表达载体的构建方法及步骤Word格式.docx

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（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。

如果构建的目

的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：

【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

如<

10kb选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：

选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；

表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：

（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载

体）；

（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<

10个。

（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；

（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。

（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。

无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。

如何阅读质粒图谱

第一步：

首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）

第二步：

再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。

（1）Ampr水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。

（2）tetr可以阻止四环素进入细胞。

（3）camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。

（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活

（5）hygr使潮霉素β失活。

第三步：

看多克隆位点（MCS）。

它具有多个限制酶的单一切点。

便于外源基因的插入。

如果在这些酶切位点以外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。

决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：

再看外源DNA插入片段大小。

质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。

一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。

第五步：

是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。

这是用来区别克隆载体与表达载体。

克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。

选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。

第六步：

启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号

（1）启动子－促进DNA转录的DNA序列，这个DNA区域常在基因或操纵子编码序列的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。

（2）增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。

其作用与增强子所在的位置或方向无关。

即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。

/沉默子－负增强子，负调控序列。

（3）核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：

mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。

（4）转录终止序列（终止子）/翻译终止密码子：

结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。

结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。

质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上.根据表达宿主不同，构建时所选择的载体也会不同。

二、目的基因的获得

一般来说，目的基因的获得有三种途径：

调取基因：

根据目的基因的序列，设计引物从含有目的基因的cDNA中通过PCR的方法调取目的基因，链接到克隆载体挑取单克隆进行测序，以获得想要的基因片段，这种方法相对成本较低，但是调取到的基因往往含有突变，还有不同基因的表达丰度不同，转录本比较复杂，或是基因片段很长，这些情况都很难调取到目的基因。

全基因合成：

根据目的基因的DNA序列，直接设计合成目的基因。

此方法准确性高，相对成本会高一些，个人操作比较困难，需要专业的合成公司完成。

优点是可以合成难调取及人工改造的任何基因序列，同时可以进行密码子优化，提高目的基因在宿主内的表达量。

三、克隆构建

目前，克隆构建的方法多种多样，除了应用广泛的酶切链接以外，现在还有很多不依赖酶切位点的克隆构建方式。

下面具体说一下双酶切方法构建载体的步骤。

实验材料

实验试剂

试剂名称

生产厂家

载体pCDNA3.1

Transheep

大肠杆菌菌株DH5α

Tiangen

限制性内切酶

Fermentas

T4连接酶

质粒DNA小,大量抽提试剂盒

Axygen

凝胶回收试剂盒

Axygen

琼脂糖

Biowest

DNAladder

（2）X基因慢病毒载体的构建

X基因基因由Transheep全基因合成，构建于载体PUC57中。

PUC57-X基因EcoRI/BamHI酶切结果：

酶切完成后进行胶回收

2.载体用pCDNA3.1双酶切，酶切体系如下。

20ul酶切体系37度3小时

4ulpCDNA3.1载体（500ng/ul）

1ulBamHI

1ulEcoRI

2ul10×

buffer

12ulH2O

酶切完成后胶回收（见附录）

处理好的目的片段与载体连接反应体系：

6ulPCR酶切回收片段（约50ng/ul）

1ul酶切好的载体（约50ng/ul）

2ulligasebuffer

1ulT4ligase

10ulH2O

以上连接液在16℃过夜。

转化（感受态细胞:

DH5a）,具体步骤见附录转化部分。

抗性:

Amp;

37℃，培养过夜

转化后X基因分别平板挑菌,37℃250转/分钟摇菌14小时，PCR鉴定后，将阳性菌液送上海权阳生物技术有限公司测序。

X基因慢病毒载体单克隆菌落PCR鉴定（使用载体通用引物,PCR条带大小应比实际大200bp左右）：