教你认识干细胞Word文档下载推荐.docx

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而在某些情况下干细胞的分化并不遵循这种规律。

1999年Goodell等人分离出小鼠的肌肉干细胞，体外培养5天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞系。

这种现象被称为干细胞的横向分化（trans-differentiation）。

关于横向分化的调控机制还不清楚。

大多数观点认为干细胞的分化与微环境密切相关。

可能的机制是，干细胞进入新的微环境后，对分化信号的反应受到周围正在进行分化的细胞的影响，从而对新的微环境中的调节信号做出反应。

三、干细胞的种类

按照发育阶段，干细胞可分为：

胚胎干细胞（EmbryonicStemCell）和成体干细胞（AdultStemCell）。

1、胚胎干细胞包括ES细胞（EmbryonicStemCell）、EG细胞（EmbryonicGermCell）

2、成体干细胞包括神经干细胞（NeuralStemCe11，NSC）、血液干细胞（HematopoieticStemCell，HSC）、骨髓间充质干细胞（MesenchymalStemCell，间充质干细胞）、表皮干细胞（EPidexmisStemCell）等。

按分化潜能，干细胞可分为，全能干细胞，多能干细胞，单能干细胞。

全能干细胞：

具有形成完整个体的分化潜能，如胚胎干细胞（ES细胞）。

多能干细胞：

具有分化出多种细胞组织的潜能。

如造血干细胞、神经细胞。

单能干细胞：

只能向一种或两种密切相关的细胞类型分化。

如上皮组织基底层的干细胞，肌肉中的成肌细胞。

胚胎干细胞：

ES细胞是一种高度未分化细胞。

它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。

研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。

在未来几年，ES细胞移植和其它先进生物技术的联合应用很可能在移植医学领域引发革命性进步。

胚胎干细胞可来源于畸胎瘤细胞（EC）、桑椹球细胞（ES）、囊胚内细胞团（ES）、拟胚体细胞（ES）、生殖原基细胞（EG）等。

当受精卵分裂发育成囊胚时，将内细胞团（InnerCellMass）分离出来进行培养，在一定条件下，这些细胞可在体外“无限期”地增殖传代，同时还保持其全能性，因此被称为胚胎干细胞。

胚胎干细胞在培养条件下，若加入白血病抑制因子LIF（LeukaemiaInhlbitoryFactor），则能保持在未分化状态，若去掉LIF，胚胎干细胞迅速分化，最终产生多种细胞系，如肌肉细胞、血细胞、神经细胞或发育成“胚胎体”。

成体干细胞：

成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。

成体干细胞在其中起着关键的作用。

在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。

成体干细胞可以由下列几个方面得到：

⑴胚胎细胞——由胚胎干细胞定向分化，或移植分化而成。

⑵胚胎组织——由分离胚胎组织、细胞分离、或培养而成。

⑶成体组织——由脐血、新生儿胎盘、骨髓、外周血、骨髓间质、脂肪细胞等得到。

造血干细胞：

造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。

造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性转移性肿瘤疾病的最有效方法。

与骨髓移植和外周血干细胞移植相比，脐血干细胞移植的长处在于无来源的限制，对HLA配型要求不高，不易受病毒或肿瘤的污染。

神经干细胞：

神经干细胞的研究尚处初级阶段。

理论上讲，任何一种中枢神经疾病都可归结为神经干细胞功能的紊乱。

给帕金森氏综合症患者的脑内移植含有多巴胺生成细胞的神经细胞，可治愈部分患者的症状。

周边血干细胞：

骨髓中存有人体内最主要造血干细胞的来源,而周边血干细胞则是指借由施打白细胞生长激素（G-CSF）,将骨髓中的干细胞驱动至血液中,再经由血液分离机收集取得之干细胞.由于与骨髓干细胞极为相近,现已逐渐取代需要全身麻醉的骨髓抽取手术。

脂肪干细胞：

以往人们因塑身而抽出的脂肪,大部分都当废弃物丢掉,现经由医学专家研究证,脂肪中含有大量的间质干细胞,间质干细胞具有体外增生及多重分化的潜力,能运用于组织与器官的再生与修复。

骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,间充质干细胞）：

是干细胞家族的重要成员,来源于发育早期的中胚层和外胚层.间充质干细胞最初在骨髓中发现,因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注.如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下,可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞,连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能,可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复.骨髓间充质干细胞由于其来源广泛,易于分离培养,并且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点,越来越受到学者们的青睐,被认为是不久即将被引入临床治疗的最优干细胞。

心脏干细胞

以色列的科学家研究出了一种用干细胞做成的心脏，这是由干细胞的分裂形成的。

胎盘造血干细胞

胎盘是胎儿和母亲血液交换的场所，含有非常丰富的血液微循环。

人在母亲子宫内发育的阶段，胎盘是首先形成的器官之一。

胎盘中含有大量的早期干细胞，包括数量丰富的造血干细胞。

这些干细胞在胎盘中行使着造血的功能。

小孩出生后剥离的胎盘内所含的造血干细胞，可以分化形成各种血细胞（红细胞、白细胞、血小板等）的祖宗，注射到体内可以发挥造血功能。

胎盘亚全能干细胞

亚全能干细胞自胚胎形成的第5到7天开始出现，能分化形成200多种人体组织器官细胞，但不能形成一个完整的人体。

胎盘亚全能干细胞是来源于新生儿胎盘组织的一族亚全能干细胞，其在发育阶段与胚胎干细胞接近，具备分化形成三个胚层的组织细胞的能力，但不会形成畸胎瘤。

四、干细胞的分布范围

胚胎

胚胎干细胞（EmbryonicStemcell，ES细胞）。

胚胎干细胞当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团（InnerCellMass）的细胞即为胚胎干细胞。

胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。

早在1970年MartinEvans已从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养。

而人的胚胎干细胞的体外培养才获得成功。

进一步说，胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。

ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞（EC细胞）的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。

许多研究工作都是以小鼠ES细胞为研究对象展开的，如：

德美医学小组在成功的向试验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞。

密苏里的研究人员通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。

随着ES细胞的研究日益深入，生命科学家对人类ES细胞的了解迈入了一个新的阶段。

在98年末，两个研究小组成功的培养出人类ES细胞，保持了ES细胞分化为各种体细胞的全能性。

这样就使科学家利用人类ES细胞治疗各种疾病成为可能。

然而，人类ES细胞的研究工作引起了全世界范围内的很大争议，出于社会伦理学方面的原因，有些国家甚至明令禁止进行人类ES细胞研究。

无论从基础研究角度来讲还是从临床应用方面来看，人类ES细胞带给人类的益处远远大于在伦理方面可能造成的负面影响，因此要求展开人类ES细胞研究的呼声也一浪高似一浪。

成体

过去认为成体干细胞主要包括上皮干细胞和造血干细胞。

研究表明，以往认为不能再生的神经组织仍然包含神经干细胞，说明成体干细胞普遍存在，问题是如何寻找和分离各种组织特异性干细胞。

成体干细胞经常位于特定的微环境中。

微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体，与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。

造血

造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中、胎盘组织中。

协和医大血液学研究所的庞文新又在肌肉组织中发现了具有造血潜能的干细胞。

造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。

在临床治疗中，造血干细胞应用较早，在20世纪五十年代，临床上就开始应用骨髓移植（BMT）方法来治疗血液系统疾病。

到八十年代末，外周血干细胞移植（PBSCT）技术逐渐推广开来，绝大多数为自体外周血干细胞移植（APBSCT），在提高治疗有效率和缩短疗程方面优于常规治疗，且效果令人满意。

随着脐血干细胞移植技术的不断完善，它可能会代替APBSCT的地位，为全世界更多的血液病及恶性肿瘤的患者带来福音。

神经

神经干细胞关于神经干细胞研究起步较晚，由于分离神经干细胞所需的胎儿脑组织较难取材，加之胚胎细胞研究的争议尚未平息，神经干细胞的研究仍处于初级阶段。

理论上讲，任何一种中枢神经系统疾病都可归结为神经干细胞功能的紊乱。

脑和脊髓由于血脑屏障的存在使之在干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应，如：

给帕金森氏综合症患者的脑内移植含有多巴胺生成细胞的神经干细胞，可治愈部分患者症状。

除此之外，神经干细胞的功能还可延伸到药物检测方面，对判断药物有效性、毒性有一定的作用。

实际上，到今天为止，人们对干细胞的了解仍存在许多盲区。

2000年年初美国研究人员无意中发现在胰腺中存有干细胞；

加拿大研究人员在人、鼠、牛的视网膜中发现了始终处于“休眠状态的干细胞”；

有些科学家证实骨髓干细胞可发育成肝细胞，脑干细胞可发育成血细胞。

随着干细胞研究领域向深度和广度不断扩展，人们对干细胞的了解也将更加全面。

21世纪是生命科学的时代，也是为人类的健康长寿创造世界奇迹的时代，干细胞的应用将有广阔前景。

肌肉

成肌细胞（myoblasts）可发育分化为成肌细胞（myocytes），后者可互相融合成为多核的肌纤维，形成骨骼肌最基本的结构。

骨髓

骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,间充质干细胞）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。

骨髓间充质干细胞具有如下的优点：

一.具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为造血细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。

二.具有免疫调节功能，从而发挥免疫重建的功能。

五、干细胞的调控方法

干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。

内源性调控

干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。

另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞内调控因子的制约。

⑴细胞内蛋白对干细胞分裂的调控：

干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。

这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。

细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。

如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。

收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。

⑵转录因子的调控：

在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化的调节非常重要。

比如在胚胎干细胞的发生中，转录因子Oct4是必需的。

Oct4是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是FGF-4等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。

Oct4缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。

另外白血病抑制因子（LIF）对培养的小鼠ES细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体干细胞无作用，说明不同种属间的转录调控是不完全一致的。

又如Tcf/Lef转录因子家族对上皮干细胞的分化非常重要。

Tcf/Lef是Wnt信号通路的中间介质，当与β-Catenin形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。

外源性调控

除内源性调控外，干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响。

⑴分泌因子：

间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活。

有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们是TGFβ家族和Wnt信号通路。

比如TGF家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞的分化。

研究发现，胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多种神经元的存活和分化，还对精原细胞的再生和分化有决定作用。

GDNF缺失的小鼠表现为干细胞数量的减少，而GDNF的过度表达导致未分化的精原细胞的累积&

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。

Wnts的作用机制是通过阻止β-Catenin分解从而激活Tcf/Lef介导的转录，促进干细胞的分化。

比如在线虫卵裂球的分裂中，邻近细胞诱导的Wnt信号通路能够控制纺锤体的起始和内胚层的分化。

⑵膜蛋白介导的细胞间的相互作用：

有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。

β-Catenin就是一种介导细胞粘附连接的结构成分。

除此之外，穿膜蛋白Notch及其配体Delta或Jagged也对干细胞分化有重要影响。

在果蝇的感觉器官前体细胞，脊椎动物的胚胎及成年组织包括视网膜神经上皮、骨骼肌和血液系统中，Notch信号都起着非常重要的作用。

当Notch与其配体结合时，干细胞进行非分化性增殖；

当Notch活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞。

⑶整合素（Integrin）与细胞外基质：

整合素家族是介导干细胞与细胞外基质粘附的最主要的分子。

整合素与其配体的相互作用为干细胞的非分化增殖提供了适当的微环境。

比如当β1整合素丧失功能时，上皮干细胞逃脱了微环境的制约，分化成角质细胞。

此外细胞外基质通过调节β1整合素的表达和激活，从而影响干细胞的分布和分化方向。

六、干细胞的发展历史

干细胞的研究被认为开始于1960年代，在加拿大科学家恩尼斯特·

莫科洛克和詹姆士·

堤尔的研究之后。

1959年，美国首次报道了通过体外受精（ⅣF）动物。

60年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其来源于胚胎生殖细胞（embryonicgermcells,EG细胞），此工作确立了胚胎癌细胞（embryoniccarcinomacells,EC细胞）是一种干细胞。

1968年，Edwards和Bavister在体外获得了第一个人卵子。

70年代，EC细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。

培养的SC细胞作为胚胎发育的模型，虽然其染色体的数目属于异常。

1978年，第一个试管婴儿，LouiseBrown在英国诞生。

1981年，Evan,Kaufman和Martin从小鼠胚泡内细胞群分离出小鼠ES细胞。

他们建立了小鼠ES细胞体外培养条件。

由这些细胞产生的细胞系有正常的二倍型，像原生殖细胞一样产生三个胚层的衍生物。

将ES细胞注入上鼠，能诱导形成畸胎瘤。

1984—1988年，Anderews等人从人睾丸畸胎瘤细胞系Tera-2中产生出多能的、可鉴定的（克隆化的）细胞，称之为胚胎癌细胞（embryoniccarcinomacells,EC细胞）。

克隆的人EC细胞在视黄酸的作用下分化形成神经元样细胞和其他类型的细胞。

1989年，Pera等分离了一个人EC细胞系，此细胞系能产生出三个胚层的组织。

这些细胞是非整倍体的（比正常细胞染色体多或少），他们在体外的分化潜能是有限的。

1994年，通过体外授精和病人捐献的人胚泡处于2-原核期。

胚泡内细胞群在培养中得以保存其周边有滋养层细胞聚集，ES样细胞位于中央。

1998年美国有两个小组分别培养出了人的多能（pluripotent）干细胞：

JamesA.Thomson在Wisconsin大学领导的研究小组从人胚胎组织中培养出了干细胞株。

他们使用的方法是：

人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取innercellmass细胞，建立细胞株。

经测试这些细胞株的细胞表面marker和酶活性，证实他们就是全能干细胞。

用这种方法，每个胚胎可取得15－20干细胞用于培养。

JohnD.Gearhart在JohnsHopkins大学领导的另一个研究小组也从人胚胎组织中建立了干细胞株。

他们的方法是：

从受精后5－9周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞（primordialgermcell）。

由此培养的细胞株，证实具有全能干细胞的特征。

2000年，由Pera、Trounson和Bongso领导的新加坡和澳大利亚科学家从治疗不育症的夫妇捐赠的胚泡内细胞群中分离得到人ES细胞，这些细胞体外增殖，保持正常的核型，自发分化形成来源于三个胚层的体细胞系。

将其注入免疫缺陷小鼠错开内产生畸胎瘤。

2003，建立了人类皮肤细胞与兔子卵细胞种间融合的方法，为人胚胎干细胞研究提供了新的途径。

2004年，MassachusettsAdvancedCellTechnology报道克隆小鼠的干细胞可以通过形成细小血管的心肌细胞修复心衰小鼠的心肌损伤。

这种克隆细胞比来源于骨髓的成体干细胞修复作用更快、更有效，可以取代40%的瘢痕组织和恢复心肌功能。

这是首次显示克隆干细胞在活体动物体内修复受损组织。

2012年2月，赛莱拉“人干细胞生长因子在化妆品中的应用”获得国家重大发明专利。

2012年12月，获批成立“广东省赛莱拉-暨南干细胞研究与储存院士工作站”。

2013年05月，赛莱拉“人胎盘干细胞提取物冻干粉及其制备方法与应用”荣获国家重大发明专利。

2013年12月，人胎盘干细胞研究成果荣获全国工商联“科技进步奖·

优秀奖”。

七、干细胞的获取方法：

1、自体移植：

干细胞来自自身。

2、异体移植：

干细胞来自捐赠者。

干细胞从哪些部位获取：

七、干细胞的制取方法

分离方法

1998年美国有两个小组分别培养出了人的多能干细胞：

细胞株。

经测试这些细胞株的细胞表面marker和酶活性，证实它们就是全能干细胞。

至2014年胚胎干细胞来源主要是胚泡内细胞群和生殖嵴中的原始生殖细胞

免疫学方法：

干细胞表面有许多特殊标记，利用这些标记，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中的分离纯化干细胞。

免疫外科方法：

该方法基本原理是利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留CIM进行培养。

组织培养：

将4-6天的胚胎取出培养，滋养层在培养皿底部平铺生长，而CIM形成卵圆柱装结构，在显微镜下用玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。

显微外科学法：

利用显微镜直接将CIM从胚泡中吸出进行培养。

八、干细胞的鉴定方法

1、形态学检测：

体积小、核大、核质比高，一个或多个突起的核仁，常染色质，胞质少、结构简单。

体外培养：

细胞排列紧密，集落状生长。

碱性磷酸酶染色，细胞呈棕红色，周围成纤维细胞淡黄色。

细胞克隆与周围界限明显，细胞克隆间界限不清、形态多样，多数呈岛状或巢状。

2、碱性磷酸酶活性的检测——染色后呈深蓝紫色

3、体内分化实验：

畸胎瘤

4、体外分化实验：

囊状简单胚体或类胚体，常见多种类型细胞混杂在一起

5、核型分析法：

二倍体正常核型

6、OCT活性检测：

多能性基因标志。

OCT抗血清和间接免疫荧光法检测OCT基因表达产物。

九、干细胞储存

干细胞的储存是低温保存和储存，并且超低温贮藏方法是按照医疗行业的标准来使用的。

我们拥有符合GMP标准的洁净室和专业液氮储存库、组织配型实验室，并配备了RC-3BPPlus低速大容量冷冻离心机、LabTowerEDI15超纯水一体机、CryoExtra40液氮存储箱、7451TF程控降温仪在内的等一系列国际一流的实验室设备。

严格执行《干细胞库技术规范》，建立完善的标准操作规程，采用国际先进的方法进行干细胞的采集、制备、检测、冻存，确干细胞的质量。

干细胞保存分为两大类：

非冷冻保存和冷冻保存。

冷冻保存是将细胞冷冻保存于零下温度，冷冻过程会造成部分细胞损伤和丢失，但细胞保存时间长，应用方便，是目前主要的保存法。

冷冻保存就是将造血干细胞降温到零下某一温度，当细胞代谢停止后保存于零下温度，该方法安全可靠，并可以长时间保存干细胞。

干细胞冷冻保存分为降温、储存、融化回输三个阶段。

每个阶段都可能造成细胞的损伤和死亡，故需要注意冷冻保护，运用冷冻液以稳定细胞内外的水分子，在细胞冷冻和融化过程中减轻脱水皱缩和吸水肿胀程度，降低细胞死亡率。

造血干细胞的冷冻保存可以分为程控降温冷冻保存和非程控降温冷冻保存。

对程控降温保存的储存时间一般可以认为，干细胞如在降