单核细胞增生李斯特菌检测方法探究进展2Word文件下载.docx
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Listeriamonocytogenesisoneoffoodbornepathogensthatcancausezoonosis,itisfoundubiquitouslyintheenvironment.Inrecentyears,itisoneofseveralkindoffoodbornepathogensthattheHealthdepartmentfocusonsurveillancetoinmanycountries.ThispaperintroducethebiologicalandepidemiologicalcharacteristicsofListeriamonocytogenes.SummarizethecurrenteffectiveconventionalandrapiddetectionmethodsandprocessesofListeriamonocytogenes.
Keywords:
Listeriamonocytogenes;
biologicalcharacteristics;
epidemiologicalcharacteristics;
convetionaldetectionmethods;
rapiddetectionmethods
文献综述
引言
单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes,LM）在分类学上隶属于李斯特菌属,是一种能引起人畜共患病的食源性致病菌。
近年来,LM在美国,加拿大和法国曾多次引起食物中毒,并确认和其他细菌一样,是病死率较高的暴发性食物中毒的重要原因之一。
美国在1986年曾以新闻形式报道了李斯特菌引起食物中毒的病例,以期引起人们重视。
目前,我国还未见报道发生本菌引起的食物中毒事例[1]。
WH0在20世纪90年代已将其列为食品四大致病菌之一[2]。
1LM的生物学特征
1.1形态特性
LM为革兰氏阳性短杆曲,直或梢弯,多数菌体一端较大,似棒状,常呈V字形列,
有的呈丝状,偶尔可见双球状。
在22-25℃培养可形成4根鞭毛,故在25℃幼龄肉汤培养物中运动活泼;
在32℃培养仪有一根鞭毛,动力缓慢。
在血清葡萄糖蛋白胨水中能形成就多糖英膜,无芽抱。
幼龄培养物为革兰氏阳性,陈旧培养物可转为革兰氏阴性[1]。
1.2培养特征
LM营养要求不高,兼性厌氧。
在含有肝浸汁、腹水、血液、血清或葡萄糖培养基中生长良好。
菌落初期极小,水滴样,37℃数天培养后,直径可达2mm,初期菌落光滑、透明,后变灰暗。
血乎板上的茵落有β-型溶血环。
LM耐碱不耐酸,在pH9.6中仍能生长,在PH5.6时仅可存活2~3d。
在4-5℃均能生长,最适生长温度为30~37℃[1]。
1.3生化反应
LM触酶阳性,氧化酶阴性,能发酵多种糖类,产酸不产气,如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖,不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖,不利用枸橼酸盐,40%胆汁不溶解,吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性,VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。
1.4血清型
根据菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原,将LM分成13个血清型,分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和“7”13个血清型。
致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后两型尤多[5]。
2LM食物中毒
2.1流行病学
LM食物中毒春季即可发生,发病率在夏秋季呈季节性增高。
导致食物中毒的主要为乳及乳制品、肉类制品、水产品、蔬菜及水果,尤其在冰箱保存过长的乳制品、肉制品导致的食物中毒最为多见。
牛乳中的LM主要来自人和动物粪便,人类粪便带菌率为0.6%~6%,即便是消毒牛乳,污染率也在21%。
畜禽在屠宰过程中易受到污染,食品从业人员的手也可以被污染,故生的和直接入口的肉制品LM的污染率高达30%[3]。
2.2毒力因子和致病机理
单细胞增生李斯特菌的致病性与其毒力因子密切相关,目前已知的毒力因子有溶血素、肌动蛋白聚合蛋白、C型磷脂酶、内化素、细胞壁水解酶、酰胺酶及毒力调节因子
如转录活化因子和应答调控因子等[4]。
单核细胞增生进入人体后是否发病,与该菌的毒力和宿主的年龄、免疫状态有关,因为该菌是一种细胞内寄生菌,感染途径是胃肠道,电镜观察的结果表明,肠上皮细胞为重要入侵门户,宿主对它的清除主要靠细胞免疫功能[5]。
LM经胃肠道感染后,侵入肠上皮细胞后被单核巨噬细胞吞噬,,并随其扩散到局部淋巴结,最后到达内脏器官,引起全身性感染[4]。
2.3中毒表现和预防控制措施
人感染LM的主要来源是食用被该菌污染的食品,主要通过粪-口途径传播。
自然感染的传播途径包括消化道、呼吸道、眼结膜以及皮肤损伤。
LM食物中毒可分为侵袭性和腹泻型两种类型。
侵袭型的潜伏期为2~6周。
患者开始常有胃肠炎症状,最明显的表现是败血症、脑膜炎,脑脊膜炎,有时有心膜炎。
对于孕妇可导致流产,死胎等后果。
对于幸存的婴儿则因患脑膜炎而导致智力缺陷。
腹泻型患者的潜伏期一般为8~24h。
主要症状为恶心、腹痛、腹泻、发热等肠胃道症状。
LM在一般加热处理中能存活。
所以在食品加工中,中心温度必须达到70℃且持续2min以上。
由于LM在自然界广泛存在,所以即使产品已经经过加热处理,充分灭活了该菌,仍有可能造成二次污染,因此,经过加热处理的食品防止二次污染是极为重要的[3]。
3LM的检验方法及流程
最初应用于单增李氏菌检测的方法为冷增菌法。
在4e条件下培养30d,有时甚至长达1年[7],由于该方法低效、耗时,已被常温培养方法所代替。
目前,国内外检测李氏菌的方法大体上可分为2类,一类为常规检测方法,另一类为快速检测方法。
用于食品LM的常规检验法主要是平板分离培养法。
快速检验法根据其原理不同,可分为传统的PCR检测法,实时荧光PCR检测法,酶联免疫吸附法,酶联免疫荧光技术,免役生物传感器、核酸探针杂交技术法。
3.1平板分离培养法
平板分离培养法是检测食源性致病菌的最传统的方法。
这种方法采用选择性培养基对目标菌进行增菌培养,然后进行生化鉴定,包括增菌、分离和鉴定三个环节[8]。
对于食品中单增李斯特菌的检测主要是将培养分离后的可疑菌落通过生化反应实验、溶血实验和动物实验等,鉴定为李斯特菌后进一步进行血清分型[9]。
目前对食品中的LM的检测主要采用国标法（GB/T4789.30-2010）,但是由于需要2次增菌,平板分离及生化鉴定,
整个过程至少需要4~5d。
近年来显色培养基的应用和API生化鉴定仪的联合使用已简化了鉴定步骤,但在应用过程中发现,API生化鉴定仪鉴定LM目前比较常用的TheApi-listeriatest主要依据10种生化反应（主要为糖发酵）,结果的判定主要依据颜色变化,因此颜色变化不明显,或不好界定时,其阴阳性判定带有一定主观性[10]。
3.2快速检验方法
3.2.1传统PCR检测方法
目前,应用分子生物学技术检测LM是一个不断探讨和深化的方向。
国外已经开展了大量的研究工作。
PCR的检测原理是将致病菌的特异性基因,如它的致病基因经PCR扩增后,再经过琼脂糖电泳和溴化乙锭染色,并在紫外灯下检测有无扩增带。
其检验流程是:
含待测菌的食品→打碎→前增菌→后增菌→PCR模板的制备→PCR扩增→琼脂糖电泳检测。
美国杜邦公司根据PCR原理,开发研制出BAX病原菌检测系统,可快速对食品中的病原菌进行检测。
在BAX系统中对单核细胞增生李斯特氏菌的检测,采用特定的引物,PCR扩增出400bp的DNA片断,若有这条扩增带,表明检测为阳性,反之,则为阴性[6]。
徐勤等[11]采用hly基因作为扩增的目标片段对10株临床分离株、24株标准菌株、8株从食品中分离的Lm进行了再鉴定,显示PCR法具有特异性强、速度快和易操作等优点。
彭国华等[12]根据Lm的inlA、plcA、plcB、hlyA基因设计4对相应的引物,检测不同浓度Lm纯培养物,得到了LM4Lm扩增出4个相应的产物,分别为255bp、129bp、260bp、234bp,其中inlA基因最低检出限为25.5μg/ml,其他3对引物最低检测限达
2.55μg/ml。
3.2.2荧光定量PCR检测方法
实时荧光PCR是近几年兴起的分子生物学检测技术,其检测灵敏性高,特异性好且操作简便,快速[13]。
这项技术与传统的PCR的基本原理相同,只是在反应混合物中加入荧光标记,它能结合在双链的特殊位置,依据循环的增加而导致荧光量的增加可直接对靶DNA进行定量,这项技术利用荧光染料和探针保证了扩增产物的特异性。
张丹丹等[14]根据LM的hly基因序列设计TaqMan探针和引物,建立荧光定量PCR检测方法,将反应试剂组装成试剂盒,其检测灵敏度为3.94fg/反应,具有特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点,可应用于单核细胞增生李斯特茵的快速检测。
徐德顺等[15]对建立的实时荧光PCR方法进行了引物、探针浓度和退火温度优化,在纯菌条件下,定量检测
低限为19cfu/mL,而且检测速度快,同时真个过程采取完全闭管式操作,从根本上杜绝了常规PCR扩增产物污染和假阳性问题。
3.2.3酶联免疫吸附法（ELISA）
ELISA技术自20世纪70年代出现开始,就因其高度的准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快以及费用低等优点,成为致病菌检验中最为广泛应用的方法之一[16]。
它是将抗原或抗体吸附于固相载体,在载体上进行免疫酶染色,底物显色后,通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量[17]。
我国目前对LM的酶联免疫反应法采用的是国标GB/T22429-2008[28]。
1992年Bhunia等[18]利用淋巴细胞杂交瘤技术建立的夹心ELISA方法,能于20h~24h内检测出8cfu/g-10cfu/g的样品。
段霞等[19]用抗LM的InlA单克隆抗体作为检测抗体,建立快速、特异的检测该菌的双抗夹心ELISA方法,对LM的纯培养液的最低检测量为1.7×
105CFU/mL,该方法用于实际样本LM的污染的筛查,可在48h内报告结果（包括前增菌）,比国标等传统检测方法省时省力。
现在已有单增李斯特菌检测试剂盒可供使用,用ELISA方法操作较简单,特异性强,反应灵敏度高,但单克隆抗体制备昂贵,检测费用较高[20]。
3.2.4酶联免疫荧光技术（ELFIA）
ELFIA是在酶联免疫吸附分析的基础上发展起来的一种快速检测微生物的方法。
该方法将酶系统与荧光免疫分析结合起来,在普通酶免疫分析的基础上用理想的荧光底物代替生色底物,可提高分析的灵敏度和增宽测量范围,减少试剂的用量。
孙素霞等[21]采用的自动酶联免疫荧光系统法（VIDAS）以碱性磷酸酶（ALP）作为酶标记用酶,以反应管作为固相载体,以4-甲基伞型酮磷酸盐（4-MUP）为酶反应荧光基质,具有检测速度快,灵敏度高等优点,同时具有操作简便、整个反应在再试纸条上完成,无管道,避免了交叉污染,不足之处就是检测特异性不是非常理想。
吕均[22]采用PCR与mini-VIDAS相结的方法,先进行增菌培养,然后对样品的二次增菌液进行PCR扩增,扩增阳性的样品再进行mini-VIDASLMO分析,最后通过ISO11290-1的标准方法来进行验证,该法可在48小时完成,且125份样品中只有2份鉴定为LM阳性,比单独使用PCR或mini-VIDASLMO都更加准确。
3.2.5免疫生物传感器检测法
免疫生物传感器是把具有分子识别功能的免疫生物活性材料如抗原、抗体等作为敏
感元件固定在特定换能器上进行测定的一类传感器,涉及生物学、物理学、化学、信息科学及相关技术科学[23]。
Leonard[24]等用单增李斯特菌抗体制备的表面等离子体免疫传感器,对食品中的单增李斯特菌检测限为105cfu/mL。
武会娟[25]等应用应用F0F1-ATP酶旋转分子马达和免疫技术相结合,建立免疫生物传感器快速检测技术,以pH敏感的荧光探针来感应酶活变化,通过荧光扫描仪检测不同菌量负载下的荧光信号,结果表明该方法对单核细胞增生李斯特菌标准菌株（ATCC15313）的检测时间为4.5h,检出浓度为100CFU/孔。
3.2.6基因探针检验法
吴仲梁等[26]用商品探针对100份市售食品中单核细胞增生李斯特菌进行检测,以酶联免疫荧光分析技术（VIDAS）和常规培养分离物做生化鉴定（API）做平行测试比较,发现该法具有准确,灵敏,快速,简易的特点,并且实验结果与国外文献报导一致。
孔义华等[27]采用基因探针化学发光检测法对FEPSA牛肉单核细胞增生性李斯特菌水平测试提供的二份盲样进行检测,从样本上机到检测出结果只需49h,可获得快速准确的结果,而且该方法也可直接对不增菌的样品进行检测,可将检测时间大大缩短至4h,但该方法只能对作出阴性和阳性判定,对李斯特菌属的其他菌种也只能作出阴性判定,不能作出种的鉴定。
4总结
平板分离培养法灵敏度高,成本低,可以给出定性和定量的结果,但检测过程中,制备培养基、计算菌落数量和鉴定菌落的生化特性都耗时耗力。
传统的PCR检测法具有特异性强、灵敏度高和速度快等优点,但也存在存在一些缺陷,比如琼脂凝胶的分析费时费力且易受主观因素影响,不能区分样品中死亡的单增李斯特菌等,目前研究者们已对PCR检测技术进行了多种改进。
实时荧光定量检测法具有检测周期短、灵敏度高、自动化程度高等优点,同时又解决了传统PCR技术易污染,不能定量等不利因素。
ELISA技术,具有操作简便、通量高的特点,可在同一时间内检测大量样品,但由于菌体及鞭毛抗原交叉反应的存在,还难以进行李斯特氏菌种间特异分析,同时,由于单核细胞增生李斯特氏菌表面抗原极其丰富,且大部分优势表位与属内外细菌有广泛的交叉抗原,给筛选特异性单克隆抗体带来一定的困难,增加了假阳性结果的几率。
免疫生物传感器选择型好,快速灵敏等特点,单由于生物活性单元具有不稳定性和易变性等缺点,使其
还存在一定的局限性,如易受活性物质干扰,缺乏长期稳定性和可靠性等,因此需要进一步改进。
核酸探针技术,虽较常规方法具有更多的优点,但还存在着诸如同位素标记探针的放射性污染、检测步骤复杂,耗时长等不足,并且缺乏环境监测和流行病学调查所必需的敏感性。
基因探针检验法有准确,灵敏,快速,简易的特点,但如果使用放射性同位素标记作核酸探针具有半衰期短、对人体有危害等缺点,作为常规诊断,特别是在食品检验实验室很不适用。
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