植物组织原位杂交protocol.docx
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植物组织原位杂交protocol
植物材料的固定、包埋和制片
一、植物材料的固定和包埋
在此过程应注意避免Rnase的污染。
所使用的熔蜡管（管盖高压湿热灭菌）、烧杯、量筒
和药勺均需180C烘5小时以上。
所用蒸馏水无需用DEPC处理。
所固定的材料越小越好，尽可
能切除多余的材料。
切割后应立即固定。
取材后若不能立即固定，则应置于冰上运输。
配试剂前请计算一下所需用量，用多少配多少，节约试剂。
第一天
一、配制甲醛溶液（按300ml量为例）
1、用三角瓶配制300mlPBS缓冲液，加入1粒NaOH摇动溶化。
2、把上述溶液在微波炉中加热（通常用600W,1分钟，一般不超过60°C）。
3、在通风橱中往三角瓶中加入4%多聚甲醛（12g）、0.1%Tween-20（300ul）和0.1%Triton（300ul），然后用parafilm封口，摇匀直到完全溶解（包埋水稻时还要再加
3ml25%的戊二醛）。
4、置于冰上降至室温，用硫酸调pH至7.0（参见第三部分之“一”）。
5、把配制好的甲醛溶液分装到小瓶中，（一般用20ml的小瓶，倒满至18ml左右）。
6、分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用，或-20°C保存备用（只能冻融一次）。
二、固定材料
1、取植物新鲜材料，切至适当大小。
注意：
所固定的材料越小越好，尽可能切除无用多余的部分。
2、把切块投入装有甲醛溶液的小瓶中（此时小瓶应在冰浴中）。
注意每瓶中的切块数：
太多固定不好；太少则浪费固定液（一般切块为15X5X3mm时，每瓶中的切
块数不多于5个；固定液：
材料》20:
1）。
3、材料放入固定液后，应通过抽真空（1至数分钟，视具体情况而定：
尽可能短时间，以材料沉入固定液中为准），帮助固定液进入组织中，以达到迅速固定植物材料的目的。
抽气减压时，尽量不要使液体过分沸腾。
抽真空时，材料一般在固定液中浮起；抽完真空的材料应该沉入固定液中，有时可能要反复多次抽真空，直至材料沉没在
固定液中。
一般抽真空多于5分钟大部份材料还不沉没在固定液中的情况极少见，
如果此情况发生，建议抽真空达10分钟后，继续做步骤4。
4、抽真空后需要更换一次新鲜的固定液。
5、更换新鲜固定液后，材料在4C过夜。
注意：
甲醛有剧毒，因此药品的称取和溶液的配置必须在通风橱中进行！
多聚甲醛极易飞散;
称取时通风橱可暂不抽风；要避免将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染，如有洒落，要及时清理。
第二天|按以下序列对材料进行脱水（水为高压灭过菌的双蒸水，所用溶液预冷）。
1、0.85%NaCl
2、50%乙醇/0.85%NaCl
3、70%乙醇/0.85%NaCl
4、85%乙醇/0.85%NaCl
注：
进入50%乙醇后，材料应开始脱色。
第三天
1、95%乙醇/水4
2、100%乙醇4
3、100%乙醇（换新瓶子）4
注：
第三天起，每个脱水步骤时间可延长至
冰浴，30分钟
冰浴，5小时冰浴，5小时4C,过夜
C,5小时
C,5小时
C,过夜
天。
两次100%^醇脱水后，材料应为无色。
第四天
1、100%乙醇室温，2小时
2、50%乙醇/50%二甲苯（换新瓶子）室温，1小时
3、100%二甲苯室温，1小时
4、100%二甲苯室温，1小时
5、100%二甲苯室温，1小时
6、50%二甲苯/50%石蜡58■《，过夜（使用熔蜡台）
注：
使用二甲苯后，应在通风橱中操作，要避免让在同一实验室工作的人闻到二甲苯的味道。
第五至七天
每天换两次100%石蜡（58C）,倾倒时避免产生气泡。
注意：
在换石蜡前1-2小时，把石蜡装于干净熔蜡管内，置于熔蜡台上熔化备用。
第八天
纸盒的处理：
将折好的纸盒于氯仿（废氯仿可回收重复利用）中泡一会，再取出晾干。
包埋蜡块：
先准备一盆水放在旁边备用，再将大小合适的纸盒放在熔蜡台上（在纸盒上写明材
料的名称等有关内容），将新熔化的石蜡倾倒于此盒内，把材料放到此盒内。
用加热的镊子迅速
把材料按需要的切面及材料之间的间隔排列整齐。
用嘴吹气，使石蜡表面凝固形成一层薄膜时，
再平放入冷水中，使其尽快凝固，数秒后翻转蜡块。
约半小时后取出，置于有吸水纸的塑料框里晾干。
包埋好的蜡块放入4C冰箱中备用。
二、载玻片和盖玻片的处理
1、洗液（2%HCI+70%L醇溶液：
70ml无水乙醇+2ml浓HCI+28mlH2O浸泡过夜，流水冲洗干净，同时用戴手套的手摸洗。
2、准备3个烧杯的双蒸水、3个烧杯的95聽醇和1个烧杯的无水乙醇，将洗好的载玻片依次经过这7个烧杯，经酒精灯烧后，放在折好的锡纸上晾干，最后用锡箔纸包裹。
3、180C烘5个小时。
同时烘盖玻片。
4、待载玻片冷却，加4ul多聚-L-赖氨酸（1mg/ml）于一端。
用盖玻片（已经过180C烘5个小时处理）的一边接触液滴，进行涂片。
涂片时应观察到“虹膜”的形成。
注意：
若涂片后多聚-L-赖氨酸不形成一层水膜，则表明载玻片没有洗干净，必须重洗。
请注意标记载玻片的哪一面涂有多聚-L-赖氨酸。
5、涂片之后放入42C的烫板中干燥过夜（最短可以4小时），然后放入切片盒中，经过处理的载玻片应在一周内使用。
6、盖玻片的处理：
用丙酮处理15分钟，通风橱中晾干，用锡箔纸包裹。
180C烘5个小时。
7、最后封片用的盖玻片不需作任何处理。
使用前用擦镜纸擦净即可（主要是防尘）。
三、切片和展片
1、修块。
将包有材料的小蜡块（包含一个材料）初步修成六面体，粘在硬木块上。
用刀片将
蜡块修成梯形，在材料的周围各留2mm的石蜡即可（尽可能少留）。
2、切片。
切片的厚度为7-10um。
在解剖镜下用暗视野观察蜡带，以决定取舍。
3、展片。
将DEPC处理过的蒸馏水滴加在涂有多聚赖氨酸的载玻片上（注意分清哪一面涂有多
聚赖氨酸），将蜡带的反面（注意正反面！
）漂浮于其上放入烫板上（42C）进行展片。
蜡带完全展开后（数分钟至几十分钟不等，注意观察以免展过头，以组织不裂开为度），吸去
多余的水，用一张镜头纸轻轻压在蜡带上，然后用吸水纸吸去多余的水。
置于42C烫板上
干燥过夜。
4、制好的片子应在一星期内进行杂交。
植物组织RNA原位杂交
第二部分RNA探针的地高辛标记
一、转录模板的线性化
要转录的DNA（150-1200bp,无polyA尾）被克隆在合适转录载体的多克隆位点上，多克隆
位点的外端带有SP6T7或T3RNA多聚酶的启动子，女口pSKpKSpGEM-■和pSPT18或19。
转录反应开始之前必须将DNA模板在插入序列的一端进行酶切。
为防止转录出非目的的RNA应选用产生5'端凸出（或平端？
）的内切酶，酶切必须完全。
酶切时要同时制备正义和反义DNA模板。
1、质粒终浓度为0.1ug/ul，加入合适的内切酶及缓冲液（200ul酶切体系），在合适的温度下保温（如37C,2小时），电泳检查是否酶切完全。
酶切后可以加入等体积的水（200ul）,这样可以减少后面抽提时的损失
2、酶切后，加入等体积的酚（Tris饱和的酚pH7.8）（200ul）:
氯仿（200ul）抽提，12000转/分离心，5min，取上清夜（弃下层有机相）到EP管中。
再加等体积的氯仿（400ul）抽提，12000转/分离心，5min，取上清夜（弃下层有机相）到EP管中。
再重复一次氯仿抽提，取上清。
注意：
从氯仿抽提开始使用的容器、试剂均为RNasefree。
3、在上述水相中加入3M的醋酸钠（中和磷酸基团，有助于沉淀DNA，使终浓度达到0.3M。
约1分半以后再加入2倍冰预冷的乙醇，置冰上1小时（推荐是-20C过夜）。
4、样品取出，12000g离心，10min。
弃上清，加400ul70%乙醇，颠倒混匀后再12000rpm离心10min。
把残液吸尽后，真空干燥（约1.5min），重悬于水或1/10TE（pH8.0）溶液中使终浓度达0.5-1ug/ul（视最初的质粒浓度来决定应加TE的体积），-20C保存。
二、RNA探针的标记
下午开始做，先将Buffer，DDTATPGTPCTP和Dig-UTP化冻。
1、标记反应体系：
（室温下，以T3RNA聚合酶为例。
）
Roche反应体系
10ul水
2.5ul10xT3转录缓冲液
2.5ul5mMATP
2.5ul5mMGTP
2.5ul5mMCTP
2.5ul1mMDIG-UTP
1ulDNA线性模板（0.5-1ug，视模板浓度而定加样体积）
0.5ulRNA酶抑制剂（50u/ul）
1ulT3RNA聚合酶（20u/ul）
Total:
25ul
Promega的反应体系
4-5ul水
5ul5XT7转录缓冲液
2.5ulDDT（100mM）
2.5ul5mMATP
2.5ul5mMGTP
2.5ul5mMCTP
2.5ul1mMDIG-UTP
1-2ulDNA线性模板（0.5-1ug,视模板浓度而定加样体积）
0.5ulRNA酶抑制剂（40u/ul）
1ulT7RNA聚合酶（20u/ul）
Total:
25ul
2、37C温育2小时（此时可跑胶检测转录产物的长度，但多省略）。
3、终止转录反应：
75ul1xMS
2ultRNA（100mg/ml）（Sigma,R4251,500units,TypeXXI,Ribonucleic
acid,transfer,放在-20°C的EP管；它在万一有RNAasel的情况下，贝U可以保护转录的RNA牺牲自己去被降解；而且在沉淀的时候可以与合成的RNA共沉淀，尤其在合成的RNA量很少的情况下可以减少损失）
1ulDNA酶（无RNA酶污染的DNasel（10u/ul））
4、37C温育10分钟。
5、沉淀：
100ul3.8MNH4Ac（可增加离子浓度）
600ul乙醇（冰上预冷）
6、-20C过夜。
（或在干冰上10分钟，时间稍微长点没关系）。
7、样品取出，4C13000-15000转/分（F2402转头），离心10分钟，弃上清。
8、用200ul冰预冷的70聽醇/0.15MNaCI冲洗沉淀（H2O270ul+30ul5MNaCl+700ul乙醇）。
9、4C13000转/分，离心10分钟。
弃上清，真空干燥。
10、加入50ulDEPC水（4C溶解10min后再到下一步）。
11、加入50ul2X碳酸缓冲液（pH10.2）
12、60C水解：
模板（插入片段）长度
600-1200bp80-90
400-500bp60
200-400bp20-30
小于200bp1-5
水解时间
分钟
分钟（如Histone）
分钟（如cyclin）分钟
13、沉淀10ul10%醋酸
12ul3MNaAc（pH4.8）
312ul乙醇（冰预冷）
14、-20C，2小时。
此时打开冷井。
15、重复7-9步。
16、沉淀重悬于50u|TE（pH7.6）中，置-20C保存（加入0.5ulRNasin（20u/ul）的
RNA酶抑制剂，赵忠不加，因为他配的TE可靠，无RNaseo
三、RNA探针的检测
1、点膜（Southern用剩下的膜）：
0.5-1ul待测探针；
1ng/ul、5ng/ul、10ng/ul地高辛标记的对照RNA（Roche公司）。
2、自然吹干。
3、置于小培养皿中，用5ml地高辛缓冲液1浸湿。
（步骤3-8用三维摇床）
4、地高辛缓冲液2中30分钟。
5、用5ml地高辛缓冲液1冲洗。
&在5ml地高辛缓冲液1+1ul地高辛抗体中30分钟。
7、用5ml地高辛缓冲液1冲洗2次，每次15分钟。
8、用5ml地高辛缓冲液5稍加冲洗。
9、在地高辛缓冲液6中（5ml地高辛缓冲液5中加入7ulNBT和5ulBCIP）暗处显色10分钟以上。
第三部分
原位杂交
前一天晚上
每24张片子准备4-5升无菌水（无须DEP（处理）。
盖玻片（24-30片/30片载玻片）,25ml量筒1个、50ml量筒5个、100ml量筒1个、250ml量筒3个、500ml量筒7个，1000ml烧杯4个，250ml三角瓶4个，500ml三角瓶4个，1000ml三角瓶8个，铁药勺3把，切片篮2个，平头镊2把。
以上均需180C烘5小时。
检查储备液
准备新灭菌的枪头、1.5mL离心管。
第一天
1.早上过来后先把下午实验所需的玻璃缸洗净：
先自来水冲洗，双蒸水过一次,再用无水乙醇过一次，略晾干，最后用氯仿过一次。
然后置于通风橱中吹干备用。
2.同时准备以下12种溶液：
首先从准备多聚甲醛开始，Rnase处理之前的溶液均需用灭菌的蒸馏水配制,
Rnase处理之后即可直接使用蒸馏水。
将以下溶液倒入通风橱中的玻璃缸中：
二甲苯1和2（2X300ml二甲苯溶液）
100%乙醇1和2（2X300ml无水乙醇溶液）
100%乙醇
8.5%NaCl
水
95%乙醇
285ml
—
15ml
85%乙醇,0.85%NaCl
255ml
30ml
15ml
50%乙醇,0.85%NaCl
150ml
30ml
120ml
30%乙醇,0.85%NaCl
90ml
30ml:
180ml
0.85%NaCl
—
30ml
270ml
PBS1和2（2X300ml）10XPBS2X30ml
水2X270ml
链蛋白酶（protease）0.125mg/ml（300ml）
20X链蛋白酶缓冲液15ml
水285ml
链蛋白酶粉剂40mg
注意：
先加20X链蛋白酶缓冲液和水，37C水浴；临用前加链蛋白酶粉剂
甘氨酸0.2%（300ml）
10XPBS30ml
水264ml
甘氨酸粉剂0.6克
4%多聚甲醛（300ml）
10XPBS30ml
水270ml
多聚甲醛12克
注意：
（1）多聚甲醛有毒应在通风橱中称取配制，多聚甲醛极易飞散称取时通风橱
不要抽风，避免将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染。
（2）PBS和水加入三角瓶后，加入2-3粒NaOH摇匀加热到60C。
在通风橱中加入12克多聚甲醛，用parafilm封口摇匀直到完全溶解。
置于冰上降温，用硫酸调pH7.0。
调pH值时不要心急，20ul一次慢慢地加。
乙酸酐溶液（溶于0.1M三羟基乙基胺pH8）（现用现配）
2M三羟基乙基胺35ml（国产三乙醇胺，避光）
水665ml
乙酸酐3.6ml
注意：
此溶液现配现用，置于600ml大缸中。
大缸中先放入一个空的载片篮及转子，当盛满载玻片的载片篮放入玻璃缸、搅拌子开始搅拌时，再加入乙酸酐。
组织预处理
下午一点左右开始做。
先打开37C的水浴锅。
玻璃缸5个一排，S形排列。
切片经镜检后，装入不锈钢载片篮中（24片/篮），在通风橱中进行以下操作:
（1）二甲苯110分钟|⑴
（2）二甲苯210分钟
（6）85汇醇，0.85%NaCI30秒
（7）50汇醇，0.85%NaCI30秒
（8）30%^醇,0.85%NaCI30秒
（9）0.85%NaCI2分钟
（新鲜）
（此时将链蛋白酶加入
37C水浴中的链蛋
白酶溶液，枪头助溶）
（10）PBS12分钟|（3）
（11）链蛋白酶10（37C水浴，水解RNA上的蛋白，同时使探
针容易进入）
（12）甘氨酸2分钟|（终止链蛋白酶的反应）
（13）PBS12分钟
（14）多聚甲醛10分钟|（后固定的作用，将RNA与细胞中的蛋白交
联再一起，同时可固定蛋白酶，同时应开
始配乙酸酐溶液）
（15）PBS1
2
分钟
（16）PBS2
2
分钟
（17）乙酸酐
10
分钟
（18）PBS2
2
分钟
（19）0.85%NaCl2分钟
（消除RNA上或细胞表面的正电荷）
3、上行（）脱水，从30%L醇到100%L醇‘100%^醇1'换成新鲜的）。
注意：
对于第二篮：
⑴将原’二甲苯1'倒掉（回收），原’二甲苯2'成为新二甲苯1,新加入的二甲苯作为二甲苯1。
⑵系列乙醇可以再用。
（3）将原PBS1倒掉，原PBS2仍为PBS2新配的PBS乍为PBS1⑷玻璃缸用完后，用灭菌蒸馏水冲洗，加少量乙醇浸泡，用时吹干即可。
上行结束后，把载片篮取出，把无水乙醇吸干后用锡纸包好，留一个小口，与超净台上吹干。
先打开80C的水浴锅。
1、准备杂交缓冲液（32ul/张，可以多准备一些
10Xsalt
甲酰胺a（1
tRNA（100mg/ml）
50XDenhardt's
24张载玻片
125ul
12.5ul
87.5ul
1000ul
20XSSC
水
15ml30ml
60ml120ml
50%dextransulphate
甲酰胺b75ml150ml
9、将4张吸水纸双折，铺于盒底，加入50ml2XSSC,50甲酰胺，再于纸上盖一层保鲜膜，载玻片置于其上。
盖上盒盖，用胶带密封。
10、在50E水浴中杂交过夜。
注：
甲酰胺a"1〉----指去离子甲酰胺（MolecularBiologygrade），保存与冰箱中；甲酰胺b
（2）---国产，保存于通风橱下储藏柜。
准备冲洗缓冲液和NTE溶液，明天备用；同时清洗装乙酸酐的盒子备用。
第二天
如果在早上准备第四步地高辛缓冲液2,第三、四步可以在同一天内完成，共需12个小时。
三、冲洗
1、将一个水浴设定在37C，如果要进行抗体染色（第四步）还需要一个50C的水浴用于配置地高辛缓冲液2。
2、准备冲洗缓冲液：
（每篮需要：
1X700ml+3X300ml=1600m）l
冲洗缓冲液：
2XSSC,50%甲酰胺b
20XSSC
50ml
30ml
甲酰胺b:
250ml
150ml
水
200ml
120ml
总体积
500ml
:
300ml
3、将载玻片放回入载片篮中。
4、在800ml大塑料盒底部放入一个空载片篮，将装有载玻片的篮置于其上，加入700ml冲洗缓冲液。
在50T水浴中温育30分钟。
注意：
此时盖玻片会落下。
5、换入300ml玻璃缸，加入新鲜冲洗缓冲液，在50E水浴中温育1小时30分钟重复一次。
&在冲洗的过程中，准备NTE溶液（每篮需要：
5X300ml）
NTE溶液
1篮
2篮
5XNTE
200ml
300ml
600ml
水
800ml
1200ml
2400ml
总体积
1000ml
1500ml
3000mM
7、用NTE溶液，在37E水浴中冲洗两次，每次5分钟。
8、载片篮放入RNA酶A溶液（20ug/ml）中,37C水浴温育30分钟
RNA酶A溶液
1篮
2篮
RNASA储备液10mg/ml
0.6ml
1.2ml
NTE溶液
300ml
600ml
注意：
（1）RN酶A溶液应提前放入37C水浴中预热5分钟。
（2）加入RNA酶A以后各步：
直接使用蒸馏水仪的蒸馏水即可。
（3）加入RNA酶A之前和之后使用的玻璃缸一定要分开放置，切勿混用！
（4）加入RNA酶A之前使用的玻璃缸，每次用完后冲洗干净，加入部分100聽醇浸泡,下次使用前在通风橱中吹干即可。
9、准备如下溶液:
1XSSC
1篮
2篮
20XSSC
15ml
P30ml
水
285ml
570ml
PBS每篮需要：
2X300ml）
1篮
2篮
10XPBS
60ml
P120ml
水
540ml
1080ml
10、NTE溶液，室温冲洗两次，每次5分钟
11、冲洗缓冲液，50C水浴，温育1小时。
12、1XSSC，室温，2分钟。
13、PBS室温，5分钟。
四、抗体染色
1、于50r水浴配制地高辛缓冲液2（因为有BSA的缘故，为半透明的溶液）
2、准备如下溶液：
地高辛缓冲液1（100mMTris-Hcl,150mMNaCl）（每24片需800ml，配1升）
24片载玻片
48片载玻片
10X地高辛缓冲液1
P80ml
160ml
水
720ml
1440ml
地高辛缓冲液2（0.5%[W/V]blockingreagent）（每24片需90ml）
3盒
6盒
Blockingreagent
—0.45g
0.9g
地咼辛缓冲液1
90ml
180ml
注意：
新鲜配置，在60-70r水浴中溶解1小时，溶液仍显浑浊Blockingreagent本身有很多类似核酸的片段，可用于封闭核酸。
这一步的目的是防止非特异性的吸附。
地高辛缓冲液3（1%牛血清白蛋白[W/v],0.3%Triton[v/v]）（每24片需500ml）
3盒
6盒
牛血清白蛋白
5g
10g
地咼辛缓冲液1
500ml
1000ml
TritonX-100
1.5ml
3.0ml
注意：
当天新鲜配置这一步的目的是封闭蛋白。
地高辛缓冲液4（Anti-digoxigenin-AP1:
3000）（每24片需45ml）
3盒
6盒
Anti-digoxigenin-AP
15ul
「30ul
地高辛缓冲液3
45ml
90ml
注意：
使用前2-3分钟前再配置
地高辛缓冲液5（100mMTris-HCI,100mMNaCI,50mMMgC2,pH9.5）（每24片需180ml）
3盒
6盒
10X地高辛缓冲液5A
18ml
36ml
10X地高辛缓冲液5B
18ml
36ml
水
144ml
288ml
Buffer5A和5B均保存在室温下。
地高辛缓冲液6（每24片需75ml）
3盒
6盒
地高辛缓冲液5
75ml
150ml
NBT（100mg/ml）
112.5ul
225ul
BCIP（50mg/ml）
112.55
225ul
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