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09水处理生物学实验指导书
水处理生物学实验指导书
凌琪王莉陶勇
2011年9月
实验一显微镜的使用及微生物形态的观察
一、目的
1．学习普通光学显微镜的使用方法（本实验学习低倍镜和高倍镜的使用）。
2．通过对教学生物标本玻片或曝气池活性污泥的观察，认识微生物的形态。
二、实验器材
1．教学生物标本玻片或曝气池活性污泥。
2．显微镜、目测微尺、物测微尺、载玻片、盖玻片等。
三、实验步骤
（一）显微镜的结构和各部分的作用
图8—1所示，是微生物检验常用的显微镜，其构造分机械和光学两部分。
机械部分主要包括：
1．镜筒镜筒长度一般是160mm。
它的上端装有接目镜，下端有回转板。
回转板上一般装有3个接物镜。
2．载物台载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔。
使下面的光线可以通过。
两旁有弹簧夹，用以固定标本或载玻片。
有的载物台上装有自动推物器。
3．调节器镜筒内旁有两个螺旋，大的叫粗调节器，小的叫细调节器，用以升降镜筒。
调节接物镜与所需观察的物体之间的距离。
光学部分主要包括：
1．接目镜一般使用的显微镜具有2—3个接目镜，其上常刻有“5×”、“l0×”或“15×”等数字及符号，意即使用时可放大5倍、l0倍或15倍。
观察微生物时常用放大l0倍或15倍的接目镜。
2．接物镜接物镜装在回转板上．可分低倍镜、高倍镜和油镜3种，其相应的放大倍数常是10、40（或45）l00（或90）。
通常显微镜的放大倍数等于接物镜与接目镜放大倍数的乘积。
例如，用放大40倍的接物镜（高倍镜）与放大10倍的接目镜时所得的物象的放大倍数为40×10＝400，如果用放大15倍的接目镜则放大倍数为40×15＝600。
接目镜装在镜筒上端，在使用过程中并不经常变动，所以通常所谓的低倍镜、高倍镜或油镜的观察主要是指使用不同的接物镜而言的。
油镜的放大倍数最大（90或100）。
放大倍数这样大的镜头，焦距就很短，直径就很小，所以自标本玻片透过的光线，因介质密度（从玻片至空气，再进入油镜）不同，有些光线因折射或全反射，就不能进入境头，致使射入的光线较少，物象显现不清。
所以为了不使通过的光线有所损失，须在油镜与玻片中间加入和玻璃折射率（n=1.52）相仿的镜油（香柏油，n=1.515）。
因为这种接物镜使用时须加镜油，所以我们称它为油镜（图8—2）。
一般的低倍镜或高倍镜使用时不加油，所以也称干镜。
使用低倍镜和高倍镜时，一般作活体的观察，不进行染色。
在观察细小动物时，低倍镜主要用来区别动物的种类和看出它们的活动状态，而高倍镜则可看清动物的结构待征，低倍镜容易看到标本的全貌，油镜在大多数情况下是用来观察染色的涂片。
3．集光器集光器在载物台的下面，用来集合由反光镜反射来的光线。
集光器可以上下调整，中央装有光圈，用以调节光线的强弱。
当光线过强时，应缩小光圈或把集光器向下移动。
4．反光镜反光镜装在显微镜的最下方至集光器。
（二）显微镜使用和保护的方法
1．低倍镜的使用法
（1）置显微镜于固定的桌几上，窗外不宜有障碍视线之物。
（2）拨动回转板，把低倍镜移到镜筒正下方，和镜筒连接而对直。
（3）拨动反光镜向着光线的来源处。
同时用眼对准接目镜（选用适当放大倍数的接目镜）仔细观察，使视野完全成为白色，这是光线已经通到镜里的表示。
（4）把载玻片放到载物台上，要观察的标本放到圆孔的正中央。
（5）将粗调节器向下旋转，同时眼睛注视接物镜，以防接物镜和载玻片相碰。
当接目镜的尖端距载玻片约0.5cm时停止旋转。
（6）把粗调节器向上旋转，同时左眼向接目镜里观察。
如标本显出，但不十分清楚，可用细调节器调节，至标本完全清晰为止。
（7）假如因旋转粗调节器太快，致使超过焦点，标本不能出现时，不应在眼睛注视接目镜的同时向下旋转粗调节器，必须从第（5）步做起，以防因没有把握的旋转，使接目镜与载玻片碰触。
（8）在观察时，最好两眼都能同时睁开一面看一面画出所看到的物象。
2．高倍镜的使用法
（1）使用高倍镜以前，先用低倍镜检查，把要观察的标本放到视野正中。
（2）拨动回转板使高倍和低倍两镜头互相对换。
当高倍镜移动到载玻片时，往往镜头十分靠近载玻片。
这时必须注意是否因高倍镜靠近的缘故而使载玻片也随着移动。
如果载玻片有移动的现象，则应立刻停止推动回转板，把高倍镜退回原处，再按照使用低倍镜的方法，校正标本的位置，然后旋动调节器，使镜筒稍微向上，再对换高倍镜头。
（3）当高倍镜已被推到镜筒下面时，向镜内观察所显现的标本，往往不很清楚，这时可旋转细调节器，上下移动，但不要过分移动。
3．油镜的使用法（此节在实验三中学习）
（1）如用高倍镜放大，倍数还不够，则须采用油镜。
用油镜以前，先用高倍镜检查，把要观察的标本放到视野正中。
（2）用油镜时，在载玻片上加一滴镜油，然后拨动回转板对换高倍镜和油镜，使油镜头尖端和油接触，而后向接目镜观察。
假如不清晰，可稍微转动调节器，但切记不要用粗调节器。
（3）用过油镜后，必须用擦镜纸或软绸将载玻片和油镜所粘着的油拭净。
必要时，可略蘸二甲苯少许，揩拭镜头，最后用擦镜纸或软绸擦干。
4．显微镜的保护法
（1）显微镜应放置在干燥的地方，使用时须避免强烈的日光照射。
（2）接物镜或接目镜不清洁时，应当用擦镜纸或软绸揩擦。
（3）用完显微镜后，应当立即放到镜匣中。
（三）显微镜观察
（1）低倍镜观察
1）在选定的接目镜下，利用低倍镜，确定目测微尺一格的长度（单位以µm计）。
2）观察教学生物标本玻片或所制备的微生物标本玻片，画出所见的形态草图。
3）记下观察所用接目镜和接物镜的放大倍数和算出显微镜的放大倍数。
（2）高倍镜观察
1）改用高倍镜观察，画出微生物的形态草图，并与用低倍镜所看到的比较，注意其不同点。
2）记下显微镜的放大倍数。
四、记录
序号
玻片名称
放大倍数
形态草图
五、思考题
1．使用显微镜时，哪些地方须特别注意?
2．使用低倍镑时，显微镜的放大倍数一般最大可达多少?
使用高倍镜时显微镜的放大倍数是怎样呢?
在什么时候才需要使用油镜?
实验二微型动物的计数
一、目的
显微镜观察活性污泥样品中微型动物的种类、数量及状态。
二、实验器材
1．活性污泥法曝气池混合液。
2．显微镜、小量筒、滴管等。
3．计数板如果没有微型动物计数的计数板（微型动物，即使是原生动物，也比细菌大得多，—般的细菌或血球计数板都不适用），则可按照上海织袜四厂和上海师范大学生物系所介绍的微型动物计数板制作方法制备如下：
采用厚质玻璃割成9cm长，4cm宽的长方块，玻璃厚度以0.3一0.4cm为宜。
利用氢氟酸腐蚀法，使玻板中央刻上10×l0＝100个小方格，小方格的大小没有严格规定，只要一片大号盖玻片能盖满格子有余和便于在显微镜下计数就可以了。
用大号盖玻片切成宽约0.7cm的玻条，用阿拉伯树胶粘在计数用的小方格的四周，使呈一圈凸起的边框。
这样，就制成了一块微型动物计数板，如图8—5所示。
关于氢氟酸腐蚀法划方格的方法是先将玻璃表面涂一层薄面均匀的石蜡，然后用尖针在石蜡层上刻出所要求的方格，再以氢氟酸蒸汽进行重蒸。
三、计数方法及步骤
1．将活性污泥法曝气池混合液轻轻搅拌均匀；如混合液较浓，则可稀释成1：
1的液体（稀释方法：
取l0mL量筒一个，加混合液5mL再加蒸馏水5mL，轻轻搅拌均匀，即成1：
1稀释液）。
2．取洗净的滴管一支（滴管每滴水的体积应预先标定，一般每一滴水的体积约为l／20mL），吸取摇匀的混合液或己稀释的混合液加一滴到计数板的中央方格内，然后加上一块洁净的大号盖玻片，使玻片的四周正好搁在计数板四周凸起的边框上，侧视如图8—6所示。
3．用低倍显微镜进行计数注意所滴加的液体不一定布满整个l00格小方格，在显微镜下计数时只要把充有液体的小方格，挨着次序一行行的计算即可。
同时记录各种动物的活动能力、形态结构等。
原生动物中有不少种类是群体，须将群体和群体上的个体分别计数。
4．计算设在一滴水中测得钟虫30只，则每mL混合液中含有钟虫30×2×20＝1200只，如测得轮虫10只，则每毫升混合液含轮虫10×2×20＝400只（如滴管每一摘体积为1／20mL，所观察的液体是1：
l稀释的曝气池混合液）。
四、记录
微型动物
优势种（数量及状态）描述：
其他种（种类、数量及状态）描述：
注：
（1）如无计数板，则可用下法进行计数：
1）取洗净的滴管1支（其每一滴水的体积应预先标定）吸取混合均匀的曝气池混合液或已稀释的混合液，滴1滴在载玻片的中央，以盖玻片（以方形为好）轻轻盖上水滴，要避免盖玻片内形成气泡。
2）将际本放在显微镜低倍镜下计数。
计数时，先将视野放在盖玻片的右上角（可根据各人的习惯，也可放在另一用），然后移动玻片，视野即可随之从上而下、从左而右通过。
当前一个视野数完，并做好记录后，再换第二个视野，如此住复将整个盖玻片下面的动物全部计数完毕。
注意在调换视野时，不可使相邦的视野重叠或遗漏。
然后换算成1mL混合液中的动物数。
3）生物滤池和生物转盘上的生物膜形成胶状，浓度大，一般都必须稀释后计数，其适当的稀释比可在实践中摸索。
4）上述计数方法仅适用于原生动物和轮虫，对个体较大的微型动物和线虫等，则须加大计数容量，以免造成误差。
（2）为了避免微生物游动而影响计数，可用接种环加一环氯化汞（HgCl2）饱和溶液以杀死微生物。
五、思考题
怎样通过了解微型动物种类或数量变化来反映废水处理情况？
实验三大肠杆菌生长曲线的测定
一、实验器材
1．培养基及大肠菌液
（1）营养琼脂斜面培养基可根据实验五中的配方，配置营养琼脂培养基后，再制成斜面。
（2）肉膏蛋白胨液体培养基配制方法同实验五中营养琼脂培养基，但不加琼脂。
（3）浓肉膏蛋白胨液体培养基配制方法同肉膏蛋白胨液体培养基，但浓度高5倍。
（4）大肠杆菌培养液将大肠杆菌接种于营养琼脂斜面培养基上，在37℃下培养18小时后，用无菌水加在斜面上，将菌洗下，作成一定浓度的细菌悬液，直接供实验接种用。
或吸取0.3mL细菌悬液，接种到装有20mL肉膏蛋白胨液体培养基的大试管（20×220mm）内，在37℃下，振荡培养18h。
2．吸管、烧杯等。
3．光电比色计、高压蒸汽灭菌器、电冰箱、振荡器或摇床等。
二、实验内容
1．实验处理以一定浓度的细菌悬液，分别等量地接种在12支液体培养基中，在培养后隔不同时间取出，放入冰箱保存。
最后，用比浊法测定菌体生长情况。
测量微生物生长的方法有多种。
活菌数可用平板计数（菌落计数）法或稀释计数法。
总菌数（包括活菌和死菌的个数）可在显微镜下直接计数而求得，由于细菌悬液的浓度与其浑浊度成正比，因此也可利用光电比色计测定细菌悬液的光密度，从而推知菌液的浓度，本实验就是利用光电比色计进行量测（用平板计数法或稀释计数法可测出活菌数，从而得出不包括死菌的生长曲线。
若教学时间和设备条件容许，宜采用平板计数法或稀释计数法）。
为阐明生长曲线形成的原因，做3个实验处理：
（1）正常生长曲线；
（2）追加营养液处理；（3）加酸处理。
2．实验步骤
（1）接种取12支装有灭菌过的肉膏蛋白胨液体培养基试管（每管装20mL培养基），贴上标签（注明菌名、培养时间等）。
然后，用1支1mL无菌吸管，每次准确地吸取0.2mL培养18h的大肠杆菌培养液，接种到肉膏蛋白胨液体培养基内。
接种后，轻轻摇荡，使菌体均匀分布。
（2）培养将接种后的12支液体培养基，置于振荡器或摇床上。
37℃振荡培养。
其中9支，分别在培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14h后取出，放冰箱中储存，最后一起比浊测定。
酸处理的1支试管，在培养4h后取出，加1mL无菌酸溶液（甲酸：
乙酸：
乳酸＝3：
1：
1的体积比），然后继续振荡培养，在培养14h后取出，放入冰箱贮存。
最后一起比浊测定。
追加营养的两支试管，在培养6h后取出，各加入无菌浓肉膏蛋白胨液体培养基1mL，然后继续振荡培养，在培养8、14h后取出，放入冰箱贮存，最后一起比浊测定。
（3）比色、过比浊把培养不同时间而形成不同浓度的细菌培养液，置于分光光度计中进行比色。
用光密度值的大小来代表细菌的生长量。
以未接种的肉膏蛋白胨液体培养基为空白对照，在600nm波长下测菌悬液的光密度值（OD600）。
菌悬液的浓度与光密度值成正比，光密度值大者可以认为其生长情况较好。
从最稀浓度的细菌悬液开始，依次测定。
细菌悬液如果太浓，应适当稀释，使光密度降至0.0—0.4范围内。
液体的浑浊度也可用浊度计测定。
三、记录及报告要求
1．记录培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14h之后细菌悬液的光密度值，以及4h加酸和6h追加营养液后，这三管菌液在所要求的培养时间时的光密度值。
2．以细菌悬液光密度为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出大肠杆菌正常、加酸和追加营养的3条生长曲线，并加以比较，标出正常生长曲线中对数期的大致位置。
四、思考题
1．常用的测定做生物生长的方法有哪几种?
试略加讨论。
2．利用浑浊度所表示的细菌生长量是否包括死细菌?
3．你认为活性污泥的增长曲线应怎样测定才比较合适?
实验四细菌、霉菌、酵母菌、放线菌形态的观察
一、目的
1．进一步掌握显微镜的使用方法。
2．观察几个典型细菌的形态（示范片）。
3．观察几个典型细菌的构造（示范片）。
4．观察霉菌、酵母菌、放线菌的形态和构造，以便找出它们之间及与细菌之间的区别点。
二、实验器材
1．显微镜、擦镜纸、镜油（香柏油）、二甲苯等。
2．示范片
（1）金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、四联球菌、尿八联球菌、链球菌、球衣细菌、大肠杆菌、霍乱弧菌等。
（2）枯草杆菌芽孢、假单胞杆菌鞭毛、固氮菌荚膜等。
（3）酵母菌、霉菌、放线菌。
三、实验内容和方法
1．复习显微镜的使用方法，重点放在油镜的使用部分。
2．严格按照显微镜的使用方法，依次逐个观察细菌的形态、构造及酵母菌、霉菌、放线菌的形态。
分别绘出其形态、构造图。
四、记录（细菌、霉菌、酵母菌、放线菌各一）
序号
玻片名称
放大倍数
形态草图
实验五培养基的制备及灭菌
本次实验可为下次实验作准备。
实验内容主要包括玻璃器皿的洗刷、包装和培养基的制备以及灭菌技术等。
在进行微生物学实验时，所用培养基及玻璃器皿等均须进行灭菌。
一、目的
1．学会玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。
2．掌握培养基配制和无菌水制备的方法。
3．学会高压蒸汽灭菌技术。
二、实验器材
1．培养皿（又称平皿，直径90mm）、试管、吸管、锥形瓶、烧杯等。
2．纱布、棉花、报纸、牛皮纸。
3．pH试纸6—8.4（或pH电位计或氢离子浓度比色计）、洗液、10％HCL、10％NaOH。
4．牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水。
5．高压蒸气灭菌器、烘箱、冰箱、电炉等。
三、实验内容
（一）玻璃器皿的洗刷与包装
1．洗刷玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。
培养皿、试管、锥形瓶等可先用去污粉或肥皂洗刷，然后用自来水冲洗。
吸管则先用洗液浸泡、再用水冲洗。
洗刷干净的玻璃器皿应放在烘箱中烘干。
2．包装
（1）培养皿由一底一盖组成一套，按实验所需的套数一起用牛皮纸包装。
（2）吸管应在吸端用铁丝塞入少许棉花，构成1一1.5cm长的棉塞，以防止细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内。
棉花要塞得松紧适宜，吸时既能通气，又不致使棉花滑入管内。
将塞好棉花的吸管的尖端，放在4—5cm宽的长纸条的一端，吸管与纸条约成45°交角，折叠包装纸包住尖端（图8—8），用左手将吸管压紧，在桌面上向前搓转，纸条即螺旋式地包在管子外面，余下纸头折叠打结，按照实验需要，可单支包装或多支包装，以备灭菌。
培养皿和吸管也有放在特制容器内进行灭菌的。
（3）试管和锥形瓶等的管口或瓶口均需用棉花塞堵塞。
做好的棉塞，四周应紧贴管壁和瓶口，不留缝隙，以防空气中微生物会沿棉塞皱折浸入。
棉塞不宜过松或过紧，以手提棉塞，管、瓶不掉下为准。
棉塞的2／3应在管内或瓶口内，上端露出少许，以便拔塞。
棉塞的大小及形状应如图8—9所示。
在制作培养基的过程中，如不慎将棉塞沾上培养基时，应用清洁棉花重做。
待灭菌的试管和瓶子的口都要用牛皮纸包裹，并用线绳捆扎后存放在铁丝篓内（用纸包裹是为了避免灭菌时冷凝水淋湿棉塞），以备灭菌。
（二）培养基的制备
1．步骤
（1）配制溶液按培养基的配方，称取各种原料。
取适量的烧杯盛所需水量，依次将各种原料加入、溶解。
难溶的原料如蛋白陈、肉膏、琼脂等需加热溶解，这时，当原料全部溶解后应加水补充因蒸发损失的水量。
加热时应不断搅拌以防原料在杯底烧焦。
（2）调整pH值用pH试纸（或pH电位计或氢离子浓度比色计）测定培养基溶液的pH值。
（3）过滤用沙布、滤纸或棉花过滤均可。
如培养基内杂质很少，可省略过滤。
（4）分装将培养基分装在试管和锥形瓶内。
要使培养基直接流入管内或瓶内，注意防止沾污上段管壁或瓶壁，并避免浸湿棉塞。
装入试管或锥形瓶的培养基量，视试管或瓶子的大小及需要而定。
一般制备斜面培养基时，每支试管装入的量约为试管高度的1／4—1／3。
（5）斜面培养基的制作将装含有琼脂的培养基的试管经灭菌后，趁热搁置在木条或木棒上，使试管呈适当的斜度（切勿倾斜过小，以免培养基沾污棉塞）。
待培养基凝固后，即成斜面（图7—3）。
2．营养琼脂培养基（肉膏、蛋白陈、琼脂培养基）营养琼脂培养基是一种固体培养基，本实验制备后可供活性污泥纯种分离和细菌总数测定之用。
（1）成分
蛋白陈2.5g
牛肉膏0.75g
氯化钠1.25g
琼脂2.5—5g
蒸馏水250mL
（2）制法
1）将上列成分混合后，煮沸至琼脂完全溶解。
2）用蒸馏水补充因蒸发而损失的水量。
3）调整溶液的pH值为7.4—7.6。
4）乘热用纱布或脱脂棉过滤（最好用保温漏斗），并分装于试管中，每管约装10—15mL。
如装在锥形瓶中，则250mL的锥形瓶，以装100mL左右为宜。
管口或瓶口均以棉花塞住。
5）置高压蒸汽灭菌器中，以121℃（1kg／cm2）灭菌20min，然后贮存于冷暗处备用。
（三）无菌水的制备
在试管或瓶内先盛以适量的自来水（不用蒸馏水，管口或瓶口用塞子塞好，并用牛皮纸扎紧），使其灭菌后，其水量恰为9mL（用管）或99mL（用瓶）。
此种适量的水体积可在灭菌器内由实验求得。
也可以先将管或瓶灭菌，再用灭菌的吸管（所谓无菌吸管）取灭菌的自来水9mL或99mL加入管或瓶中。
无菌水常用来稀释水样。
（四）高压蒸汽灭菌
上面所准备好的一切玻璃器皿、培养基等均需进行灭菌。
本实验用高压蒸汽灭菌器灭菌，其操作和注意事项如下：
1．加水热源为煤气灯或电炉者，需先加水至器内底层隔板以下1／3处。
有加水口的，水由加水口加入，由玻璃管看水位至止水线即停止加水。
若热源为蒸汽，则不必加水。
2．把需要灭菌的器物放入灭菌器内，关严灭菌器盖，勿使漏气。
3．打开出气口。
4．点火。
如热源为蒸汽，则应慢慢打开蒸汽进口，不要让蒸汽过猛地冲入灭菌器内。
5．器内水沸腾以后，蒸汽逐渐驱除器内原有的冷空气。
如灭菌器装有温度计，当指针指到读数100℃时，证明器内已经充满蒸汽、可以关闭出气口。
如没有温度计，则当出气口排出的蒸汽相当猛烈时，可以认为灭菌器内冷空气已经全部被蒸汽驱尽，可以关闭出气口。
这一点应持别注意，因为如果冷空气没有排尽，器内虽然达到了一定的压力，但并不会达到相应所需的温度。
6．关闭出气口后，器内蒸汽将不断增多，压力和温度随着升高。
当蒸汽压达到所需的压力时，即为灭菌开始时间，这时要调节火力大小，以维持所需的压力。
灭菌时间的长短由灭菌物品决定。
玻璃器皿、无菌水、营养琼脂培养基可用1kg／cm2（121℃）的压力灭菌20min，合糖的培养基用0.7kg／cm2（115℃）的压力20min。
7．灭菌时间到达后，停止加热。
8．待压力指针降到“0”时，打开出气口。
如过早打开，管内和瓶内的培养基会因压力骤降，而温度并不同时很快下降，以致培养基翻腾，沾污锦塞。
9．揭开器盖，取出灭菌的物品，将器内剩余的水放掉。
10．待已灭菌的物品冷却后，置阴凉处。
本实验，除学习培养基制备和高压灭菌法外，还要为下次实验作好难备。
所以所用培养皿、吸管、试管、锥形瓶、烧杯等玻璃器皿以及无菌水、培养基等的量均须根据下次实验所需准备。
四、思考题
1．培养基是根据什么原理配制的?
营养琼脂培养基中的成分各起什么作用?
2．为什么湿热灭菌比干热灭菌优越?
实验六微生物的染色
一、目的
学习微生物涂片染色的操作技术、掌握微生物的革兰氏染色法。
二、实验器材
1．菌种（由实验室提供）。
2．显微镜、载玻片、接种环、酒精灯等。
3．染料
革兰氏染色剂
1）草酸铵结晶紫染色液
甲液结晶紫2.5g
95％酒精25mL
乙液草酸铵1g
蒸馏水100mL
混合甲、乙两液即成。
2）碘液
碘1g
碘化钾2g
蒸馏水300mL
先将碘化钾溶解在一小部分水中，再将碘溶解在碘化钾溶液中，然后加入其余的水即成。
3）沙黄染色液
沙黄（蕃红）2.5g
95％酒精100ml
取上述配好的沙黄酒精溶液10mL与90mL蒸溜水混匀，即成沙黄稀释液，作革兰氏染色用。
三、操作方法及步骤
革兰氏染色
1．将实验所供菌种按单染色法作涂片、干燥并固定。
2．在涂面上，加草酸铵结晶紫染色液一滴约1min后，水洗。
3．加碘液1min后，水洗。
4．斜置载玻片于一烧杯之上，滴加95％酒精脱色，并轻轻摇动玻片，至流出的酒精不现紫色时立即停止滴加（约滴加0.5—1min），随即水洗。
为了节约酒精，也可将酒精滴至涂片上，静置0.5—1min后水洗。
酒精脱色程度必须严加掌握。
如脱色过度，则阳性菌会被误染为阴性菌，而脱色不够时，阴性菌将被误染为阳性菌。
5．加沙黄复染液0.5min，水洗。
6．吸干，置于油镜下观察，阳性者为紫色，阴性者为红色。
四、思考题
1．微生物的染色原理是什么?
2．你用革兰氏染色法染色后看到的细菌是什么颜色，属于革兰氏阴性还是阳性?
革兰氏染色法在微生物学中有何重要意义?
3．革兰氏染色法中若只做1—4的步骤而不用沙黄复染液复染，是否能分出革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，为什么?
4．微生物经固定后，是死了呢还是仍活着?
实验七微生物纯种分离、培养及接种技术
本实验的对象是水样或活性污泥中微生物的纯种分离和培养。
通常，在处理不同水质的废水时，起作用的微生物群和种类也不同。
我们除可用显微镜直接观察微生物形态，大致了解其中的微生物种群外，更重要的还必须研究是哪些种类的微生物对该种废水起生物氧化作用，其作用原理是什么，产生什么产物等等，以便提高处理效果。
此外，有时我们还需从土壤环境中分离和培养纯菌种来处理工业废水。
因此，为了从事以上这些研究工作，就必须学习微生物纯种分离、培养及接种的技术，进而再学会做微生物生理生化反应的实验，为废水处理服务。
在给水处理的细菌检查中，细菌的分离、培养和接种也是一个重要环节。
微生物纯种分离的方法有两种：
稀释平板法和平板划线法。
在本实验中仍要学习这两种方法。
一、目的要求
掌握几种常用的分离纯化物的基本操作技术。
二、基本原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
平板分离法：
该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其包括两个方面：
1．选择适合于待分离微生物的生
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