发酵工程工艺设计Word格式文档下载.docx

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简称BG酶，这类酶将纤维二糖和寡糖水解成葡萄糖分子。

1.2纤维素酶的作用机理

1.2.1几种纤维素酶的作用位点

纤维素酶是—类酶的总称，而非单一的酶。

目前在各种酶对纤维素的作用机理上，特别是对Cl-Cx酶假设尚有争议。

不过，下述四种酶的存在是众所公认的：

（1）内切β-1，4-葡聚糖酶（endo-β1，4-glucanase，EC3．2．1．4，简称EG）。

（2）外切β-1，4-葡聚糖酶（exo-β-1，4-glucanase，EC3．2．1．74）。

（3）纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase，EC3．2．1．91，简称CBH）。

（4）纤维二糖酶（cellobiase，EC3．2．1．21，简称BG）。

所谓的Cx酶，系指

（1）和

（2）。

其中纤维二糖水解酶又有内切和外切之分。

而C1酶则被认为是（3）。

图1-3表示这几种酶的作用位置。

图1-1各种纤维素酶的作用部位

1.2.2对纤维素分子的吸附作用

纤维素酶对纤维素的降解，一般首先需要吸附到纤维素上，但并不是好的吸附才有好的催化。

纤维素酶的吸附不仅与酶本身的性质有关。

也与底物的特性有密切相关，其能力大小与酶的含糖量和疏水性均有关联。

至于吸附过程是否可逆应视具体酶的种类而定。

Nidotsky等发现，里氏木霉的CBHII和EGIII对纤维素的吸附是个可逆过程，而CBHI是个不可逆过程，同时还发现除CBHI外，酶组分吸附与相应的水解活力之间没有线性关系。

此外，纤维素酶的吸附机制并末完全弄清，仍需做进一步研究。

1.2.3纤维素酶中单个组分的作用机制

纤维素酶的断键机制与溶菌酶一样，遵循双置换机制，即作用部分的两个色氨酸参与与基质结合，而处在将被裂解的键及相邻一个非离子化的甘氨酸和一个离子化的谷氨酸残基参与催化作用。

这些残基被非极性化的侧链围绕，以促进质子转移。

打断N-乙酞粘质酸-N-乙酞氨基葡萄糖键。

人们用定点突变技术和酶专一性抑制剂实验证明了谷氨酸位于细菌和真菌的CBH．EG和葡萄糖苷酶的催化位点，也有的纤维素酶是天门冬氨酸、组氨酸和精氨酸位于催化位点，参与催化反应。

推测谷氨酸-33和天门冬氨酸-50参与葡萄搪内切酶催化：

实验证明谷氨酸-65和天门冬氨酸-81，92可能是纤维二糖水解酶的催化残基。

1.2.4纤维素酶的协同降解机制

前面提及的几种不同功能的纤维素酶在分解过程中存在协同作用。

该协同作用不但其作用顺序不是绝对的，就是各酶的功能也不是这样简单固定的。

研究表明，EG和CBH都能引起纤维素的分散和脱纤化（沿着纤维素的经度轴方向分层，形成更薄更细的亚纤维）。

这样纤维素的结晶结构被打乱，导致变形，使纤维素酶能深入纤维素分子界面之间，从而使纤维素孔壁、腔壁和微裂隙壁的压力增大，水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏，产生部分可溶性微结晶利于进一步被降解。

1.3纤维素酶的分子量、分子结构及等电点

不同微生物产生的纤维素酶分子量差异很大，即使同一酶系中的酶也有较大差异。

一般β-葡萄糖苷酶的分子量最大，常大于70kDa，有的甚至达400kDa。

外切纤维素酶的分子量一般在50kDa-60kDa左右。

内切β-葡萄糖苷酶一般低于50kDa文献报道中，最小的内切纤维素酶分子量为5．3kDa。

多数真菌和少数细菌的纤维素酶都含糖基。

糖基与蛋白之间以共价键结合，或呈可解离的络合状态。

糖基化作用在一定程度上保护酶免受蛋白酶的水解。

同时纤维素酶由于糖基化，使其所含碳水化合物的比率在不同酶之间发生差异。

导致酶的多形式和分子量的差别。

研究人员通过对纤维素酶一级结构和三级结构的研究发现。

纤维素酶分子普遍具有类似的结构。

由球状的催化结构域（catalyticdomains，CD）、连接桥（1inker）和纤维素结合结构域（cellulose．bindingdomains，CBD）三部分组成。

（1）连接桥：

纤维素酶的连接区大多富含脯氨酸（Pro）和氢基氨基酸。

连接桥的作用可能是保持CD和CBD之间的距离，也可能有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体：

（2）纤维素结合结构域：

它对酶的催化活力是非必需的，但它执行调节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用。

（3）催化结构域：

它体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。

等电点是蛋白分子的重要理化特征。

纤维素酶系中各组分的等电点，随着菌种来源、培养条件的变化而差别较大。

以棘抱曲霉为例，液体培养时各酶组分的等电点在3.5-5.02．间。

但固体麸皮培养产生的酶组分，在等电聚焦电泳时，甚至可布在两性电解质载体3.5-10的整个pH跨度上。

1.4产纤维素酶的主要微生物类群

（1）细菌：

主要有梭菌属Clostridium、纤维单胞菌属Cellulomonas、杆菌Bacillus、高温单胞菌属Thermomonospora、瘤胃球菌属Ruminococcus、拟杆菌Bacteriodes、欧文氏菌属Erwinia、醋弧菌属Acetovibrio、小双孢菌属Microbispora和链霉菌属Streptomyces等。

纤维单胞菌C．firei和高温单胞菌T．f．sca是被广泛研究的两种产生纤维素酶的细菌。

（2）真菌：

主要有白绢菌Sclerotiumrolfsii、白腐真菌P．chrysosporium以及木霉属Trichoderrna、曲霉属Aspergillus、裂殖菌属Schizophyllum和青霉属Penicillium等种属中的一些真菌，其中木霉属是研究最广泛的纤维素酶产生菌。

世界纤维素酶市场中的纤维素酶20％是来自木霉属和曲霉属。

（3）放线菌：

主要有链霉属，高温放线菌属和heremomonosporacurvata等。

2产纤维素酶的菌种选育

本实验选用里氏木霉发酵产纤维素酶。

里氏木霉为好气菌，其菌落在PDA平板上生长快，菌丝层较厚，致密丛束状，初期为白色，平坦，后期因产生分生孢子呈深绿色产孢区常排列成同心轮纹状。

菌落背面无色，有时呈浅黄色。

菌丝透明，有隔，细胞壁光滑，分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，分支多，对生或互生二至三级分支，整体想树枝；

分支与分生孢子梗近似直角，末端为小梗，小梗瓶行，分生孢子球形或长椭圆形，表面粗糙，布满小刺；

单胞，靠粘液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。

以里氏木霉为出发菌种，经初筛、复筛、诱变后，用液体深层培养发酵生产纤维素酶，里氏木霉发酵生产的是胞外酶，经过分离纯化后，就得到纯化的纤维素酶制剂。

2.1里氏木霉的特性

里氏木霉能用于生产纤维素在于以下几种特性：

1、 

里氏木霉生产纤维素产量高。

而且可以通过物理或化学诱变产生高产菌株；

2、 

里氏木霉容易培养和控制。

3、 

里氏木霉产纤维素酶的稳定性好，不易退化。

4、 

里氏木霉产生的纤维素酶是胞外酶，容易分离纯化。

5、 

其代谢物安全无毒，不会影响人员和环境，也不会对纤维素酶的生产造成不良影响。

2.2培养基

2.2.1筛选培养基

磷酸二氢钠0.1％。

硫酸镁0.05％，硫酸铵1.5％。

琼脂2.0％．纤维素粉0.5％～1.0％，pH值为5.8～5.9。

2.2.2刚果红纤维索培养基

刚果红纤维素培养基的配制见参考文献[6]。

2.2.3液体发酵培养基

种子培养基

（1）：

葡萄糖20g／L、蛋白胨1g／LMandels营养盐浓缩液100mL／L、Mandels微量元浓缩液1.0mL／L、lmol柠檬酸缓冲液50mL／L。

种子培养基

（2）：

用10g／L微晶纤维素取代20g／L葡萄糖，其余成分与种子培养基l相同。

其中，Mandels营养盐浓缩液有：

（NH4）2SO414g／L、（NH2）2CO3g／L、KH2P0420g／L、CaCl2•2H2O4g／L、MgS04·

7H2O0.2g／L；

Mandels微量元素浓缩液有：

FeS04·

7H：

05g／L、MnS04·

H2O1-6g／L、ZnS04·

7H2O1.4g／L、CoCl2·

6H2O3．7g／L；

lmol／L柠檬酸缓冲液：

柠檬酸（C6H8O7·

H2O）210g，H2O750mL，加NaOH78g，冷却后测pH约为4．2，加水至l000mL，pH约为4．5。

2.3菌种

木材厂土壤中筛选到l株产纤维素酶活较高的里氏木霉。

2.4酶活力测定

2.4.1酶活力的测定方法

取发酵液于5000dmin离心10min，上清液即为用于测定的粗酶液。

取50mgWhatmanNO．1滤纸条（1cmx6cm），加lmL0．05M柠檬酸一柠檬酸钠液冲液（pH值为4．8），加入适当稀释酶液50μI。

，50℃反应30min，加入DNS终止反应．沸水浴5min。

测还原糖。

以上酶活均扣除发酵液中的还原糖后计算酶活力。

2.4.2酶活力计算方法

1个滤纸酶活力国际单位（FPAIU／mL）定义为：

酶解反应中每分钟生成1.0mol/L葡萄糖（以还原糖计）的酶量。

4.2.3计算公式

2.3菌种筛选与鉴定

通过初筛．从土样中选取92株能够在以纤维素粉为惟一碳源的平板上生长旺盛的菌株。

将纯化后的菌株点到刚果红鉴别培养基上进行复筛。

选取透明圈较大的菌株10株。

通过摇瓶液态发酵。

测定酶活力，最终选取1株活力最高的霉菌（见图1）。

菌种鉴定特征为：

在察氏培养基上，肉眼观察菌落迅速蔓延。

形成较薄的菌丝层，菌落初期为白色、平坦，后期因产生分生孢子而呈深绿色。

产孢区常排列成同心轮纹状．菌落背面无色．有时也呈浅黄色。

镜检菌丝透明、有隔、细胞壁光滑，分生孢子梗由菌丝直立生出、无色、分枝多，对生或瓦生二至三级分枝．整体像树枝；

分枝与分生孢子梗近似自角，末端为小梗，小梗瓶形；

分生孢子球形或长椭图形，表面粗糙，布满小刺，单孢，靠黏液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。

据此初步鉴定为半知菌亚门丝孢纲丝孢目丛梗孢科木霉属里氏木霉。

2.4诱变处理

2.4.1诱变处理过程

诱变前培养：

把经在PDA培养基培养7天的孢子，用含0.1%吐温-80的缓冲液冲洗下，并移接到液体完全培养基上培养一段时间。

孢子悬液制备：

把上述培养液经离心后，加入生理食盐水或缓冲液制成孢子悬液，孢子浓度为106个/mL~108个/mL。

物理诱变：

把用生理食盐水制成的孢子悬液，移接到平面皿中，在无菌条件下在15W紫外灯下，进行诱变处理。

化学诱变：

把用缓冲液制成的孢子悬液，转移到一无菌试管中，并加入化学诱变剂（NaNO2或NTG），在摇瓶机内30℃、200处理一定时间后，经离心加入缓冲液制成孢子悬液。

中间培养：

把0.5mL经处理的孢子悬液移接到10mL、一定量的2-脱氧葡萄糖（2-DG）的完全培养基试管中，150r/min、28℃培养48h，再移接到一定量的2-脱氧葡萄糖完全培养基的试管中，150r/min、28℃培养24h。

取一定量上述培养液进行表面皿分离鉴定。

2.4.2变异菌株的筛选

表面皿筛选：

把经上述诱变的菌悬液，首先涂布在含有一定浓度的2-脱氧葡萄糖培养基表面，经28℃，7~10天倒置培养，把出现较大纤维素水解透明圈的菌落，作为表面皿筛选的优良菌种。

初筛：

把经表面皿筛选出的菌落移接到50m╳150mL的L型大试管中，经150r/min、28℃、5~6天摇瓶培养后，分别测定滤纸酶活和CMC酶活，并把酶活较高的菌株作为初筛优良菌株。

复筛：

把L型试管初筛的优良菌株，移接到装液

50mL的300mL三角瓶，经150r/min、28℃、6~8天摇瓶培养后，分别测定滤纸酶活和CMC酶活，把酶活较高的菌株作为复筛的优良菌株。

分离纯化：

把产酶稳定性比较好的菌株，再经表面皿分离纯化，摇瓶筛选出酶活较高的菌株作为下次诱变的出发菌株或产酶生产菌株。

用同样的方法，反复诱变，可得到抗分解代谢物阻遏的纤维素酶高产突变菌株，同时液使得纤维素酶的活力有了较大提高。

2.5菌种保藏

菌种保藏的要点是：

选择适宜的培养基﹑培养温度和菌龄,以便得到健壮的细胞或孢子；

保存于低温﹑隔氧﹑干燥﹑避光的环境中，尽量降低或停止微生物的代谢活动，减慢或停止生长繁殖；

不被杂菌污染，在较长时期内保持著生活能力。

本设计中里氏木霉采用沙土管法保藏。

将沙或土过筛﹑烘干﹑装管﹑灭菌﹑然後将菌种制成孢子悬液滴入其中混匀﹐放到盛氯化钙的干燥器里吸除水分﹐干燥後保存或用火焰封管後保存。

吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而处于休眠状态﹐可保存较长时期。

3培养基的优化

3.1产酶培养基

用10g/L微晶纤维素取代20g/L葡萄糖，加入吐温-801.0mL／L，其余成分与种子培养基

（1）相同，pH调至4．8。

3.2摇瓶种子培养

将50mL原始菌种接种到种子培养基

（1）的250mL锥形瓶中，121℃，30min灭菌。

接种后，于28℃，200r／rain震荡培养2.5-3d，培养液浑浊，作为种子液。

50mL种子培养基2的250mL锥形瓶中，121℃，30min灭菌。

吸取2.5mL种子液，接人装有50mL种子培养基2的250mL锥形瓶中，28℃、200r／min培养2d。

3.3产酶发酵培养

吸取2.5mL种子液，接入装有50mL产酶基础培养基的250mL锥形瓶中，28℃、200r／min下发酵培养。

3.4生长曲线的绘制

菌丝体干质量曲线：

从接种开始，每隔1d取样，菌丝烘干称质量，直至9d，绘制该菌株生长曲线，了解其生长周期。

细胞干质量的测定方法：

取5mL稀释到适当倍数的培养液，加入5mLlmol／L高氯酸溶液，沸水浴20min，测OD260，得[A]；

同上面方法测得接种前培养基测OD260，得[B]。

质量浓度（g／L）=0．65╳（[A]一[B]）。

滤纸酶活的曲线：

从接种开始，每隔1d取样，测定产酶基础培养基中单氏木霉产生的纤维素酶的滤纸酶活，直至9d，绘制该菌株滤纸酶活曲线，了解其生长周期内产酶情况，以利于找到菌体生长周期中最大的产酶的时间。

3.5纤维素酶活力测定

（1）葡萄糖（G）标准曲线的制作

取8支洗净烘干的25mL具塞刻度试管，编号后按表3加入标准葡萄糖（G）溶液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。

充分摇匀后，向各试管中加人3mLDNS溶液，摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至25mL，充分混匀。

在540nm波长下，以1号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。

（2）滤纸酶活力的测定根据Ghose推荐的方法测定滤纸酶活。

一个酶活单位（IU）定义为50℃下每分钟水解底物生成1μmol葡萄糖。

0．5行加入10mm×

60mm的滤纸条（约50mg），50℃水浴中保温60min，迅速加入3mLDNS溶液，混匀，沸水浴5min，取出置于冷水中冷却。

加纯水至25mL，混匀，以1号试管溶液为空白对照调零点，540nm下测定2、3、4号试管液的光密度值（光密度值在0．2～0．8log之间），根据3个重复光密度的平均值，存标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按式4.2.3计算出滤纸酶活力（U／g）：

3.6培养基的优化方法

3.6.1最佳工业纤维素浓度的选择

分别以浓度为10、20、30、40、50、60g／L的工业纤维素作为单一碳源，替代产酶基础培养基中的微晶纤维素，制备液体发酵产酶培养基，各取50mL分装于250mL锥形瓶中，做一组平行，灭菌后待用，吸取培养好的种子液2．5mL，接入上述培养基，28℃、160r／min下培养24h。

取培养时间1、2、3、4、5、6、7和8d的发酵液，用滤纸酶活力（FPA）法测定酶活，选取最佳工业纤维素浓度。

3.6.2最佳（NH4）2S04质量浓度的选择

以工业纤维素（浓度为30g/L）为单一碳源，分别以浓度为8、10、12、14、16、18g/L的（NH4）2S04。

，制备液体发酵产酶培养基，各取50mL分装于250mL锥形瓶中，做一组平行，灭菌后待用，吸取培养好的种子液2．5mL，接入上述培养基，28℃、200r／min下培养24h。

取培养时间1、2、3、4、5、6、7和8d的发酵液，用滤纸酶活力（FPA）法测定酶活，选取最佳（NH4）2S04浓度。

3.6.3最佳Mandels营养盐浓缩液浓度的选择

选取浓度为30g／L工、Ip纤维素为单一碳源，浓度为12g／L的（NH4）2S04。

，分别吸取50、75、100、125、150、175、200mL的Mandels营养盐浓缩液，制备液体发酵产酶培养基，各取50mL分装于250mL锥形瓶中，做一组平行，灭菌后待用，吸取培养好的种子液2.5mL，接人上述培养基，28℃、200r／min下培养24h。

取培养时间1、2、3、4、5、6、7和8d的发酵液，用滤纸酶活力（FPA）法测酶活，确定最佳Mandels营养盐浓缩液浓度。

3.6.4结果与分析

3.6.4.1葡萄糖标准曲线

根据不同浓度葡萄糖下测定的光密度值数据以葡萄糖含量（mg）为横坐标，对应的光密度值为纵坐标，绘出葡萄糖标准曲线，如图3-1所示。

图3-1葡萄糖标准曲线

3.6.4.2生长曲线

从接种开始，每隔ld取样，菌丝烘十称质量，直至9d，以培养天数（d）为横坐标，对应的菌体干质量（mg）为纵坐标，绘制该菌株生长曲线，了解其生长周期，绘制细菌生长曲线，如图3-2所示。

从接种开始，每隔ld取样，测定产酶基础培养基中纤维素酶的滤纸酶活，直至9d，以培养天数（d）为横坐标，对应的滤纸酶活（U·

mL-1）为纵坐标，绘制该菌株滤纸酶活曲线，如图3-3所示。

图3-2菌株生长曲线

图3-3菌株产酶曲线

3.4.6.3最佳工业纤维素浓度的选择结果

在其他条件不变的情况下，以不同工业纤维素浓度，对各个时间段滤纸酶活绘制曲线，以工业纤维素浓度（g／L）为横坐标，对应的滤纸酶活（U·

mL-1）为纵坐标，绘制图3-4。

由图3-4可知，其他条件不变的时候，工业纤维素含量为30g／L，在5d时滤纸酶活达到最高，所以确定工业纤维素的最佳浓度为30g／L。

图3-4不同工业纤维素浓度下的滤纸酶活

3.4.6.4最佳（NH4）2S04浓度的选择结果

在其他条件不变的情况下，以不同（NH4）2S04浓度，对各个时间段滤纸酶活绘制曲线，以（NH4）2S04浓度（g/L）为横坐标，对应的滤纸酶活（U·

mL-1）为纵坐标，绘制图3-5。

由图3-5可知，其他条件不变的时候，（NH4）2S04浓度为12g／L，在5d滤纸酶活达到最高，所以确定（NH4）2S04最佳浓度为12g／L

图3-5不同（NH4）2S04浓度滤纸酶活

3.4.6.5最佳Mandels营养盐浓缩液浓度的选择结果

在其他条件不变的情况下，以不同Mandels营养盐浓缩液浓度，对各个时间段滤纸酶活绘制曲线，以Mandels营养盐浓缩液浓度（mL／L）为横坐标，对应的滤纸酶活（U·

mL-1）为纵坐标，绘制图3-6。

由图3-6可知，其他条件不变的时候，Mandeis营养盐浓缩液浓度为150

mL／L，在5d时滤纸酶活达到最高，所以确定Mandels营养盐浓缩液最佳浓度为150mL／L。

3.4.6.6正交试验结果与分析

根据单因素实验得到的各因素最优浓度，选取各因素上下共3个因素水平，利用正交试验设计软件设计正交试验，并记录该条件下滤纸酶活。

根据记录的数据分别进行正交试验直观分析（极差分析）、方差分析。

根据R值的大小可知，3个因素的主次顺序为：

工业纤维素>

（NH4）2S04>

Mandels营养盐浓缩液。

比较各因素不同水平的平均效果值知道本正交试验最优组合为30g／L工业纤维素、12g/L（NH4）2S04、150mL／LMandels营养盐浓缩液效果较好。

4培养基的灭菌

4.1微生物的热死灭动力学方程

实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：

N：

任一时刻的活细菌浓度（个/L）

t：

时间（min）

K：

比热死速率常数（min-1）

取边界条件t0=0，N=N0，对

（1）积分得

或

图4-1

实验还证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同。

它表现为非对数的死亡动力学。

这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。

但当温度超过120˚C时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。

4.2温度对K的影响

微生物的热死灭动力学接近一级反应动力学，它的比热死灭速率常数K与灭菌温度T的关系可用阿累尼乌斯方程表征

A：

频率因子（min-1）

ΔE：

活化能（J/mol）

R：

通用气体常数[J/（mol.k）]

从方程（4）可以看出：

（1）活化能ΔE的大小对K值有重大影响。

其它条件相同时，ΔE越高，K越低，热死速率越慢。

（2）不同菌的孢子的热死灭反应ΔE可能各不相同。

对方程（4）两边取对数，得方程（5）

图4-2

K是ΔE和T的函数，K的对T的变化率与有关，对方程（5）两边对T取导数，得方程（6）。

由方程（6）可得出结论：

反应的ΔE越高，lnK对T的变化率越大，即T的变化对K的影响越大

试验表明，细菌孢子热死灭反应的ΔE