粘稠的沉淀复合物不堵住过滤孔还是一个复杂的技术难题。

质粒DNA在大肠杆菌裂解液中只占总核酸的1%（w/w）[73]，裂解后，仍然存在大量的RNA和蛋白质，这些都必须在随后的步骤中被去除，同时应该降低溶液的体积以便于后续操作。

通常的处理方法是过柱法，包括离子交换[74]、分子排阻[75]、疏水层析[76]、三链DNA亲和层析[77]；

或者通过加入无水乙醇、异丙醇来达到浓缩质粒DNA的目的，但无论是前者还是后者都存在着不足，过柱的速度通常较慢，且质粒DNA的电荷性和疏水性与杂质RNA、内毒素、宿主蛋白都很相似，不易掌握具体的pH和盐浓度；

醇类的浓缩需要的体积很大，无疑增加了成本，而且有背于不能使用易燃、易爆物品的原则。

因此，其他的浓缩方法应运而生，这包括分子切向流法[80],小分子类物质如精胺[79]、十六烷基三甲基溴化铵[80]、聚电解质[81]等，另外芳香化合物[82]和MnCL2[83]等都有报道。

4.4宿主细胞中核酸和其他内容物的组成

正常生理状况下，大肠杆菌宿主细胞含有水、核酸、蛋白质、内毒素和小分子和一些离子，其占有含量和种类各不相同，分子量也差异很大，如Atkinson[84]所述，见表。

种类总量（％W/W）种类/个细胞平均分子量

水70118

核酸

基因组0.51a2.8×

106

转移RNA4.84028

核糖体RNA0.93500-1000

信使RNA0.3400-800660-990

质粒DNA<

113300b

蛋白质1511008-200

内毒素510

小分子和离子3800-200<

1

a．快速生长的大肠杆菌细胞中含有4个基因组分子。

b．质粒分子大小为5kb。

4.4.1RNA

粗制的质粒DNA中，RNA的含量是质粒DNA含量的20倍左右[78]，因此，如何有效地消除RNA尤其是大分子量的核糖RNA和信使RNA十分重要。

现今，绝大多数的纯化方法都使用了牛源性的RNaseA，这有违于禁止使用动物源性酶制剂的相关条例[85]。

2001年，Cooke[86]有使用表达RNaseA基因的宿主菌来制备质粒DNA的成功报道，本实验室也有使用大肠杆菌分泌表达的重组牛RNaseA来消除RNaseA的成功经验（未发表）。

David[87]的试验结果表明在碱性条件下长时间孵育也可以很好地消除RNA，但是根据我们的试验数据，超螺旋质粒DNA的比列严重下降，损害了质粒DNA的质量。

此外，37℃利用内源性RNaseA也可去除40％的RNA[88]，2M的氯化钙[89]、5M氯化锂[5]等都可成功消除RNA。

4.4.2蛋白质

粗制质粒中杂蛋白的含量也相当可观，一定数量的杂蛋白除了降低质粒DNA的转染效率外，可引起机体的异源免疫反应，它的去除一直依赖于对人体和环境有污染和腐蚀的苯酚、氯仿。

考虑到蛋白的分子量远远比质粒DNA小，Teeters认为可以利用分子量上的巨大差异来去除蛋白质[92]。

RusselJ[80]和Wahlund[81]报道利用CTAB或聚电解质与DNA双螺旋大小沟特异结合的特性可以选择性沉淀DNA，而将杂蛋白留在上清中，通过离心就达到去除蛋白的目的。

另外，用离子交换层析[91]和亲和层析柱[92]等技术都可以除去蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的，并取得了很好的纯化效果。

4.4.3内毒素

细菌内毒素是革兰氏阴性菌外膜上的特有结构，在细菌生长、死亡的过程中被释放出来，在质粒制备过程当中，细胞破碎后，大量的内毒素都释放到溶液中[93]。

由于内毒素具有极强的热源性，少量的LPS就可以引起发烧、血液循环障碍甚至休克死亡，因此它的去除显得十分地重要[94]。

由于内毒素常常形成囊状结构，其分子量与质粒大小相似，而且电荷性与疏水性都与质粒DNA相似，给质粒DNA的纯化带来了很大的麻烦。

目前，内毒素的去除方法主要分为三大类：

一是非选择性去除，包括活性炭吸附和萃取[95]，利用分子量差异进行的超滤[96]和pH值差异进行的离子交换色谱[97]，这几种方法没有考虑到LPS结构方面的特殊性质，去除效率较低；

二是选择性去除，主要是指亲和色谱法，找出适当的配基，将其固载于亲和色谱的基质上合成出亲和介质，即可成为一种高效能、高选择性的LPS吸附剂，这些包括组胺、组胺酸类[98]；

多粘菌素B[99]；

聚阳离子配基如PEI[100]，聚-L-赖氨酸[101]；

荷正电聚合物γ-甲基-L-谷氨酸酯[102]等；

三是特异性去除法，这是根据LPS结合蛋白（LBP）的结构和功能，提出的一种内毒素去除的特异性配体。

4.4.4基因组DNA

符合药物动力学质粒中的宿主基因组DNA的含量必须小于10ng/µ

g质粒DNA，在发酵至纯化的过