本科生六个基本生物学实验Word格式.doc

本科生六个基本生物学实验Word格式.doc

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3.4　弃去培养液，将离心管倒置于滤纸上1min，以使最后残留的培养液流尽。

3.5　加入冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液10ml重悬菌体，置冰浴30min。

3.6　4℃离心，4000g×

5min,弃去上清液，倒置于滤纸1min。

3.7　再加4ml用冰预冷的0.1molCaCl2重悬菌体（重悬时操作要轻）。

3.8　置4℃冰箱置12—24h，即可应用于转化。

思考题：

制备感受态细胞时加入CaCl2的作用是什么？

钙离子结合于细胞膜上，使细胞膜呈现一种液晶态。

在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，细胞膜的通透性发生变化，使外源DNA进入。

实验二质粒转化

1.原理　当宿主菌接受CaCl2处理后，细胞膜通透性改变，感染细菌的质粒很容易地透过细胞膜，在宿主菌酶系统的作用下，质粒大量繁殖。

通过进一步实验，可获得大量的质粒DNA，以供分子生物学实验所用。

一般的实验室都应用CaCl2处理细菌。

2.实验材料

2.1，质粒GFP-SNAT2-pBK-CMVΔ（kan抗性）

2.2，LB固体培养基平板（kan抗性），LB液体培养基

2.3，感受态细胞

2.4，1.5ml离心管，枪头，三角耙（以上物品需灭菌处理）；

移液器，冰，恒温水浴锅，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，-70℃冰箱

3.1　无菌状态下取新鲜感受态50μl置于无菌的1.5ml离心管。

3.2　每管加质粒50—100ng，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。

3.3　42℃热休克90s，不要摇动离心管。

3.4　每管加无抗生素的普通LB培养基950μl，37℃（150—180r/min）摇床，温和摇振45min。

3.5用无菌弯头玻璃铺菌器（三角耙），将10μl菌液铺于含卡那青霉素（Kan）的琼脂平板表面，37℃平放20min，然后倒置培养10—14h。

4.结果观察

计数全皿菌落数

5.写实验报告（详细描述转化菌落的生长情况）

6.思考题

请说明每一步骤的原理：

冰上30分钟、42度热休克90秒、37度温和震荡45分钟等。

冰上30分钟：

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。

42度热休克90秒：

42度短暂的热刺激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随即出现许多间隙，促进细胞吸收DNA复合物。

37度温和震荡45分钟：

促使在转化过程中获得新的表型得到表达

实验三质粒DNA的抽提和纯化

1.原理：

质粒为多数细菌和某些真核生物染色体的双链环状分子。

一般情况下，质粒并不是它的宿主细胞所必需的，如细胞分裂时，分裂的子细胞中不含质粒，但子细胞仍能生长分裂。

然而，许多质粒含有在特殊环境下所必需的抗生素抗性。

尽管质粒的复制有赖于宿主细胞的酶系统进行，但质粒DNA是独立于宿主基因组以外的环状分子，对于碱的裂解具有较强的耐受性，因此，用碱裂解法可将质粒DNA与宿主的线性DNA分开。

2材料

2.1质粒DNA小抽试剂盒，乙醇

2.2含质粒的菌液（GFP-SNAT2-pBK-CMV⊿）

2.3离心管，枪头（以上物品需灭菌）；

移液器，离心机

3．步骤

见试剂盒说明书

实验四琼脂糖凝胶电泳

1.原理：

带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。

各种生物大分子在一定的pH值条件下，可解离成带电荷的离子，在电场中向相反的电极移动。

分子生物学领域中，琼脂糖和聚丙烯酰胺作为支持介质的凝胶电泳应用最多，它们是分离、鉴定和纯化DNA及RNA片段的主要方法。

该方法操作简便、快速，可以分辨其它方法（如梯密度离心法）所无法分离的片段。

直接嵌入荧光染料后，在紫外灯下可直接检出DNA片段所在的位置，如有必要，从凝胶中回收DNA片段，用于各种克隆操作。

琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶均可制成各种不同大小、形状和孔径的凝胶块，在不同的装置上进行电泳。

琼脂糖比聚丙烯酰胺凝胶的分辨率低，但其分离范围广，约200bp~50kb的DNA。

琼脂糖凝胶电泳通常在水平装置上进行。

聚丙烯酰胺分离小片段（5~500bp）的效果较好，甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。

长度大于10000kb的DNA片段，可以通过电场方向呈周期性变化，在脉冲电场胶中进行电泳。

2.琼脂糖凝胶的性质：

琼脂糖是从海澡中提取的长链状多聚物，琼脂糖凝胶点为40~45℃。

当加热至90℃左右时，即可成清亮、透明的液体，浇在模具上冷却后固化形成凝胶，琼脂糖凝胶可区分相差100bp的DNA片段。

为了满足特殊的要求，可选择低溶点琼脂糖（<

70℃,低于双链DNA的变性温度）。

3材料

3.1琼脂糖，10mg/ml溴化乙锭，1kbDNAmarker

3.2100ml50×

TAE缓冲液：

Tris24.2g,冰乙酸5.71ml，0.5mol/LEDTA（PH6.8）10ml

3.36×

上样缓冲液：

0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油

3.4枪头，移液器，锥形瓶，微波炉，制胶槽，梳子，水平电泳仪，稳压器，凝胶成像系统

4　操作步骤：

4.1　将胶模槽放于水平工作台上。

4.2　用电泳缓冲液在微波炉中将琼脂糖颗粒用最短的时间完全溶解。

熔化琼脂糖溶液冷却至60度时，加入浓度为0.5μg/ml溴化乙锭10ul，充分混匀。

4.3　在胶模放置好梳子后，将具有一定温度的凝胶倒入胶模中，凝胶的厚度在3-5mm之间。

注胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。

4.4　凝胶凝固后通常需要在室温中放置30——45min，小心移去梳子，并将凝胶托盘放入电泳槽。

可同时制作几块凝胶，待其固化后用保鲜纸包住以防水分挥发，置4度保存，通常在数日之内可以使用。

4.5加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶表面1—2mm，样品孔内有气泡，用吸管小心吸去，以免影响加样。

4.6　将样品与上样缓冲液混合：

上样缓冲液不仅能提高样品的密度，使样品均匀沉到孔底，还可使样品带色，便于上样、估计电泳时间和判断电泳位置。

4.7　用微量移液器将样品依次加在样品孔内。

4.8　盖上电泳槽并通电，5V/cm2,恒压电泳，使DNA向阳极方向移动。

4.9　电泳完成后切断电源，取出凝胶。

如果凝胶中加有溴化乙锭，可直接在紫外透射灯下观察，否则就将凝胶浸泡在0.5微克/ml溴化乙锭缓冲液中浸泡30——45min。

4.10　用凝胶分析系统直接观察并拍照。

5.　注意事项：

5.1　加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器，并可对着光线肉眼检查凝胶溶解情况，使附着在壁上的颗粒完全溶解。

5.2　在微波炉上加热时间不要过长，以免引起暴沸。

如蒸发过多的溶液，应补充部分缓冲液。

5.3　气温较高或用低熔点、低浓度（小于0.5%）琼脂糖制胶、倒胶和电泳时，最好在4℃进行。

6.结果观察

6.1仔细观察DNA泳动的方向。

6.2DNA电泳结束后，记录正常组与marker组电泳条带的相应位置。

7.书写实验报告

实验五DNA限制内切酶技术

限制性内切酶（即限制性核酸内切酶，简称限制酶或内切酶）是一类能识别双链分子中特异核酸序列的水解酶，这类酶的发现和应用，促进了基因工程和DNA序列测定以及基因诊断技术的发展。

它的应用是当代分子生物学研究最基本、最重要的技术手段。

从质粒、噬菌体或粘性质粒获得的含有目的基因重组分子，必须经过酶切、电泳分离、回收基因片断，方可用于重组或探针标记。

根据酶切的目的不同，可采用小量酶切或大量酶切反应两种体系。

2．实验材料

2.1质粒SNAT1-PBK-CMV⊿（600ng/ul，150ul）

2.2限制性内切酶EcoRI

2.31kbDNAmarker

2.4离心管，枪头，移液器，离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳所需材料

3.小量酶切反应体系

本实验主要应用于质粒的酶切鉴定。

典型的反应是20μl体积中含0.2—1μgDNA，酶切反应体系如下：

质粒DNA5μl

10×

缓冲液1μl

限制酶（根据质粒酶切位点选择）1μl

双蒸去离子水3μl

总体积10μl

4.操作方法

4.1　在一灭菌的新的Ep管中加入3μl双蒸水。

4.2　加入10×

缓冲液1μl。

4.3　加限制酶1μl。

4.4　最后加入质粒DNA5μl。

4.5　稍离心，混合。

4.6　37℃水浴1—1.5h。

4.7取出后电泳分析鉴定是否酶解。

5.注意事项

5.1　双蒸水为可变体积，当其他反应成分的量确定后，用双蒸水将反应体积补足。

5.2　质粒DNA最后加入，以防止操作不当引起试剂的污染。

5.3　为保持限制酶的活性，将酶从低温冰箱取出后立即置于预先准备的碎冰中冰浴，操作应迅速，用后立即放回低温冰箱中。

5.4　大多数酶多以浓缩液存放，吸取时需严格取量。

若要取用多种酶，每种酶必须单独使用吸头，避免交叉污染。

5.5　大多数限制酶均加50%甘油缓冲液置于-20℃保存，其活力稳定，但在配制反应混合物时，酶的加入量要准确限制小于体积的1/10，否则甘油会抑制酶解反应。

5.6　如欲节省酶的用量，可增加酶解时间，但酶解时间过长，易出现异常条带。

5.7　当样品加入反应管之后，必须将装酶试管盖盖严，避免温育时水蒸汽进入管内。

6.1　DNA分子中分布的酶切位点的多少与酶解后条带呈正比。

仔细观察条带数量。

6.2.与Marker对照，观察各条带中的bp数。

6.3.书写实验记录并画图记录各条带的位置。

实验六PCR技术

PCR技术实际上是一个在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促反应，扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。

整个扩增过程分为三步：

①变性：

加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；

②退火：

突然降温后，模板DNA与引物按碱基配对的原则互补结合。

也存在2链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要结合发生在模板与引物之间；

③延伸：

在DNA聚合酶及镁离子存在时，从引物的3`端开始、结合单核苷酸，形成与模板互补的新的DNA链。

上述三步为一个循环，理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为下一轮模板链循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。

2.操作方法

针对本次实验的实验材料，体系和条件如下：

PCR产物约800bp

（一）材料：

2×

Taq聚合酶：

康为世纪

模板：

GFP-SNAT2-pBK-CMV⊿（56ng/ul）

上游引物：

12.5uM，35ul

（5，-3，CGTAATATTAGCGCGCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGG）

下游引物：

（5，-3，CGTACATATGCGCGCCACTTTATGCTTCCGGCTCGTATG）

（二）10ul体系：

ddH2O：

2.36ul

5ul

0.67ul

1.3ul

总体积：

10ul

（三）PCR条件：

1,94℃2min

2c，94℃30s

3c,66.1℃30s

4c,72℃1min

5,72℃10min

6,4℃----

循环数25，Totaltime：

1h42min

反应结束后，短暂离心。

3.注意：

1）Taq酶活性；

2）模板和引物的浓度。

4.结果观察

4.1电泳结束后，将琼脂糖凝胶置凝胶分析仪中，在紫外灯下观察PCR产物的电泳位置。

4.2与DNAmarker对照，准确描述目标产物的bp数（800bp）。

5.写实验报告