肽结合力与稳定性实验相关知识.doc

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课题背景知识：

CD8+T细胞免疫应答中起重要作用。

CD8+CTL（CytotoxieTlymphoeyteepitopes）对靶细胞发挥杀伤作用，必须能识别靶细胞表面与相应MHC-I类分子结合的特异性抗原表位，即CTL表位。

课题组已经根据抗原的一级结构，采用免疫信息学手段，对蛋白抗原的HLA-A＊2/HLA-A3限制性CTL表位进行了预测分析，初步筛选到表位。

通过T2细胞结合力以及稳定性试验，对初步筛选的表位进行验证，获取与HLA分子具有高结合力的表位，用于后续体外免疫活性检测。

一、T2细胞结合力实验相关文献

（一）理论知识

1什么是T2细胞?

T2细胞是内源性抗原提呈途径中必需的抗原多肽转运蛋白（TAP）缺陷的细胞株[1]，为HLA-A2阳性的T,B淋巴细胞杂交瘤细胞，可用于研究抗原递呈过程和T细胞与MHC-分子的相互识别[2]。

2为什么要做结合力试验?

MHC-I类分子与CTL表位的有效结合是特异性细胞免疫应答的一个重要环节。

因为个体内仅存在少数几个型别的MHC-I类分子，由于每个MHC-I类分子可与一系列同种类的抗原肽结合.进而形成多种多样的MHC-肽复合物，这样就使机体免疫系统可以针对众多抗原发生特异性的免疫应答。

另外，在细胞外游离肽浓度近乎为零的环境中，MHC-I类分子还必须使相应的抗原肽在细胞表面保留足够长的时间，实现特异性CD8+T细胞对它的识别。

有文献报道[1]绝大多数CTL表位以高或中等亲和力与MHC-I类分子有效结合。

3什么是T2细胞结合力实验?

由于T2其自身不能提呈抗原肽到HLA-I类分子上，所以T2细胞表面空载的HLA-A2分子表达极不稳定，表达后很快降解。

但当有外源性抗原肽与之结合后，HLA-A2的表达就被稳定。

抗原肽与HLA-A2的结合力越强，则T2细胞表面HLA-A2分子的降解就越少，表现为表达量越高。

T2表面HLA-A2分子表达量的增加直观地反映了外来抗原肽与HLA-A2的结合力[1]。

4怎么设计候选表位肽T2细胞的结合力实验?

（1）阳性对照，文献中报道的大家公认的与T2细胞有强的结合力的多肽；

（2）阴性对照，单纯的PBS；（3）背景对照，不用多肽冲击的T2细胞；（4）肽与T2细胞的结合力的判定依据：

A、浓度对比法来表示待测肽与HLA的相对亲和力（RA）。

RA=诱导HLA表达20%的待测肽的浓度/诱导HLA表达20%的阳性肽的浓度，RA值越小，肽与HLA的亲和力越强[3-4]。

B、间接免疫荧光法检测各肽与HLA-A2.1分子的结合情况。

外源性多肽与T2细胞表面MHCI类分子的结合可使其表面MHCI类分子的表达量增加，两者结合越稳固，可检测到的MHCI类分子越多，最终以平均荧光强度为检测指标，以荧光系数（FI）作为衡量指标[1-2,5]。

尽管不同的文献报道的FI的算法略有差别。

（二）具体实验方法

1Measurementofpeptiderelativeaffinity（RA）forHLAA*0201.

（1）Briefly,T2cellswereincubatedwithvariousconcentrationsofpeptides（0.1–100μM）for16hoursandthenstainedwiththemAbBB7.2toquantifythesurfaceexpressionofHLA-A*0201.Foreachpeptideconcentration,theHLA-A*0201-specificstainingwascalculatedasthepercentageofthestainingobtainedwith100μMofthereferencepeptideHIVpol589（IVGAETFYV）.TheRAisdeterminedastheratiobetweentheconcentrationofeachpeptideandtheconcentrationofthereferencepeptidethatinduces20%ofHLA-A*0201expression[4]。

（2）T2cells（3x105cells/ml）wereincubatedwithvariousconcentrationsofpeptidesrangingfrom100to0.1μMinserum-freeRPMI1640mediumsupplementedwith100ng/mlhumanβ2mat37°Cfor16h.CellswerethenwashedtwiceandstainedwiththeBB7.2mAb,followedbyFITC-conjugatedgoatanti-mouseIgmAbtoquantifytheexpressionofHLA-A*0201.Foreachpeptideconcentration,theHLA-A*0201-specificstainingwascalculatedasthepercentageofthestainingobtainedwith100μMofthereferencepeptideHIVpol589（IVGAETFYV）.Therelativeaffinity（RA）isdeterminedas:

RA=concentrationofeachpeptidethatinduces20%ofHLA-A*0201-expression/concentrationofthereferencepeptidethatinduces20%ofHLA-A*0201expression.ThedefinitiveRAvalueforeachpeptidewasdeterminedfromatleastthreeindependentexperiments[3]。

2间接免疫荧光法检测各肽与HLA-A2.1分子的结合情况

（1）首先将1x106/ml的T2细胞用冰PBS、800r/min离心6min，洗涤3次后，再与10µg/ml的候选肽37oC共孵育4h。

孵育好的细胞用冰PBS，同样离心条件洗涤3次，加入100µlBB7.2杂交瘤细胞培养上清液，冰浴40min。

PBS洗涤3次，加入100µl1:

100稀释的二抗FITC标记的羊抗鼠IgG溶液，在冰上孵育40min，洗涤后于流式细胞仪检测平均荧光强度，波长488nm。

阳性已知肽MAGE-2112-120作为阳性对照，未加肽刺激的单纯T2细胞为背景对照。

荧光系数（FI）=（样本平均荧光强度-背景平均荧光强度）/背景平均荧光强度[5]。

（2）首先将1x106个T2细胞用冰PBS,800r/min离心6min,洗涤3次后,再与10mg/ml待测肽37oC共孵育4h.孵育好的细胞用冰PBS,同样离心条件洗涤3次,加入100mLBB7.2杂交瘤细胞培养上清液,冰浴40min.PBS洗涤3次后,加入100mL稀释度为1:

100的FITC-羊抗鼠IgG溶液,在冰上孵育40min,洗涤后于流式细胞仪（FACS）检测平均荧光强度,波长488nm.以单纯的T2细胞加二抗为阴性对照,T2细胞加一二抗为背景对照。

荧光系数（FI）=（样品平均荧光强度-背景平均荧光强度）/（T2细胞荧光强度-背景荧光强度）×100[2]。

（3）首先收集T2细胞，用冰PBS洗三次后，调细胞浓度至1x106/ml，铺于96孔板中，10µl/孔。

再与50µM的候选多肽，2.5µg/ml的（β2微球蛋白于370C、5%CO2孵箱中共孵育18h。

之后，收集孵育好的细胞，用冰PBS洗三遍，加入2µlFITC标记的HLA-A2特异性的mAbBB7.2，放置4℃冰箱，孵育30min，之后PBS洗三遍，接着用流式细胞仪检测平均荧光强度。

用已经证明的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位肽SSp-1作为阳性对照，多肽OVA257-264作为阴性对照，未加肽刺激的单纯T2细胞作为背景对照。

结果判定:

以荧光系数（FI）作为衡量指标。

荧光系数（FI）=（样本平均荧光强度一背景平均荧光强度）/背景平均荧光强度。

多肽的FI>1被认为是高亲和力的表位[1]。

（4）T2cellswereincubatedfor3hinhumidified5%CO2chamberat37°Cwitheachpeptide.Anti-HLA-A2.1monoclonalantibody,BB7.2,wasaddedinsaturatingamountandincubatedfor30minat4°C.AftertwowashstepswithcoldPBS,fluoresceinisothiocyanate（FITC）-labeledF（ab）2fragmentsofgoatanti-mouseIgG

wereaddedandincubatedforanother30minat4°C.ThecellswerewashedtwicewithcoldPBSandfluorescencewasmeasuredonaFACScanflowcytometer。

Thefluorescenceindexwascalculatedbytheformula:

FI=（meanfluorescenceofsample-meanfluorescenceofbackground）/（meanfluorescenceofT2-meanfluorescenceofbackground）x100[6]。

（5）T2cellswereincubatedwith50μMofthesynthesizedpeptidesand3μg/mlofhumanβ2-microglobulininserum-freeRPMI1640mediumfor16hat37°C/5%CO2.ExpressionofHLA-A*0201onT2cellswasthendeterminedwithFACSCaliburXowcytometerbystainingwithanti–HLA-A2AbderivedfromBB7.2andFITC-labeledgoat-antimouseIgGusedasthesecondantibody.ThedatawereanalyzedusingCellQuestsoftware.TheXuorescenceindex（FI）wascalculatedasfollows:

FI=（meanFITCXuorescencewiththegivenpeptide-meanFITCXuorescencewithoutpeptide）/（meanFITCXuorescencewithoutpeptide）.Samplesweremeasuredinthreereplications.[7]

（6）我们实验室所做的T2细胞结合力试验：

待测肽（50μg/ml）加入含β2微球蛋白（3μg/ml）的无血清RPMI1640培养基中37℃共孵育18h-24h后，冷PBA洗涤3次，加100μl稀释度为1:

200的一抗（T2A2细胞加单克隆抗体BB7.2，T2A3细胞加单克隆抗体鼠抗人β2-M），4℃放置30min。

冷PBA洗涤3次后，加50μl稀释度为1：

50的FITC-羊抗鼠IgG溶液，4℃放置30min，洗涤后于流式细胞仪检测。

另外,已被鉴定的Flumatrix58-66（GILGFVFTL）和FluNP265-273（ILRGSVAHK）在该实验中分别作为T2A2和T2A3的阳性肽，PBS作为阴性对照。

结果用荧光系数（FI）表示：

荧光系数（FI）=（表位肽平均荧光强度-背景平均荧光强度）/背景平均荧光强度。

如果FI>1.5，说明候选肽与HLA-A*0201/03具有强结合力；1.5>FI>1.0：

中等结合力；FI<0.5：

弱结合力（阴性结果）[8]。

总结（上述红色部分为各文献中的差异部分）：

1在备选的两种T2细胞结合力实验方法中，优先选择第二种，即间接免疫荧光法。

因为我们实验室以前采取的也是这种方法，已经有一定的实验基础，并且实验结果也比较明显。

我认为关于低亲和力候选表位的改造可以考虑第二种方法，因为其直观性比较强。

2关于用间接免疫荧光法检测候选肽与HLA结合力的实验设计方面：

A、不同的文献报道了不同的荧光系数算法，甚至是同一个实验室同一作者的不同报道均有差别[2,5]，但大多偏向于如下算法：

荧光系数（FI）=（样本平均荧光强度一背景平均荧光强度）/背景平均荧光强度，因此，我们也采取这种算法。

B、关于荧光系数的大小与亲和力的判断（即临界值的选取），不同的文献报道的也不一样，一般最低设为1.2。

C、关于背景对照的设置，文献报道趋于一致，即未加任何肽刺激的单纯T2细胞。

3为保证结果的可靠性，每次实验必须设至少3个重复。

二、T2稳定性相关试验

根据经典免疫学理论，CD8+CTL识别的是HLA-肽复合物，机体要想最大限度地激发免疫应答的级联反应，不仅要求候选肽与HLA结合以保证CTL的识别；而且要求它们要稳定性的结合，以避免因复合物存在的时间过短而导致的无效免疫监视。

因此，从实验设计方面，稳定性实验数据必不可少。

本实验室方法：

肽/HLA-I复合物稳定性分析

待测肽（50μg/mL）加入含β2微球蛋白（3μg/mL）的无血清RPMI1640培养基中37℃共孵育18h后，冷PBA洗涤4次，洗净未结合的肽。

加入10μg/mL的BrefeldinA孵育1h，洗涤。

37℃，5%CO2孵育0、2、4、8h。

然后，冷PBA洗涤3次，加一抗（T2A2细胞加单克隆抗体BB7.2，T2A3细胞加单克隆抗体鼠抗人β2-M），4℃放置30min，冷PBA洗涤3次后，加FITC-羊抗鼠IgG溶液，4℃放置30min，洗涤后于流式细胞仪检测。

结果以DC50（即肽/HLA-I复合物的半衰期）表示。