蔗渣半纤维素的分级萃取和结构表征Word文档格式.doc

蔗渣半纤维素的分级萃取和结构表征Word文档格式.doc

《蔗渣半纤维素的分级萃取和结构表征Word文档格式.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蔗渣半纤维素的分级萃取和结构表征Word文档格式.doc（14页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

这些产物的形态具有很大的非均质性。

它由纤维束和其他结构部件如导管，薄壁细胞和上皮细胞组成。

（Sanjuan,Anzaldo,Vargas,Turrado,&

Patt,2001）。

从化学上来说，干残留物约有40-50%是葡萄糖聚合体纤维素，其中的大部分是晶体结构。

另外25-35%是半纤维素，一种通常由木糖，阿拉伯糖，半乳糖，葡萄糖和甘露糖组成的非晶聚合物。

其余的大多是木质素，加上少量矿物质，蜡，及其他化合物（Jacobsen&

Wyman,2002）。

农业-工业残留物在制浆过程中和其他化学品生产上的应用，一方面提供了可替代的底物，并在另一方面有利于帮助解决由残余物处理可能导致的污染问题。

在细胞壁中出现的半纤维素是杂聚糖。

木聚糖是在陆生植物细胞壁中发现的最丰富的半纤维素，它们可以占30%以上的干重（Linder,Bergman,Bodin,&

Gatenholm,2003）。

谷物秸秆中的木聚糖的特点是：

β-（1→4）-D-木糖主链，阿拉伯糖醛酸、葡萄糖醛酸及乙酰基取代可以连接在吡喃式木糖基的C-2和C-3的两个自由羟基上（puls,1997）。

举例来说，麦秸半纤维素被证实为（1→4）连接的β-D-木聚糖，它与D-吡喃式葡萄糖醛酸或（4-O-甲基-α-吡喃式葡萄糖醛酸）基团在2号位连接的，与L-阿拉伯呋喃糖和D-吡喃式木糖基团在3号位连接。

在主链上，每26个D-吡喃木糖基有一个糖醛酸单元，而每13个这样的D-吡喃木糖基有一个L-吡喃式阿拉伯糖基，且每18个这样的D-吡喃木糖基有一个D-吡喃木糖基（Sun,Lawther,&

Banks,1996）。

针叶木主要的木聚糖是阿拉伯糖基-4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖，而阔叶木中则主要是未被阿拉伯糖醛酸取代的4-O-甲基葡糖醛酸聚木糖（Sjö

strö

m,1992）。

换言之，这些糖基可直接连接到主链或连接在一个侧链（Verbruggen,Beldman,&

Voragen,1998）。

因此，由于聚-D-吡喃式木糖主链不同的聚合度，取代度，侧链数，以及侧链长度，使得聚木糖多种多样。

这种复杂和多元化的结构直接影响了半纤维素的性质（Sarbu,Goncalves,&

Pinho,2003）。

近年来，半纤维素作为化学聚合物和药物上的应用，例如生产阳离子生物大分子（Ebringerova´

Hroma´

dhova´

kacura´

kova´

&

Antal,1994），水凝胶（Gabrielli&

Gatenholm,1998;

Gabrielli,Gatenholm,Glasser,Jain,&

Kenne,2000;

Lindblad,Ranucci,&

Albertsson,2001）和长链烷基酯类衍生物（Fang,Sun,Fowler,Tommkinson,&

Hill,1999），引起了人们极大的兴趣。

然而，蔗渣半纤维素在这个领域被研究的很少。

我们实验室的目的是要使用一种环境友好的程序，发展一种大规模提取浅色谷物秸秆半纤维素组分的商业过程。

根据我们最近10年对半纤维素的研究，我们发现，碱性过氧化氢是一种脱木素和从秸秆和草脱解半纤维素都很有效的试剂。

被普遍接受的是，在碱性介质中形成的过氧氢根阴离子（HOO-），是过氧化氢漂白系统中主要的活性物质。

但是，过氧化氢在碱性条件是不稳定的，易于分解成氢氧自由基（HO·

）和超氧阴离子自由基（O2-·

）。

在有某些过渡金属如锰，铁，铜的时候是尤其是这样。

这些自由基被认为导致了木质素结构的氧化，从而导致亲水性基团（羧基）的引入，内部单元键连接的断裂以及木质素和半纤维素的最终解体（Fang,Sun,Salisbury,Fowler,&

Tomkinson,1999;

Pan,Bolton,&

Leary,1998）。

从我们实验室获得的结果发现，碱性过氧化氢是一种对脱木素及从稻草秸秆溶解半纤维素都很有效的试剂。

该过程容易操作，容易使用，且对环境友好。

本文描述了甘蔗渣半纤维素的提取分离和物化特性。

碱性过氧化氢浓度对可溶性半纤维素得率和物化性质的影响通过傅立叶变换红外光谱（FT-IR），凝胶渗透色谱（GPC），碳-13核磁共振波谱（13CNMR）进行了比较研究，结果见文中叙述。

2实验

2.1原料

蔗渣来自本地一家蔗糖厂（中国广州）。

蔗渣先在阳光下晒干，然后切割成小块（1-3厘米）。

磨好的蔗渣通过0.8毫米规格的筛子筛分。

基于干重的蔗渣的组成（%，w/w）是纤维素43.6%，半纤维素33.5%，木质素18.1%，灰分2.3%，蜡质0.8%。

2.2半纤维素提取

为了研究蔗渣中半纤维素的结构差异，半纤维素组分被连续提取分离。

干粉末（10克）首先用甲苯-乙醇（2:

1，V/V）溶液在索氏抽提器中抽提6h，然后试样被放在烘箱中，在60℃条件下烘16h。

接着，把该脱蜡蔗渣试样用300毫升蒸馏水中在55℃条件下搅拌浸泡2h。

浓缩液用4倍体积95%乙醇沉淀，得到水溶性半纤维素。

水不溶的脱蜡样品连续用300毫升0.5MNaOH，200毫升0.5，1.0，1.5，2.0和3.0%的用6MNaOH调节pH值为11.5的过氧化氢，200毫升2.0MNaOH，在55℃条件下处理2小时。

经过上述处理，不溶性残渣通过过滤收集，用蒸馏水洗涤直到滤液的pH值呈中性，然后在60℃干燥。

用6MHCl调整每个滤液的pH值到5.5，然后减压浓缩至约30毫升。

接着，通过将浓缩后的清液倒入120毫升95%乙醇，析出的半纤维素被沉淀出来。

形成的沉淀通过过滤收集，用70%酸化乙醇洗涤后风干。

从蔗渣中分馏半纤维素的流程图如图1，半纤维素的得率以初始的蔗渣干重为基准给出。

所有实验都至少重复过一次。

相对标准偏差，即由均值确定的标准偏差，小于3.8%。

2.3化学分析

经过2M三氟乙酸在120℃下水解2h，分离得到的半纤维素通过用气相色谱法测定其醛醇-醋酸盐衍生物，确定了其中的中性糖组分（Blakeney,Harris,Henry,&

Stone,1983）。

通过添加含有2%NaBH4（硼氢化钠）的5MNH3，多糖转变相应的醛醇。

浓缩在40℃下进行90分钟。

然后，过量的硼氢化钠通过加入0.1毫升冰醋酸除去。

然后，以1-甲基咪唑（0.2毫升）作为催化剂，用醋酸酐（2毫升，室温下10分钟）使其乙酰化。

用5毫升去离子水终止乙酰化，乙酰化的醛醇用二氯甲烷（1.0毫升）和水分离。

经过相分离，液体下面的部分用巴斯德吸管转移，并储存在1毫升的隔盖小瓶中置于-20℃条件下，以备后面的分析。

糖醛酸含量用自动化的间-羟基二苯比色法测定（Blumenkrantz&

Asboe-Hansen，1973）。

半纤维素分子量的测量方法在以前的一篇文献中有描述（Lawther,Sun,&

Banks,1995）。

从碱性硝基苯氧化的连接在半纤维素组分中的木质素中释放的酚酸类物质和醛类化合物的化学成分，在一个尺寸为250×

4.6平方毫米的HichromH5ODS高效液相色谱法柱（购自Phenomenex有限公司，北京）上鉴定。

通过计算机在280纳米处探测，并与已知的酚类物质比较保留时间和峰面积，考察其中的单个组分。

Klason木质素在半纤维素样品中的含量根据Tappi方法T249cm-85（Lignininwood,1994）测定。

傅立叶变换红外光谱分析在一台傅立叶变换红外光谱仪（尼科尔750）上进行，波数为32cm-1，用含有1%的试样的精细粉末的溴化钾片。

溶液状态的1H和13C核磁共振波谱是使用BrukerMSL-300波谱仪在300和74.5兆赫下获得的。

1H核磁共振波谱是将20毫克样品溶解于1.0mlD2O在25℃条件下获得的。

13C核磁共振波谱是将80毫克样品溶解于1.0mlD2O在25℃条件下在30，000扫描后获得的。

扫描时使用60°

的脉冲翻转角，3.9μs的脉冲宽度和0.85s的延迟时间。

半纤维素的热稳定性用热重分析（TGA）和差示扫描量热法（DSC），在一个同步热分析仪（NETZSCHSTA-409）上进行。

仪器持续通过氮气。

样品重在10和13毫克之间，温度以10℃/min的速度由室温升至600℃。

3结果与讨论

3.1相对得率

碱性条件下半纤维素的提取，实际上涉及到酯键连接的碱性水解，以从木质纤维素网络中释放半纤维素，然后把它们提取到水介质中。

然而，植物细胞壁中半纤维素组分的释放受到木质素网络以及木质素-半纤维素的酯键和醚键连接的存在的限制。

此外，细胞壁多糖的单元之间广泛的氢键连接可能阻碍半纤维素的分离（Ebringerova´

&

Heinze，2000）。

值得一提的是，如前所述，用碱性过氧化氢处理木质纤维材料，由碱性过氧化氢分解所产生的过氧化氢自由基和氢氧自由基不仅导致木质素的大量降解，对半纤维素溶出也具有重大意义（Fangetal.,1999）。

从表1中可以看出，脱蜡蔗渣连续经过蒸馏水，0.5MNaOH，pH值为11.5、浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0%的H2O2，以及2.0MNaOH在55℃下抽提2h，释放了4.1，12.0，3.8，1.4，2.5，1.0，0.9和4.6%的半纤维素（%初始干原料），分别相应的溶解了12.2，35.8，11.3，4.2，7.5，3.0，2.7和13.7%的原来的半纤维素。

与此同时，连续处理也溶解了0.5，9.5，2.7，0.6，1.0，0.9，0.5和0.4%的木质素（%初始干原料），分别相应的释放了2.8，

52.5，14.9，3.3，5.5，5.0，2.8，和2.2%的原木质素。

很明显，8种半纤维素组分的总得率占蔗渣细胞壁的原来的半纤维素的90.4%，这表明，随着氢氧化钠和碱性过氧化氢浓度在相应条件下从0.5%增加到3.0%，绝大多数的半纤维素被提取出来。

结果也表明，对蔗渣的这种连续提取是非常有效的，最高提取得率是用0.5MNaOH（12.0%，w/w）获得的，由以下可知：

初始用0.5MNaOH提取所释放的半纤维素占得到的半纤维素总量的35.8%，这说明半纤维素提取具有选择性。

在另一方面，2.0和3.0%的过氧化氢提取结果得率分别只有1.0和0.9%，占蔗渣中半纤维素的3.0和2.7%。

显然，部分半纤维素松散地结合在细胞壁内部，而另外大部分的半纤维素是牢牢地嵌入在细胞壁的。

由此可以推测，半纤维素这种可提取性的差异，是由于细胞壁中这些多糖的不同的功能所导致的。

3.2中性糖及糖醛酸的含量

为了表征可溶性半纤维素，8个抽提物被水解，以确定糖的成分，结果给出在表2。

水提取物（ws1）的主要单糖是木糖（55.2%），以一种阿拉伯木聚糖为特征。

来自可溶性半纤维素和分解的淀粉的葡萄糖（20.4%）是第二主要的糖成分。

此外，糖醛酸（7.0%）和鼠李糖（1.8%）含量相对较高，这说明水提取物中有少量的果胶物质。

已经知道，碱被证明是从次生细胞壁中提取大多数可得到的半纤维素非常有效的，提取过程用0.5MNaOH进行。

这种浓度提取了半纤维素总量的35.8%（AS1），且阿拉伯醛糖取代程度相对较低（木糖/阿拉伯糖（6.8:

1）的比例）。

葡萄糖（4.0%），糖醛酸（3.5%），半乳糖（1.8%），甘露糖（0.5%）和鼠李糖（0.5%）作为次要组分被检测到。

用0.5，1.0，1.5，2.0和3.0%过氧化氢连续处理提取的半纤维素，阿拉伯糖基arabino（葡糖糖基glucurono）木聚糖类型含量丰富，按照糖（含量）的顺序（从高到低）如下：

木糖（68.6%-76.6%），阿拉伯醛糖（12.8%-15.6%），葡萄糖（7.4%-13.1%），糖醛酸（3.5%–4.8%），半乳糖（1.9%-3.0%），鼠李糖（微量~1.1%），和甘露糖（微量~0.3%）。

应该指出的是，随着碱性过氧化氢浓度从0.5增加至3.0%，半纤维素提取物中葡萄糖含量增加，部分原因是在该条件下蔗渣纤维素的降解。

在我们以往的研究用碱性过氧化氢处理稻草过程中，类似的现象已报道过（Sun,Tomkinson,Ma,&

Liang,2000）。

数据显示，在类似的碱性条件，但没有过氧化氢时，对稻草作碱抽提处理，结果只有2.5%的纤维素降解。

而用碱性过氧化氢作过氧化氢浓度从0.5增加至5.0%的连续处理，导致了9.8%-17.8%的原纤维素溶解。

表2还显示，用2.0MNaOH的最后处理，导致了13.7%的原半纤维素释放。

此提取物（AS2）与0.5MNaOH提取物（AS1）有类似的糖成分，主要由木糖（85.0%）和阿拉伯糖（8.7%）组成。

根据单糖组成，这个最后的提取物主要由阿拉伯木聚糖组成。

随着提取强度从0.5增加至2.0MNaOH，两个碱提取物中的阿拉伯糖/木糖比从0.15（AS1）减少至0.10（AS2），这表明阿拉伯醛糖含量丰富的半纤维素比较容易提取。

这表明，提取物AS2中的阿拉伯木聚糖的支链化程度降低了。

而且，AS2中的糖醛酸和鼠李糖含量也下降了，这表明，含有取代程度高的侧链的木聚糖有较好的碱溶性，而且与纤维素的结合没那么紧密，相对的，侧链少的分子碱溶性不好，且与纤维素结合的更加紧密。

该结果与对烤过的绿色Arabica咖啡豆中的多糖的研究结果相一致（Oosterveld,Harmsen,Voragen,&

Schols,2003）。

作者指出，阿拉伯半乳聚糖的支链化程度随着抽提强度的增加而减少。

3.3结合木质素和其成分酚酸类物质和醛类化合物的含量

为了验证木质素和酚类物质组分的含量，对被分离的8半纤维素物质进行硝基苯氧化，从结合木质素中释放的酚酸类物质和醛类化合物在表3给出了。

显然，相对于水溶性半纤维素中的木质素含量（9.6%），其他7种用碱或碱性过氧化氢分离的半纤维素物质，结合木质素含量相对低得多（0.5%-5.1%）。

在碱或碱性过氧化氢浓度相对较高时获得的半纤维素尤其是如此。

当碱浓度从0.5增加至2.0M，过氧化氢的百分比从0.5%增加至3.0%，分别导致木质素含量由5.1减少至0.5%和3.8减少至0.8%，这表明浓度高的碱和碱性过氧化氢处理，对蔗渣中木素和半纤维素之间α-酯键的断裂有更积极的作用。

这再次表明了，连续的碱和碱性过氧化氢处理是一种有效的提取具有相对较低含量的结合木质素的半纤维素的方法。

碱性硝基苯氧化的主要产物，被确定为香兰素和紫丁香醛，它们分别占总的酚酸类物质和醛类化合物的30.7-52.2%和26.1-43.8%。

这表明，在半纤维素提取物中的结合木质素含有大致相等数量的非浓缩guaiacyl和syringyl单元（non-condensedguaiacylandsyringylunits）。

大量的对羟基苯甲醛和乙酰丁香酮，及微量对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、乙酰香兰酮、阿魏酸，和对香豆酸亦被发现在出现在硝基苯氧化混合物中。

蔗渣细胞壁中存在阿魏酸和对-香豆酸酸，这早在对木质素半纤维素复合体中含有羟基桂皮酸的研究时，就已由Kato,Azuma,andKoshijima（1987）报道过。

作者已证明，阿魏酸和对香豆酸与蔗渣细胞壁的半纤维素和木质素分别酯化。

进一步研究发现，蔗渣半纤维素中阿魏酸的结点完全是O-5连接的L-阿拉伯呋喃糖基，它通过O-3连接到（1→4）-β-连接的D-木聚糖的主链（Katoetal.,1987）。

3.4分子量

最近，在研究小麦面粉阿拉伯木聚糖分子量的基础上，Dervilly-Pinel,Thibault,和Saulnier（2000）指出，水溶性阿拉伯木聚糖链是半刚性的。

此特征可让这些半纤维素在溶液中采取卷曲构象。

因此，该高分子的流体力学体积依赖于溶剂的特点。

此外，由空间排阻色谱法得出的spelts燕麦木聚糖分子量的结果表明，木聚糖分子量随着半纤维素溶液碱浓度和淋洗液的pH值增加而增加，而木聚糖和NaCl浓度则对鉴定无显着影响（Sarbuetal.,2003）。

在这项研究中，8种半纤维素物质的重均分子量（Mw）通过GPC用PLaquagel-OH50柱鉴定。

半纤维素被溶解在含有0.02NNaCl的0.005M磷酸钠缓冲液中，pH值7.5，浓度为0.1%。

洗脱液为含有0.02NNaCl的0.005M磷酸钠缓冲液，pH值7.5。

表4列出了8种半纤维提取物的重均分子量（Mw）、数均分子量（Mn）和分散系数（Mw/Mn）。

显然，相对于Mw从18,960到45,370g/mol的两种碱溶半纤维素组分和5种碱性过氧化氢半纤维素制备物，水溶性半纤维素组分的聚合度低得多，Mw为7380g/mol。

这表明，第一次用蒸馏水处理脱蜡蔗渣，在没有碱或过氧化氢情况下，溶解了小分子的半纤维素。

换句话说，这表示，碱或碱性过氧化氢提取释放的半纤维素分子量比单独使用蒸馏水要高。

如表4所示，接下来的0.5MNaOH处理优先释放了Mw值为45,370g/mol的大分子半纤维素。

有趣的是，如表4所示的数据，碱性过氧化氢浓度从0.5增加至2.0%，导致了Mw值从34,070增加至38,890g/mol，大分子的半纤维素的溶解随着过氧化氢浓度上升到2.0%而增加。

另一方面，由于过氧化氢浓度进一步增加，从2.0至3.0%，Mw显着下降，从38,890到23,340g/mol，这意味着，在用3.0%H2O2处理时，半纤维素发生了降解。

同样地，最后的2.0MNaOH处理，导致半纤维素聚合物进一步的降解，Mw值低很多，为18,960g/mol。

很显然，分子量较低的多糖比较容易提取，在温和的提取条件如水处理即释放。

此外，这些数据表明，在较高的提取强度下，例如3.0%H2O2和2.0MNaOH处理，取物的半纤维素分子量较低，这可能是由于这些多糖的降解引起的。

此外，该数据还表明，水溶性半纤维素的分子量分布更窄，相应的分散系数为1.5，相对的，碱和碱性过氧化氢可溶性半纤维素提取物有更广的摩尔质量分布，其分散系数在4.4和8.1之间。

3.5傅立叶变换红外光谱

对红外光谱数据的分析表明，所有八种半纤维素提取物的半纤维素基元都有典型的信号图像为表示，且在1200–1000cm-1区域有特征波峰。

图2给出了溶在蒸馏水（谱1）和0.5MNaOH溶液（谱2）中的半纤维素提取物的傅立叶变换红外光谱。

光谱以C–O，C-C，C–OH和C–O-c在1049cm-1处的拉伸和弯曲振动为主。

1175和1000cm-1之间的波是典型的木聚糖的波。

很明显，阿拉伯醛糖arabinosyl侧链的存在被两个在1175和990cm-1处的低强度吸收肩记录下来，它们仅连接在吡喃式木糖单元处，这个已有报道（Sun&

Tomkinson,2002）。

建议以这两个波段的强度变化来反映阿拉伯糖基取代的贡献，因此可以用来确定阿拉伯木聚糖结构。

这是因为，这个波段给出的各种各样的波谱的形状是由O-2和O-3位的枝链决定的。

有报道，随着枝链数增加，在1175-990cm-1处（波谱）强度逐渐发生减弱（Kacurakova´

Belton,Wilson,Hirsch,&

Ebringerova´

1998）。

在羰基伸展区中，除了由于水在1640cm-1处的吸收引起的信号加强，水溶性半纤维素组分的一个在1740cm-1处的小波峰（谱1）代表了多糖中的乙酰酯、糖醛酯、阿魏酯等，而0.5MNaOH可溶性半纤维素组分在波谱中没有这个信号，这表明，在一定条件下的碱处理是这些酯键从半纤维素中完全断裂。

谱1中由于C-1组振动或环振动引起的吸收肩和在903cm-1处的尖锐吸收峰，是糖单位之间β-型糖苷键连接的表征（Fangetal.,1999）。

由于-CH2的伸缩振动引起的波峰，在1467和1434cm-1处被观察到。

在1387，1334和1262cm-1处的波峰是源自C-H，OH，或-CH2的弯曲振动。

C-H的伸缩振动在2926cm-14处有信号。

在3443cm-1附近的突出峰代表了有氢键连接的半纤维素和水的羟基的伸缩振动。

在1520cm-1处，谱1中的加强信号和谱2中的吸收肩的产生，无疑是由于在半纤维素中有少量结合木质素的存在，这与碱性硝基苯氧化和klasson木素的鉴定结果相符合。

图3显示了由0.5%（谱1），1.5%（谱2）和2.0%（谱3）过氧化氢，2.0MNaOH（谱4）处理所释放的半纤维素组分的傅立叶变换红外光谱。

最明显的特征是光谱很相似，这表明了半纤维素的结构很类似。

正如预料的一样，四个谱在1720cm-1附近都没有由羰基伸展产生的信号，这表明，在一定条件下用碱性过氧化氢和碱的连续处理，没有显著地攻击或氧化半纤维素的糖苷键和羟基。

光谱中在3443，2926，1474，1434，1394，1268，1169，1096，1043，990，897cm-1处的在吸光度都与半纤维素有关。

所有光谱在1633cm-1处都有一个强烈的与水有关的吸光度。

在1514cm-1处，与木质素有关的吸光度在谱1~3中较弱，在谱4中特别的弱。

这与分离的半纤维素组分中的结合木素含量是一致的。

3.61H和13C核磁共振波谱

用0.5%H2O2分离的半纤维素的1H和13C核磁共振波谱在D2O中测定。

图4显示了用0.5%H2O2在pH值为11.5时从经过0.5MNaOH处理的甘蔗渣中分离的半纤维素的核磁共振波谱。

可以看出，谱图给出了所期望的半纤维素单元的典型的信号。

在3.0-4.2ppm处的化学位移是源于半纤维素的乙酰化无水木糖单元的赤道质子和其他质子。

少量乙酰基和4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸的甲基质子分别在1.7和1.0-0.9ppm处有弱吸收峰。

α-D-阿拉伯呋喃糖基末端产生的anomeric质子出现在5.0ppm处（Teleman,Lundqvist,Tjerneld,&

Stalbrand,2000）。

在4.6ppm

处的一个强信号是由残留的溶剂引起的（HDO）。

用0.5%过氧化氢在pH值为11.5分离的半维素提取物给出了一个复杂的的碳-13核磁共振波谱。

（图5）。

大部分的主要共振根据参考文献的数据来解释（Gabriellietal.,2000;

Imamura,Watanabe,Kuwahara,&

Koshijima,1994;

S