最全的动物疫病实验室检测方法Word下载.doc
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猪流感病毒RT-PCR检测 66
猪瘟病毒RT-PCR诊断试剂盒猪繁殖与呼吸综合症（Nsp21594~1680变异株）RT-PCR检测实验 68
一、布鲁氏菌病试管凝集试验抗原与阴、阳性血清 71
二、布鲁氏菌病虎红平板凝集试验 72
动物结核病诊断操作规程 73
常见ELISA操作方法
亚洲1型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒
一试剂盒内含物
.说明书亚洲1型口蹄疫阳性对照血清（己稀释浓度为1:
8）
.96孔ELISA板亚洲1型口蹄疫阴性对照血清
.液体稀释槽3%双氧水
.U型96孔抗原抗体反应板25×
PBST洗涤液（稀释时准确量取）
.封板膜豚鼠抗血清稀释液
.灭活亚洲Ⅰ型口蹄疾病毒抗原（用冰决包裹）终止液
.亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒兔抗血清包被缓冲液（碳酸盐）胶囊
.亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒豚鼠抗血清底物（柠檬酸-磷酸盐）缓冲液片剂
.兔抗豚鼠血清IgG-辣根过氧化物酶结合物OPD片剂
二器材准备（需用户自备）
1.移液器:
5-50µ
l移液器、0.2—10µ
l移液器、50—200µ
l移液器、50—300µ
l12道移液器各一把。
2.移液枪尖（若干）。
3.抗原抗体反应板:
微量血凝板（U型、V型均可）5块,本试剂盒配备两块,用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。
注:
抗原抗体反应板可重复使用,实验后,用水冲洗干净,然后用无离子水沸水浴30秒,晾干,待用。
4.超纯水,无离子水或蒸馏水。
三、试剂准备（需用户完成）
1.包被缓冲液（PH9.6）
将本试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开,将胶囊内粉末倒入100ml无离子水中溶解即可。
4℃存放,1月内有效。
2.洗涤液（PBST）
将本试剂盒配备的25倍浓缩PBST液（可能有结晶形成,用时微热溶化）用无离子水或蒸馏水做1:
25稀释。
（如果PH降低,务必用NaOH调至7.4）
3.底物溶液
取1片柠檬酸—磷酸盐片剂（本试剂盒配备）溶于100mL无离子水中,溶化后,取50mL溶液,再加1片邻苯二胺（OPD）片剂,充分溶解,分装（5mL/瓶或10Ml∕瓶）,避光之-2O℃保存。
用前避光溶化,临时每1mL上述溶液加10µ
L本试剂盒配备的3%的双氧水（H202）。
务必加双氧水!
四、操作步骤
1.用包被缓冲液稀释亚洲1型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度（1:
1000）,在ELISA板上每孔加50µ
l,振荡,封板或置湿盒内，室温过夜。
2.抗原抗体（阴阳性对照血清及待检血清）反应
根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。
图196孔酶标板检测10份样品布局图
S11:
8
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
+1:
32
-1:
4
1:
16
1：
64
128
256
512
1024
2048
l024
4096
图1为抗体滴度测定（定量）检测10份样品布局图;
图2为抗体滴度测定（定量）检测20份样品布局图。
图296孔酶标板检测20份样品布局图
S11:
S111:
S12
S13
S14
S15
S16
S17
S18
S19
S20
以图1为例,在U型血凝板上按50µ
l/孔量用PBST将待检血清从1:
4开始做2倍连续稀释至1:
512。
同时,按图示稀释阴阳性对照血清,然后每孔加入50µ
l用PBST稀释到使用浓度的亚Ⅰ洲型口蹄疫病毒抗原（1:
4,即1份病毒抗原、加3份PBST）,病毒抗原对照孔加100µ
l。
振荡混匀,封板,4℃过夜。
加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:
8开始的2倍稀释。
3.用洗涤液（1×
PBST）洗ELISA板5次,在洗水纸上甩干,再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔,每孔50µ
l封板,37℃温育1小时。
4.同上洗板5次,甩干。
用豚鼠抗血清稀释液稀释亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度（1:
1000）,每孔加50µ
l,封板,37℃温育1小时。
5.同上洗板5次,甩干。
用l×
PBST稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度（1:
500）,每孔加50µ
l封板,37℃温育1小时。
6.同上洗板5次,每孔加50µ
l底物溶液（务必加双氧水）,37℃温育15分钟。
每孔再加50µ
l终止液终止反应,立即在492nm波长下读取光吸收值（OD492nm值）。
五结果判定
1.试验认可标准
每块板设4孔病毒抗原对照,病毒抗原对照不加任何血清,直接用PBST稀释至使用浓度,与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔,50µ
l/孔,病毒抗原对照OD492nm值应在1.5±
0.5范围内。
阳性对照抗体效价应在1:
1024±
1滴度以内,阴性对照血清抗体效价应＜1:
8。
2.病毒抗原对照平均OD492nm值50%计算（临界值）
抗原对照是4孔,弃去最高和最低OD492nm值,计算剩余2孔的平均OD492nm值,再除以2,即50%对照值。
该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD492nm值。
3.结果判定
以病毒抗原对照平均OD492nm值的50%为临界值,被检血清稀释孔OD492nm值大于临界值的孔为阴性孔,小于或等于临界值的孔为阳性孔,阳性孔的OD492nm值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。
例如病毒抗原对照平均OD492nm值为1.2,则其50%为0.60。
若某一待检血清在1:
128时OD492nm值为0.6,则该份待检血清的抗体滴度为1:
128。
若临界值处于两个滴度之间,如处于1：
64与1：
128之间，则抗体滴度取中间值为1:
9O。
定性检测中,两个重复孔只要有一孔为阳性孔,则抗体滴度判定为1:
128,两孔均为阳性孔,则判定为抗体滴度＞1:
ELISA抗体效价≥1:
128,判定为亚洲1型口蹄疫抗体阳性。
ELISA抗体效价与保护力的关系:
牛、羊:
抗体效价≥1:
128,99%保护；
效价≤1:
16,不保护；
效价在1:
22-90之间,50%保护。
猪瘟抗原检测试剂盒
ClassicalSwineFeverVirusAntigenTestkit（CSFVAg）
概述
猪瘟病毒（CSFV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、边界病病毒（BDV）都是瘟病毒科黄病毒属的成员。
猪瘟病毒自从成为一种重要的病原体以来，给养猪业造成了巨大的经济损失，并引起猪的严重死亡。
感染高致病力猪瘟病毒后，猪在出现临床症状前会排出大量的病毒。
耐过急性或亚急性感染的动物会产生抗体并且不再散毒。
低致病力温和病毒会造成猪的隐性感染，病猪将会持续或间歇排出病毒直至死亡。
怀孕母猪与猪瘟病毒接触后可能通过胎盘感染胎儿。
先天性感染可能导致流产，木乃伊胎儿，死产和/或弱仔及畸形胎儿。
先天性感染低毒力病毒的结果是产出持续性感染的仔猪，仔猪出现免疫耐受，不表现任何症状向外排毒。
猪也有可能感染BVDV或BDV。
尽管这些感染通常呈温和经过并且是自限性的，但将它们同猪瘟病毒有效区分是很重要的。
原理
本ELISA检测试剂盒是用来检测外周血白细胞、全血、细胞培养物以及组织样本中的猪瘟病毒抗原。
采用双抗体夹心ELISA，将CSFV单克隆抗血清包被微量反应板，可与样品中的CSEV抗原结合。
猪瘟病毒的特异性单克隆抗体形成了夹心的上层。
形成的单克隆抗体+样品+单克隆抗体夹心可以用辣根过氧化物酶标记物检测。
加入与辣根过氧化物酶反应的底物，在酶的作用下形成有色产物。
通过酶标仪测定其吸光度。
可以用450nm单波长或450nm与620m双波长测定各孔吸光度。
试剂
本试剂盒采用96孔板，可以一次检测92个样品（每个样品1孔，每个对照2孔）或46个样品（每个样品2孔，每个对照2孔）；
或分6次使用，每次用2个板条，设2个对照，测定6个样品（每个样品2孔）。
为了检测结果的准确性，最好每个样本都设重复。
试剂数量
1、多克隆羊抗血清包被板条8孔×
12条（96孔）
2、10倍浓缩样品稀释液（10x）55ml
足以配制550mL直接使用的1x稀释液
3、10倍浓缩洗涤液（10x）125ml
足以配制1、25L直接使用的洗涤液工作浓度（1x）
4、CSFV单克隆抗体，含防腐剂4ml
5、阳性对照，含有防腐剂1.5ml
6、阴性对照，含有防腐剂1.5ml
7、100倍浓缩辣根过氧化物酶标记物（100x），
辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG，含有防腐剂200μl
8、酶标抗体稀释液15ml
9、底物液，TMB/H2O2溶液12ml
10、终止液，1MHCI（小心，强酸）12ml
注意事项
1、仔细阅读并遵守操作说明；
2、试剂盒试剂于2～7℃冷藏保存。
建议将浓缩的洗涤液（10x）保存在18～25℃室温，以免形成结晶。
3、所有试剂在使用前必须恢复至室温。
4、未使用的包被板应该密封保存在配备的塑料袋中，于2～7℃冷藏保存。
5、不要将不同批次的说明书以及试剂盒成分混合使用。
6、注意防止真菌或细菌污染试剂盒成分。
处理试剂时要小心。
7、不要用超过保质期的检测试剂盒。
8、进行样品或试剂操作时严禁吃东西、喝水或吸烟。
9、每个样品都用单独的吸头。
10、每一批次的试剂必须用其配备的阴阳对照。
11、配制试剂时只能用超纯水。
12、不要用嘴吸取液体。
13、底物溶液和浓缩的样本稀释液对眼睛、呼吸系统和皮肤有剌激性，避免与皮肤和眼睛接触。
14、终止液为1MHCl，HCI为强酸并且能造成灼伤，小心处理。
15、本试剂盒只能用于体外诊断。
兽医专用。
试剂配制
1、包被的反应板、猪瘟病毒特异性单克隆抗体、阳性对照、阴性对照、底物溶液、终止液为现用试剂。
2、洗涤液
10倍浓缩洗涤液必须用超纯水或双蒸水进行10倍（1：
10）稀释，稀释的洗涤液于2～7℃冷藏保存，但不能超过3天；
或冰冻保存，至少可以保存一年。
例如：
配制500ml稀释的洗涤液，将450ml超纯水或双蒸水加到50ml浓缩液中，混匀。
注意：
如果浓缩液有结晶，在使用前必须溶解。
可将瓶子放在温水中30分钟以上。
3、样品稀释液
10倍浓缩样品稀释液必须用超纯水或双蒸水进行10倍（1∶10）稀释，但如果检测全血样品时，将适量的10倍浓缩液与等体积的超纯水混合，制成5倍浓缩液（5X）即可。
将制备的稀释液于2～7℃冷藏保存，但不能超过3天；
或者冰冻保存，可以保存一年以上。
4、辣根过氧化物酶标记物（100x）
100倍（100X）浓缩标记物在使用前必须用标记物稀释液进行1∶100倍稀释。
如果只使用部分试剂，只要用稀释液按100倍（1∶100）稀释足够本次使用的标记物浓缩液（旋涡振荡混勾）即可。
稀释后的标记物溶液只能保存24小时。
10ml的辣根过氧化物酶标记物工作液，只需取100μl浓缩标记物（100X）加到10ml标记物稀释液中，在旋涡振荡器上混匀即可。
自备器材
1、精密移液器，5μ1至1000μ1
2、一次性移液吸头。
3、双蒸水或超纯水。
4、洗瓶或自动洗板机。
5、湿盒或封板胶带。
6、离心机，2000xg。
7、酶标仪。
8、离心管和小试管。
9、微量离心机，10，000xg。
10、旋涡振荡器。
11、剪刀和摄子。
12、0.17MNH4CI溶液，制备白细胞用。
样品制备
制备好的样品或组织可以在2～7℃保存7天，或-20℃冷冻保存6个月以上。
但这些样品在应用前应该再次以1，500xg离心10分钟或10，000xg离心2～5分钟。
外周血白细胞
a）取10ml肝素或EDTA抗凝血样品，1，500xg离心15～20分钟。
b）用移液器小心吸出血沉棕黄层，加入500µ
l样品稀释液（1X），在旋涡振荡器上混匀，室温下放置1小时，其间不时用旋涡器混合。
然后直接进行步骤f操作；
c）假如样品的棕黄层压积细胞体积非常少，那么就用整个细胞团（包括红细胞）。
将细胞加进10ml的离心管，并加入5ml预冷（2～7℃，下同）的0.17MNH4CI（氯化铵）混匀，静置10分钟。
d）用冷（2～7℃）超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠倒混匀，1，500xg离心5分钟。
e）弃去上清，向细胞团中加入500µ
l样品稀释液（1x），用洁净的吸头悬起细胞，在旋涡振荡器上混匀，室温放置1小时。
期间不时用旋涡器混合。
f）1，500xg离心5分钟，取上清液按"
操作步骤"
进行检测。
g）注意：
处理好的样品可以在2～7℃冷藏保存7天，或-20℃冷冻保存6个月，但在使用前必须再次离心。
外周血自细胞（简化方法）
a）取0.5～2ml肝素或EDTA抗凝血与等体积冷（2-8℃）0.17MNH4CI加入离心管混合。
室温放置10分钟。
b）1，500xg离心10分钟（或10，000xg离心2－3分钟），弃掉上清。
c）用冷（2～7℃）超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠倒混匀，1，500xg离心5分钟。
d）弃去上清，向细胞团中加入500µ
l样本稀释液（1x）。
旋涡振荡充分混匀，室温放置1小时。
取75µ
l按照"
全血（肝素或EDTA抗凝）
a）取25µ
l10倍浓缩样品稀释液（10X）和475µ
l全血加入微量离心管，在旋涡振荡器上混匀。
b）室温下温育1小时，期间不时用旋涡器混合。
此样品可以直接按照“操作步骤”进行检测。
或：
直接将75µ
l全血加入酶标板孔中，再加入10µ
l5倍浓缩样品稀释液（5X）。
晃动酶标板/板条，使样品混合均匀。
再按照“操作步骤”进行检测。
细胞培养物
a）移去细胞培养液，收集培养瓶中的细胞加入到离心管中。
b）2，500xg离心5分钟，弃去上清。
c）向细胞团中加入500µ
l样品稀释液（1x）。
取此样品75µ
l按照“操作步骤”进行检测。
组织
最好用新鲜的组织。
如果有必要，组织可以在处理前于2～8℃冷藏保存1个月。
每只动物检测1～2种组织，最好选取扁桃体、脾、肠、肠系膜淋巴结或肺。
a）取1～2g组织用剪刀剪成小碎块（2～5mm大小）。
b）将组织碎块加入10ml离心管，加入5ml样品稀释液（1x），旋涡振荡混匀，室温下放置1～2小时，期间不时用旋涡器混合。
c）1，500xg离心10分钟，取75µ
l上清液按照“操作步骤”进行检测。
操作步骤
所有试剂在使用前应该恢复至室温18～25℃；
使用前试剂应在室温条件下至少放置1小时。
1、每孔加入25µ
lCSFV特异性单克隆抗体。
此步骤可以用多道加样器（8～12道）操作。
2、在相应孔中分别加入75µ
l阳性对照、阴性对照，各加2孔。
注意更换吸头。
3、在其余孔中分别加入75µ
l制备好的样品，注意更换吸头。
轻轻拍打酶标板，使样品混合均匀。
4、置湿盒中或用胶条密封后室温（18～25℃）温育过夜。
也可以放置室温温育4个小时，但是这可降低检测灵敏度。
5、甩掉孔中液体，用洗涤液（1X）洗涤5次，每次洗涤都要将孔注满。
将孔中的所有液体倒空，用力拍打酶标板，以使所有液体拍出。
或者，每孔加入洗涤液250～300µ
l用自动洗板机洗涤5次。
洗涤酶标板要仔细细心。
6、每孔加入100µ
l稀释好的辣根过氧化物酶标记物，在湿盒或密封后置室温温育1小时。
7、重复操作步骤5；
每孔加入100µ
l底物液，在暗处室温温育10分钟。
第1孔加入底物液开始计时。
8、每孔加入100µ
l终止液终止反应。
加入终止液的顺序与上述加入底物的顺序一致。
9、在酶标仪上测量样品与对照孔在450m处的吸光值，或测量在450nm和620nm双波长的吸光值（空气调零）。
10、计算每个样品和阳性对照孔的矫正吸光值的平均值（参见“计算方法”）。
计算方法
首先计算样品和对照孔的OD平均值，在判定结果之前，所有样品和阳性对照孔的OD平均值必须进行矫正，矫正的OD值等于样本或阳性对照值减去阴性对照值。
矫正OD=样本OD－阴性对照OD
北京爱德士元亨生物科技有限公司奋进行平均值相UN值计算并提供数据汇总的仪器和软件系统（xChek）
试验有效性判定
阳性对照OD平均值应该大于0.500，阴性对照OD平均值应小于0.150，试验结果方能有效。
否则，应仔细检查实验操作并进行重测。
如果阴性对照的吸收值始终很高，将阴性对照液在微量离心机中10，000xg离心3～5分钟，重新检测。
结果判定
被检样品的矫正吸光值大于或等于0.30，则为阳性：
被检样品的矫正吸光值小于0.20，则为阴性；
被检样品的矫正吸光值大于0.20，小于0.30，则为可疑。
建议根据外周血白细胞处理方案或细胞培养物处理方案进行全血样品的处理和检测。
猪瘟病毒抗体阻断ELISA试验
本方法是用于检测猪血清或血浆中猪瘟病毒抗体的一种阻断ELISA方法，通过待测抗体和单克隆抗体与猪瘟病毒抗原的竞争结合，采用辣根过氧化物酶与底物的显色程度来进行判定。
1操作步骤在使用时，所有的试剂盒组分都必须恢复到室温18～25℃。
使用前应将各组分放置于室温至少1小时。
1.1分别将50uL样品稀释液加入每个检测孔和对照孔中。
1.2分别将50uL的阳性对照和阴性对照加入相应的对照孔中，注意不同对照的吸头要更换，以防污染。
1.3分别将50uL的被检样品加入剩下的检测孔中，注意不同检样的吸头要分开，以防污染。
1.4轻弹微量反应板或用振荡器振荡，使反应板中的溶液混匀。
1.5将微量反应板用封条封闭置于湿箱中（18～25℃）孵育2小时，也可以将微量反应板用封条置于湿箱中孵育过夜。
1.6吸出反应孔中的液体，并用稀释好的洗涤液洗涤3次，注意每次洗涤时都要将洗涤液加满反应孔。
1.7分别将100uL的抗CSFV酶标二抗（即取即用）加入反应孔中，用封条封闭反应板并于室温下或湿箱中孵育30分钟。
1.8洗板（见1.6）后，分别将100uL的底物溶液加入反应孔中，于避光、室温条件下放置10分钟。
加完第一孔后即可计时。
1.9在每个反应孔中加入100uL终止液终止反应。
注意要按加酶标二抗的顺序加终止液。
1.10在450nm处测定样本以及对照的吸光值，也可用双波长（450nm和620nm）测定样本以及对照的吸光度值，空气调零。
1.11计算样本和对照的平均吸光度值。
计算方法如下：
计算被检样本的平均值OD450（＝ODTEST）、阳性对照的平均值（＝ODPOS）、阴性对照的平均值（＝ODNEG）。
根据以下公式计算被检样本和阳性对照的阻断率；
ODNEG-ODTEST
阻断率＝———————×
100%
ODNEG
2试验有效性阴性对照的平均OD450应大于0.50。
阳性对照的阻断率应大于50%。
3结果判定如果被检样本的阻断率大于或等于40％，该样本被判定为阳性（有CSFV抗体存在）。
如果被检样本的阻断率小于或等于30％，该样本被判定为阴性（无CSFV抗体存在）。
如果被检样本阻断率在30～40％之间，应在数日后再对该动物进行重测。
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