综述大肠杆菌中重组蛋白的表达进展与挑战Word格式文档下载.docx
《综述大肠杆菌中重组蛋白的表达进展与挑战Word格式文档下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《综述大肠杆菌中重组蛋白的表达进展与挑战Word格式文档下载.docx（10页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
然而，需要注意，重组蛋白的表达可能对微生物体的造成代谢压力，导致菌体扩增大幅减慢。
2.高浓度细胞培养物较容易实现。
在液体培养物中，理论的浓度估计最低大约是200g细胞干重/l或者1×
1013个活力细胞/ml.然而，细菌在复合培养基中的指数生长是的它的浓度远没有达到这个值。
在最简单的实验设置中（例如：
37℃，在LB培养基中生长），细菌最高能长到1×
1010/ml,还不到理论值的0.1%。
因此，甚至为了获得重组蛋白，我们也需要一种高浓度细胞培养的方法以促进大肠杆菌的生长。
作为一个重负荷机器的有机体，由于对其生理的深入研究，这些策略不断的出现。
3.用一些廉价的成分，可以很容易的配制富营养的复合培养基。
4DNA的转化方便而且快捷。
质粒转入大肠杆菌中甚至可以在5分钟内完成。
问题二：
选择哪一个质粒?
目前最普遍使用的质粒是复制子，启动子，选择标记，多克隆位点组合和融合蛋白以及融合蛋白切除策略多个因素组合的结果。
因此，表达载体的种类是非常多的，人们常常不知道选择哪一个才好。
想要做一个明智的决定，这些特征需要根据每个人的需要认真的评价。
复制子
基因单元如质粒能够自动的复制，都包含有复制子。
复制子是由复制起点以及相关的反式作用元件。
选择一个合适载体的一个重要的参考因素是它的拷贝数。
拷贝数是由复制子控制的。
通常人们会认为，高含量的质粒会得到更多的重组蛋白，因为细胞内存在大量的表达单位。
然而，大量的质粒会造成代谢压力，减缓细菌生长，可能会是质粒变得不稳定，因此，能有效合成蛋白的生物体减少。
所以，高拷贝质粒无论如何不会提高蛋白产量的。
通常使用的载体，例如pET系列载体，具有pMB1复制起点（ColE1衍生，每个细胞有15-60个拷贝），而在pUC系列中存在pMB1复制起点的一个突变的类型型（500-700个拷贝每个细胞）。
ColE1复制起点（15-20个拷贝/细胞）的野生型存在于pQE载体中。
这些复制起点是不兼容的，在同一个细胞内会相互竞争复制机制，所以他们不能在同一细胞内扩增。
想要利用两个质粒进行双表达，可以使用带有p15A复制起点的表达系统（pACYC和pBAD系列载体，10-20拷贝/细胞）。
三表达可以使用pSC101质粒，尽管这种情况很少。
这个质粒受到复制子的严谨性控制，因此它的拷贝数很低（<
5拷贝/细胞）。
对于某种基因或者蛋白产物过量对细胞产生有害作用这种情况，可以考虑选择具有该复制子的质粒。
可以选择的是，共表达载体通过克隆两个基因在同一个质粒上，可以简化双表达。
共表达载体拥有两个多克隆位点，每个多克隆位点都有一个T7启动子，一个lac启动子和一个核糖体结合位点。
通过使用不同的兼容的共表达载体，4个表达载体可以得到八种重组蛋白。
启动子
毫无疑问，在原核启动子研究中最主要的lac启动子。
Lac启动子是lac操纵子最主要的元件。
对此系统功能的深入了解使得lac启动子在表达载体中有了进一步的应用。
乳糖可以作为诱导剂用来产生蛋白。
然而，在直接代谢碳源如葡萄糖存在时，诱导可被抑制。
在乳糖和葡萄糖同时存在时，由lac启动子引发的表达知道所有的葡萄糖消耗之后才会可是。
在这个时候（低葡萄糖），产生了cAMP，促进lac启动子完全激活。
这种表达的正控制称为降解物阻遏作用。
相应地，在生长于lac启动子抑制性糖类的细胞中，cAMP的水平很低，这与lac启动子低表达速率相关。
葡萄糖也破坏了乳糖的吸收，因为在葡萄糖存在的情况下，乳糖透过酶是没有活性的。
为了使表达能在葡萄糖存在的情况下进行，引入了一个突变型可以降低（但不完全消除）对代谢产物调控的敏感性，lacUV5启动子。
然而，当多拷贝质粒存在时，即使没有加入诱导剂，由于lac启动子阻遏蛋白只存在于单个染色体上（大约10个分子/细胞），启动子也会不可避免的高水平表达。
本底表达的控制可以通过引入一个lacI基因的突变启动子，称为ladIQ，使LacI蛋白能表达提高十倍左右。
Lac启动子及其衍生启动子lacUV5表达相当地弱，因此对于表达重组蛋白并不是十分有用。
合成的杂交体结合了其他启动子和lac启动子的优点。
比如，tac启动子包含了trp启动子的-35区序列和lac启动子的-10区序列。
这个启动子比lacUV5启动能力强了大约10倍。
应用较多的采用lac或tac启动子启动表达的商业化质粒包括pUC系列（lacUV5启动子，thermoScientific）和pMAL系列载体（tac启动子，NEB）
采用T7启动子系统的pET载体是相当受欢迎的表达载体。
这不足为奇，因为目标蛋白通常会占到总细胞蛋白的50%以上。
在该表达系统中，目标基因克隆到一个由噬菌体T7RNA聚合酶识别的启动子后面。
这中高度活性的聚合酶应该由另外一个质粒提供或者更多的是由编码T7RNA聚合酶的前噬菌体整合到细菌基因组中,由lacUV5启动子启动。
因此，该系统可以由乳糖或者它的non-hydrolyzableanalogisopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside（IPTG）诱导。
本地表达可以有lacIQ控制也可以通过T7溶菌酶共表达控制。
T7溶菌酶结合到T7RNA聚合酶上并一致T7启动子的转录起始。
通过这种方式，如果少量的T7RNA聚合酶由于其基因的渗漏表达而产生，T7溶菌酶会有效地抑制T7启动子控制下的不本底表达。
T7溶菌酶是由一个兼容的质粒提供（pLysS或者pLysE）。
诱导之后，T7RNA酶的量超过了T7溶菌酶所能抑制的量。
“自由的”T7RNA聚合酶可以参与重组基因的转录。
在T7启动子下游插入lacO启动子，形成了杂合的T7/lacIQ启动子，构成另外一个水平的控制。
所有这三种机制（由lacIQ启动子介导的lac诱导T7RNA聚合酶基因的严谨性抑制，T7溶菌酶介导的T7RNA聚合酶的抑制和在T7启动子下游的lacO启动子）构成了避免本底表达的理想的系统。
渗漏表达的问题反映了lac启动子的负调控。
依赖于正调控的启动子应该有更低的表达水平。
pBAD载体的araPBAD就属于这种启动子。
AraC蛋白同时具有激活和抑制的作用。
当不存在阿拉伯糖诱导剂的时候，AraC通过与DNA结合抑制抑制翻译。
蛋白-DNA复合物形成一个环，有效地阻止RNA聚合酶结合到启动子上。
加入了诱导剂，AraC转变为激活模式并启动ara启动子转录。
在这种方式下，阿拉伯糖是诱导所必须的。
另外一个广泛使用的途径是在调控噬菌体启动子下游加入一个基因。
这个强的Lambda噬菌体右侧的启动子（pL）起始促细胞溶解基因表达。
这个启动子受到λcI抑制蛋白的严谨抑制，在溶原生长阶段λcI抑制蛋白结合到启动子上面。
当因为DNA损坏引发宿主的SOS应急反应时，RecA蛋白的表达被激活，反过来催化λcI的自我剪切，使pL控制的基因转录。
这个机制被用在包含pL启动子的表达载体上面。
SOS应急反应（重组蛋白表达）可以通过加入萘啶酸，一种DNA旋转酶抑制剂。
另外一个激活启动子的方式是通过将λcI基因放在另外一个启动子的下游来控制λcI的产生。
这种两阶段的控制系统已经被用于基于T7启动子/T7RNA聚合酶的载体上。
在pLEX系列载体（LifeTechnologies）中，λcI抑制基因被整合在细菌染色体中受到trp启动子的控制。
在缺少trp的情况下，这个启动子通常是打开的，λcI蛋白持续地产生。
加入trp之后，形成了trp-trpR抑制因子复合物，紧密的结合到trp启动子，阻止λcI抑制蛋白的合成。
然后在pL启动子控制下的目的蛋白的表达开始。
到此为止我们讨论的所有的启动子引发的转录都是有化学信号引发的。
也有一些系统是与物理信号反应的（比如温度或者pH）。
pL启动子是一个例子。
λcI抑制蛋白的一个突变体（λcI857）是温度敏感的，在高于37℃的时候不稳定的。
包含λcI857蛋白大肠杆菌宿主菌（整合到染色体中或者载体中）先生长在28-30℃，长到需要的浓度，然后当温度达到40-42℃蛋白表达开始诱导。
这个系统的商业价值一部分在于，在发酵过程中，通常都会产热，在培养物达到高浓度的时温度上升是很容易的。
另一方面，在温度低于15的时候，在冷诱导启动子cspA控制下的基因开始被诱导。
这个温度适于表达一些难于表达的蛋白。
pCold系列载体以pUC118为骨架（一个PUC18的衍生物），有一个cspA启动子。
在最初的论文中，30多个不同来源的重组蛋白被成功表达，重组蛋白占了总表达蛋白的20-40%。
然而，应该注意，在一些情况下，获得的目的蛋白并不可溶。
选择性标记
为了阻止不含有质粒细胞的生长，在质粒的骨架上加入了一个选择性标记。
在大肠杆菌系统中，抗性基因通常是为此目的而使用。
氨苄抗性是由bla提供，bla基因的产物是一种周质酶，可以使β-lactamringofβ-lactamantibiotics失活。
然而，当β-lactamase持续分泌时，抗生素开始降解，在几个小时之后，氨苄青霉素几乎消耗干净。
在这种情况下，在培养过程中，没有携带质粒的细胞开始增加。
尽管在实验上还没有证实，抗性基于降解的选择试剂，比如氯霉素，卡那霉素也都有这样的问题。
为此，在培养过程中Tetracycline表现高度稳定的特征，因为其抗性是基于抗性细胞抗生素的活性流出。
在大规模培养中，主要面临的问题是抗生素成本和抗生素的dissemination。
在开发无抗生素质粒系统的过程中，人们做了很多努力。
这些系统以质粒依赖这个概念为基础。
质粒依赖是当没有质粒的细胞不能生长或者存活所发生的一种现象。
例如，可以将一个关键的基因从细菌基因组中删除，然后插入质粒中。
因此，当细胞分裂后，没有质粒的细菌死亡。
根据他们功能的原则，质粒依赖系统可以分为不同的亚型：
1.基于毒素/抗毒素的系统。
2.基于代谢的系统和3.启动子抑制因子滴定系统。
虽然被证实这个有前景的技术成功的用于大规模发酵，基于质粒依赖的表达系统仍然没有广泛使用。
亲和标签
如果需要纯化可溶的有活性的重组蛋白，设计这个项目时，我们有手段做到以下方面是很有价值的：
1.在表达和纯化过程中，能够检测这个蛋白，2.有最大的可溶性，3.很容易地从细胞中纯化到这个蛋白。
表达一段氨基酸（多肽标签）或者一个大的多肽（融合标签）与目的蛋白串联形成嵌合体蛋白可以使得这些目标直接地达到。
因为很小，多肽标签与蛋白融合的时候与蛋白作用的可能行很小。
然而，在一些情况下，多肽可能对融合蛋白的三级结构或者生物活性产生负面的影响。
可以得到标签在N端或者C端的载体（当信号肽在N端时后者更加适合用于分泌表达）。
如果知道了目的蛋白的三维结果，最好检查一下哪一端包埋在蛋白内部，将标签放置在接近溶剂一端。
常用的小的多肽标签如poly-Arg，FLAG-，poly-his，c-Myc-，S-,和StrepII。
因为这些标签都有对应的商业化抗体提供，在表达实验过程中带标签的重组蛋白可以由Westernblot检测，这对于目的蛋白的表达水品不足以用SDS-PAGE检测是十分有用。
标签也可以用来进行一步纯化，因为能紧密而特异地结合标签的树脂都有提供。
例如，His标签蛋白可以用固相金属离子（Ni2+或者Co2+）亲和层析纯化。
抗FLAC亲和树脂用来纯化FLAG融合蛋白。
另一方面，非多肽融合分子伴侣作为促溶分子更加有优势。
最受欢迎的融合标签是麦芽糖结合蛋白（MBP），N-utilizationsubstanceproteinA,thioredoxin（Trx;
LaVallieetal.,1993）,glutathioneS-transferase（GST;
SmithandJohnson,1988）,ubiquitin（Baker,1996）andSUMO（Buttetal.,2005）。
除了几个假说外，这些伴侣分子的助溶机制仍不清楚。
比较而言，GST的助溶能力最差。
NusA,MBP和Trx表现出最好的助溶特征，但是他们较大的分子量可能导致对其助溶效果的错误的估计。
的确，当这些标签去除之后，目的蛋白的可溶性仍然无法预料。
因此，我们更需要一些更小的而且助溶能力强的标签。
最近，发现来自寄生肝片吸虫的8kDa的钙离子结合蛋白Fh8被发现与打的标签有同样强的助溶能力。
灵位，当标签去除之后、目的蛋白仍然表现出可溶性。
MBP和GST可以通过亲和层析来纯化融合蛋白，因为MBP与淀粉-琼脂糖结合，GST与谷胱甘肽-琼脂糖结合。
pGEX（GE）系列载体含有GST标签，pMAL（NEB）系列载体含有MBP标签。
如果在纯化过程中需要用到亲和层析，必须在含有融合分子伴侣的的蛋白上再加一个多肽标签。
MBP和GST与他们的基质是非共价结合的。
相反，HaloTag7（Promega）与基质的结合是共价的，使得这个系统快速而且有很高的专一性。
另一种不同的标签是应激标签，在合适的条件刺激下可以可逆地溶出溶液。
在重组蛋白加入β滚筒标签，在钙离子存在的条件下可以选择性地沉淀。
最终的产物具有很高的纯度，整个过程只需要几分钟。
另外一个蛋白应激纯化标签是elastin-like多肽（ELPs），它是由VPGXG序列串联组成，其中X代表Val，Ala或者Gly，比例是5：
2：
3.这些标签在某个转化温度（Tt）下可以发生可逆的相变。
当达到Tt时，ELP-融合蛋白选择性地，可逆地沉淀，可以通过离心快速的富集重组蛋白。
沉淀也可以通过调整溶液的离子强度来引发。
这些技术为亲和层析为基础的纯化方法提供了更多的选择，可以节省成本尤其是对于大规模生产。
标签去除
如果需要对重组蛋白进行结构或者生化研究，那么融合蛋白必须从重组蛋白上移除。
多肽标签也需要去除，因为他们可能会影响蛋白的结果和活性，buttheycanbeleftin
placeevenforcrystallographicstudies。
标签可以用酶法或者化学法去除。
在用酶切去除表达标签的情况下，在表达载体目的基因编码序列下游包括蛋白酶酶切位点的编码序列。
成功地用于移除多肽标签和融合分子伴侣的酶包括肠激酶，凝血酶，Xa因子和烟草花叶病毒蛋白酶。
选择蛋白酶是以专一性，成本，酶切之后残留在目的蛋白的氨基酸数量为标准。
肠激酶和凝血酶过去是很受欢迎的蛋白酶但是逐步被his标签的TEV所取代。
TEV具有更高的专一性，更容易生产，消化后只留下一个ser或者gly（甚至不会留下多余的氨基酸）。
顾名思义，化学法切割标签是用化学试剂去除融合蛋白。
化学法的优势是它们可以容易地从反应液中去除而且与蛋白裂解酶相比更廉价。
对于大规模生产重组蛋白是一个吸引人的选择。
然而，化学法反应条件苛刻，因此他们的使用很大程度上限制在从包涵体中获得的纯化的重组蛋白。
它们也会导致不必要的饿蛋白修饰。
使用最多的化学切割试剂是CNBr。
CNBr切割甲硫氨酸C端的肽键。
目的蛋白内部不能含有甲硫氨酸。
CNBr切割可以在通常的变性条件（6M盐酸胍）下进行或者70%formicacid或者trifluoroaceticacid中进行。
问题三：
选择哪一种宿主菌合适？
从文献中快速搜索合适的大肠杆菌菌种作为表达宿主，可以的到几十个可能的结果。
各有优缺点。
然而，需要注意的是许多都是在特殊情况下才回使用的特殊菌种。
在最初的选择中只有几个菌种是必要的：
BL21（DE3）和一些K-12直系的几个衍生菌种。
经过多次对Bline的不同的修饰，BL21菌种由studier在1986年提出。
几个遗传特征值得一提。
和其他母本B菌种一样，BL21是lon蛋白酶缺陷型的。
Lon蛋白酶可以降解许多外源的蛋白。
另外一个基因缺失是编码外膜蛋白酶OmpT的基因。
ompT可以降解胞外蛋白。
降解产生的氨基酸被细胞吸收。
如果表达重组蛋白，当细胞裂解后，Ompt可以消化目的蛋白，这很麻烦。
另外，对母本菌株B834进行一个hsdSB突变，可以抑制质粒的丢失，由此得到BL21菌株。
DNA甲基化和降解被阻断了。
当目的基因处于T7启动子下游，就需要T7RNA聚合酶。
在守欢迎的Bl21（DE3）菌株中，λDE3前噬菌体插入BL21的染色体中，在lacUV5启动子下游包含T7RNA聚合酶基因。
BL21（DE3）和他的衍生菌株是迄今为止使用最多的表达菌种。
K-12菌系用来表达重组蛋白也仍然有所报道。
AD494和OrigamiTM菌株是trxB（thioredoxinreductase）突变型，因此二硫键在胞质中的形成能力增强了。
Origami菌株也缺少谷胱甘肽还原酶基因。
另一个广泛使用的菌株是来自K-12系列的HMs174，一个recA突变体。
这个突变可以促进质粒的稳定。
基于大肠杆菌重组系统的质粒多聚体的形成是导致质粒不稳定的主要因素。
所有这三个菌株都有包含λDE3的衍生物，因此都可以应用T7RNA聚合酶系统。
问题4：
应该使用哪一个组合才能保证成功？
在这一点上，我们应该很清楚，当设计一个表达系统是选择是相当多的。
选择完美的组合isnotpossibleapriori，因此为了得到目的蛋白需测试多个条件。
如果一个项目需要表达两个蛋白，克隆到六个不同的表达载体中，每个载体转化入三个不同的表达菌种，那么你要做36组试验。
如果要考虑其他变量，这个数值会更高。
如果在放大之前进行微表达实验，这个试错而且耗时的pilotstudy可以变得更快。
小量的表达筛选可以在2ml管子或者96孔板中进行。
TROUBLESHOOTINGRECOMBINANTPROTEINPRODUCTION
这一部分介绍了在大肠杆菌中重组表达优化的不同策略。
即使对宿主和质粒的经过了认真的选择，我们仍然无法预料是否可以获得大量的，可溶有活性的蛋白。
不幸的是，在实现这些目标所遇到的各种困难经常会发生。
表达量很低或者没有表达
这可以被认为是最差的情况了。
当目的蛋白用很灵敏的技术也不能检测到（比如，westernblot）或者可以检测但是量非常低（低于毫克/L）。
这常常是因为异源蛋白对细胞有毒害作用。
蛋白毒性
当重组蛋白在宿主细胞中发挥了不必要和有害的功能时，蛋白毒性的问题出现了。
这些功能干扰了微生物体正常的增殖和稳态。
表现出来的特征就是生长缓慢，细胞终浓度低和死亡。
作为第一次测量，在诱导之前应该监测细胞的生长。
如果重组菌生长速率比不携带质粒的细菌生长慢，那么有两点可以解释这个现象：
基因毒性和毒性mRNA或者蛋白的本底表达。
如前所述，来自与lacI或者lacIQ基因的LacI的表达可以抑制基于lac的启动子。
对于高拷贝的质粒（>
100个拷贝/细胞），lacIQ应该克隆在表达载体上。
pQE载体利用两个lac启动子序列来提高对T5启动子的控制。
T5启动子是由大肠杆菌的RNA聚合酶识别。
因为在含有tryptone或者peptone的富营养培养基中可能会含有诱导剂乳糖，在培养基中加入0.2-1%W/V的葡萄糖可以实验对表达的严谨型控制。
另一个选择是选用以葡萄糖为碳源的defined培养基。
在基于T7启动子的启动子中，渗漏表达可以通过与来自pLysS或者pLysE质粒的T7溶菌酶共表达来避免。
采用含有严谨控制启动子的低拷贝质粒（例如araPBAD启动子）也是一个选择。
拷贝数控制的一个有趣的离子是pETcoco载体（Novagen）。
这些质粒具有两个复制起点。
oriS起点和它的控制元件，可以将pETcoco控制在每个细胞一个拷贝。
然而，TrfAreplicator激活中拷贝复制起点（oriV）而实现拷贝数的扩增（达到40拷贝/细胞）。
TrfA基因是在同一个载体上，受到araPBAD启动子控制，因此拷贝数可以由阿拉伯糖控制。
控制了本底表达之后，培养物应该是生长良好，直至诱导。
此时，如果蛋白是有毒性的，细胞生长会停滞。
在许多情况下，当达到并超过宿主容忍度，某个一个蛋白的毒性水平变得明显。
在这种情况下，表达水平可以随意控制。
使用Lemo21（DE3）菌株可以实现Tunable表达。
这个菌种与BL21（DE3）pLysS菌种相似，然而，T7溶菌酶是来自受到tunable启动子rhaPBAD控制的lysY基因。
在高浓度的L-rhamnose糖存在下，会产生更多的T7溶菌酶，细胞内会有更少的T7RNA聚合酶，会表达更少的重组蛋白。
为了确定最佳的表达条件，需要检测0-2000μML-rhamnose糖对表达的影响。
相反，当采用IPTG作为诱导剂时，不能实现剂量依赖的表达，因为IPTG可以通过Lac透过酶或者渗透非依赖多肽途径激活转运进入细胞。
而Lac透过酶的表达是异源的而且活性透过酶的数量是高度可变的，蛋白表达不会可预测地随着IPTG浓度变化。
TunerTM（DE3）菌株（Novagen）是一个BL21的衍生菌株，包含一个lac透过酶的突变（lacY），使IPTG均等地进入LacY——细胞，使诱导在一个浓度依赖，均一的水平。
同样，通过将lacOc替换野生型的启动子构建了一个大肠杆菌菌株，将lac启动子转换为一个连续的启动子。
这个修饰避免了一部分细胞的瞬时的非遗传的LacY—的表型，使诱导剂乳糖同步地进入。
第二个修饰（gal+）可以使细菌完全利用乳糖作为碳源。
有一点需要注意，tunable启动子可以被糖类诱导（乳糖，阿拉伯糖，rhamnose）。
对于araPBAD启动子，通过补充不同浓度的阿拉伯糖，目的蛋白的产量可以增加100倍。
这使人们错误地认为重组蛋白的合成水平可以随意控制。
然而，蛋白表达水平随着活性糖透过酶的多相性而改变，与LacY相似。
因此，即使蛋白终产量可以控制，每个细胞的蛋白量是高度可变的，有些可以表达大量蛋白，而有些细胞根本没有蛋白。
为了表达一些有毒性的蛋白，需要专门选择一些大肠杆菌的突变体。
在一次对提高膜蛋白生产的Bl21（DE3）的衍生菌株的筛选分离中，Miroux和Walker发现了C41（DE2）和C43（DE3）菌株。
最近发现，以前在表达重组蛋白过程中阻止细胞死亡的未明确特征的突变体存在于lacUV5启动子。
在BL21（DE3）细胞中，lacUV5启动子趋势T7R
升级会员 