转染细胞的稳定筛选方法和实验步骤Word格式.docx

转染细胞的稳定筛选方法和实验步骤Word格式.docx

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药物浓度一般确定为能使未转染细胞在7天之内全部死亡，如G418一般需要7天，而puro一般时间很短，只需要3-4天即可。

2、药物筛选注意事项

（1）药筛的时间

加药时间一般为转染后48h。

但由于慢病毒表达较慢，因此利用慢病毒感染将质粒转入细胞的方法，加药时间一般为72h

空白对照

加药筛选时，最好设置空白对照，即未转染细胞同时加药，待空白对照中细胞全部死亡，转染组中不具有抗药性的细胞基本药杀完，但还需继续加药。

（2）换液

如果加药后，细胞死亡较多，需及时换液，以防死细胞释放有害物质导致具有抗药性的细胞死亡。

另外，随着细胞的代谢，抗生素的活性会降低，因此，每隔3-5天应更换一次抗生素筛选培养液。

3、克隆筛选注意事项

若转染的质粒带有荧光标记，不管是以下哪种筛选克隆的方法，都应该选择带有荧光较强的细胞克隆，因为加药筛选时，可能会产生耐药性的细胞，因此最好选择带有荧光较强的细胞。

若是转染的质粒不带有荧光，那么只能盲挑。

不管是带有或者不带有荧光标记，都应该挑出克隆后进行验证，验证存在不成功的概率。

因此，挑克隆时，应尽量多挑几个克隆，20个左右。

4、稳定克隆筛选步骤

（1）有限稀释法步骤

a）将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可,若细胞生长很快药筛时可以在10cm的dish中进行）用胰酶消化下来

b）对消化后的细胞悬液进行计数（如果细胞数量过大，可先稀释后计数）

c）计算后，用枪头吸取约200个细胞（其中有部分为死细胞）到10ml培养液中充分混匀，剩下的大部分细胞冻存保种

d）然后将以上10ml细胞悬液加到96孔板中，每孔100ul，这样有的孔就可能只有一个细胞，过程中注意不时用枪头吹打混匀细胞悬液（一个96孔板得到的克隆可能较少，可以用同样的方法做2-3个96孔板）

e）待细胞贴壁后，逐孔在显微镜下观察，没有细胞或者多余一个细胞的孔划叉，只有一个细胞的孔划勾，以做好标记，如果只有一个细胞的孔数量太少，可将一个孔内有两个细胞的孔也划勾，但这样克隆就可能不纯。

f）等细胞长起来以后，从96孔板到24孔板，再到6孔板逐渐扩大培养

g）细胞分6孔板中养起来后，可分出部分细胞提蛋白，用western验证克隆是否为我们所需要的克隆，也可以用RT-PCR进行验证，若验证发现克隆并不是所需要的克隆，即失败的克隆，就扔掉，保留验证成功的克隆并大量培养

h）首次验证成功的克隆养两周后再次验证，若仍能保持特性，表示筛出的克隆较稳定，这样较为稳定克隆即可大量培养保种，并进行后续实验

（2）无限稀释法

a）将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可）用胰酶消化下来

c）计算后，吸出约5000个细胞，铺到10cm的dish中，摇匀

d）待细胞贴壁后，在显微镜下找到单个细胞，用马克笔在dish的底部做好标记，然后放到孵箱里培养

e）待单个细胞长成了细胞团（约10个），在显微镜下观察，如果有两个细胞团靠得很近，则用马克笔在底部做好标记，然后在安全柜内用白枪头刮掉周围舍弃的细胞团，并不断在显微镜下观察，看周围的细胞是否已经都被刮掉。

然后换培养液（将刮掉的细胞弃去）

f）放到孵箱里培养数天（细胞团较大，约一两百个），克隆在肉眼下可见

g）将培养液倒掉，用PBS洗两遍，再吸10ul的胰酶在标记好细胞团的地方不停的快速吹打约1-2min，最后将枪头里细胞悬液打到24孔板内培养即为挑出的一个克隆，此过程切记不能过长，以免dish太干导致细胞死亡

h）照7的方法每种细胞至少挑出15个克隆，培养一段时间后，消化到六孔板中培养（处理时间根据24孔板内的细胞数量而定）

i）细胞分6孔板中养起来后，可分出部分细胞提蛋白，用western验证克隆是否为我们所需要的克隆，也可以用RT-PCR进行验证，若验证发现克隆并不是所需要的克隆，即失败的克隆，就扔掉，保留验证成功的克隆并大量培养

j）首次验证成功的克隆养两周后再次验证，若仍能保持特性，表示筛出的克隆较稳定，这样较为稳定克隆即可大量培养保种，并进行后续实验