研究生实验讲义.docx
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研究生实验讲义
《现代分析测试技术》
实验讲义
山东轻工业学院分析测试中心
2009-3-24
实验一红外光谱法测定苯乙酸、丁二醇
一、实验目的
1、了解红外光谱仪的结构、工作原理，熟悉红外光谱仪的使用方法。
2、掌握KBr压片法和液膜法制备样品的方法。
3、了解苯乙酸、丁二醇的红外光谱特征，通过实践掌握有机化合物的红外光谱鉴定方法。
二、实验原理
红外光谱是由于分子振动能级的跃迁（同时伴随转动能级跃迁）而产生的。
物质能吸收电磁辐射应满足两个条件，即：
（1）辐射应具有刚好能满足物质跃迁时所需的能量，
（2）辐射与物质之间有相互作用。
当一定频率（一定能量）的红外光照射分子时，如果分子中某个基团的振动频率和外界红外辐射的频率一致，就满足了第一个条件。
为满足第二个条件，分子必须有偶极短的改变。
任何分子就其整个分子而言，是呈电中性的，但由于构成分子的各原子因价电子得失的难易，而表现出不同的电负性，分子也因此而显示不同的极性，通常用分子的偶极矩来描述分子极性的大小。
由于分子内原子处于在其平衡位置不断振动的状态，在振动过程中的瞬时值亦不断地发生变化，分子具有确定的偶极距变化频率，上述物质吸收辐射的第二个条件，实质上是外界辐射能量迁移它的到分子中去。
而这种能量的转移是通过偶极距的变化来实现的。
可用图2-1的示意简图来说明。
当偶极子处在电磁辐射的电场中时，此电场作周期性反转，偶极子将经受交替的作用力而增加和减小。
由于偶极子具有一定的原有振动频率，显然，只有当辐射频率与偶极子频率相匹配时，分子才与辐射发生相互作用（振动偶合）而增加它的振动能，使振动加激（振幅加大），即分子由原来的基态振动跃迁到较高的振动能级。
可见，并非所有的振动都会产生红外吸收，只有发生偶极距变化的振动才能引起可观测的红外吸收谱带，我们称这种振动活性为红外活性的，反之则称为非红外活性的。
图1-1偶极子在交变电场中的作用示意图
由上可见，当一定频率的红外光照射分子时，如果分子中某个基团的振动频率和它一样，二者就会产生共振，此时光的能量通过分子偶极距的变化而传递给分子，这个基团就吸收一定频率的红外光，产生振动跃迁；如果红外光的振动频率和分子中各基团的振动频率不符合，该部分的红外光就不会被吸收。
因此若用连续改变频率的红外光照射某试样，由于该试样对不同频率的红外光的吸收与否，使通过试样后的红外光在一些波长范围内变弱（被吸收），在另一些范围内则较强（不吸收）。
将分子吸收红外光的情况用仪器记录，就得到该试样的红外吸收光谱图，如图2-2所示。
图1-2烯烃（CH3-（CH2）3-CH=CH2）的红外光谱图
三、仪器与试剂
傅立叶红外光谱仪（IRPretige-21，日本岛津公司），压片机，不锈钢模具和样品架，玛瑙研钵，KBr晶片，不锈钢刮刀，不锈钢镊子，红外烤箱。
苯乙酸（分析纯），KBr粉末（光谱纯），丁二醇（分析纯），无水乙醇（分析纯）。
四、样品准备及其要求
红外光谱是通过检测分子特征官能团进而推断物质结构的一种方法，多用于物质化学结构的定性测试，因此红外光谱测试的样品必须是反应前后分子中官能团发生变化的物质；如果反应前后分子的官能团没有发生变化，进行红外光谱实验没有任何的意义。
一般要想得到一张质量相对较好的红外谱图，对所做的样品有明确的基本要求：
（1）试样纯度应>98%；
（2）试样中不应含有游离水；（3）试样透射比最好处于10%～80%范围内。
五、实验操作步骤
1.溴化钾压片制备样品
将3mg的苯乙酸放入玛瑙研钵中，加入300mg干燥的KBr粉末，混合研磨使其分散均匀，使其粒度在2.5μm一下，用不锈钢刮刀移取200mg混合粉末于不锈钢模具中，在16MPa的压力下，加压半分钟即可制的透明的样品。
2.液膜法制备样品（演示内容）
在两个窗片之间，取一滴丁二醇涂覆于KBr晶片上，使其在晶片上形成一层液膜。
液膜的厚度可以通过调节液体池架上的螺丝调节。
3.分别记录苯乙酸和丁二醇的红外光谱。
4.注意事项：
（1）注意潮气对测试结果的影响
（2）注意振动对测试结果的影响。
六、红外谱图分析
所谓谱图解析就是根据实验得的红外光谱图的吸收峰位置、强度和形状，利用基团振动频率与分子结构的关系，确定吸收带的归属，确认分子中所含的基团或键，进而推定分子的结构。
简单地说，就是根据红外光谱所提供的信息，正确地把化合物的结构“翻译”出来。
1.准备工作
在进行未知物光谱解析之前，必须对样品有透彻的了解，根据样品存在的形态，选择适当的制样方法；注意视察样品的颜色、气味等，它们住往是判断未知物结构的佐证；样品的相对分子质量、沸点、熔点、折光率、旋光率等物理常数，可作光谱解释的旁证，并有助于缩小化合物的范围。
2确定不饱和度
由元素分析的结果可求出化合物的经验式，由相对分子质量可求出其化学式，并求出不饱和度。
从不饱和度可推出化合物可能的范围。
不饱和度是表示有机分子中碳原子的不饱和程度。
计算不饱和度的经验公式为：
=1+n4+（n3-n1）/2
式中n4、n3、n1分别为分子中所含的四价、三价和一价元素原子的数目。
二价原子如S、O等不参加计算。
当计算得：
当=0时，表示分子是饱和的，应在链状烃及其不含双键的衍生物。
当=1时，可能有一个双键或脂环；
当=2时，可能有两个双键和脂环，也可能有一个叁键；
当=4时，可能有一个苯环等。
3谱图解析
图谱的解析主要是靠长期的实践、经验的积累，至今仍没有一个特定的办法。
一般程序是先官能团区，后指纹区；先强峰后弱峰；先否定后肯定。
首先在官能团区（4000~1300cm-1）搜寻官能团的特征伸缩振动，再根据指纹区的吸收情况，进一步确认该基团的存在以及与其它基团的结合方式。
如果是芳香族化合物，应定出苯环取代位置。
最后再结合样品的其它分析资料，综合判断分析结果，提出最可能的结构式，然后用已知样品或标准图谱对照，核对判断的结果是否正确。
如果样品为新化合物，则需要结合紫外、质谱、核磁等数据，才能决定所提的结构是否正确。
图1-3正己烷的红外谱图
（C-H伸缩振动3000~2800cm-1；C-H弯曲振动1500~1300cm-1）
图1-43-戊酮的红外谱图
（2900-2800cm-1，C-H伸缩振动；1700C=O的伸缩振动）
图1-5丁醛的红外谱图
（2900-2800cm-1，C-H伸缩振动；2730cm-1，CHO，伸缩振动；1700C=O伸缩振动）
通过以上谱图的分析方法，分析苯乙酸和丁二醇的红外谱图，指出各个特征吸收峰的与分子结构之间的对应关系。
七、思考题
1.用压片法制样时，为什么要求研磨到颗粒粒度在2μm左右？
研磨时不在红外
下操作，谱图上会出现什么情况？
2.对于一些高聚物材料，很难研磨成细小的颗粒，采用什么制样方法比较好
实验二电感耦合等离子体发射光谱法测定自来水中的钙、钠、钾
一、实验目的
1.学习电感耦合等离子体原子发射光谱分析的基本原理。
2.了解电感耦合等离子体的工作原理。
3.掌握电感耦合等离子体原子发射光谱法测定水中金属离子的实验技术。
二、实验原理
电感耦合等离子体（InductivelyCoupledPlasma，ICP）是原子发射光谱（AtomEmissionSpectrum，AES）的重要高效光源。
等离子体是一种原子大部分已电离的气体。
它是电的良导体，因其中的正、负电荷密度几乎相等，所以从整体来看它是电中性的。
在ICP-AES测定中，测试溶液首先进入雾化系统，并在其中转化成气溶胶，一部分细微颗粒被氩气载入等离子体的环形中心。
进入等离子体焰炬的气溶胶在高温作用下，经历蒸发、干燥、分解、原子化和电离过程，所产生的原子和离子被激发，并发出特定波长的光。
发射光通过入射狭缝进入光谱仪，照射在光栅上。
光栅通过出射狭缝照射在光电倍增管上产生电信号，此信号输入计算机后与标准的信号相比较，从而计算试液的浓度。
电感耦合等离子体焰炬的形成原理：
等离子炬管由三层同心石英管组成，外边两层通氩气作为炬管冷却等离子工作气体，内层为样品通道。
感应线圈通常用紫铜管环绕2-5匝，高频发生器输出的高频电流在感应线圈内流过，在感应线圈的轴线方向产生一个强烈振荡电场。
经高频装置产生火花，氩气部分电离，在高频磁场的加速作用下，带电离子与气体发生碰撞，形成越来越多的电子、离子，电子、离子在垂直于磁场方向的截面上就会感应生成流经闭合圆形路径的涡流，其产生的高热又将气体加热，瞬间形成最高温度达10000℃的稳定的等离子体焰炬。
氩气流在此刻就起到变压器中一匝闭路的次级线圈的作用，它与铜管线圈发生耦合。
形成的等离子体焰炬通过耦合作用从高频发生器源源不断地获得能量。
三、送样要求
1.提供样品来源、种类、属性（如矿石、合金、硅酸盐、特种固熔体、高聚物等）。
尽可能列出主要成份、杂质成份及其（估计）含量；待检元素中最低（估计）含量是多少？
对于溶液，请写明介质成份（溶剂、酸碱的种类及其（估计）含量）、含氟（F-）与否？
因为氟（F-）将严重腐蚀雾化器！
2.固体样品要制成不含任何有机物的溶液，其最终酸度控制为5%，样品量为5-50ml。
如含悬浮物或沉淀，务必过滤；另请同时送上试剂空白溶液用作扣除空白。
3.样品要求处理成溶液以后才送至分析测试中心。
四、仪器与试剂
1.美国PE公司Optima2000DV等离子体原子发射光谱仪。
2.聚乙烯试剂瓶（500mL），烧杯（500mL），容量瓶（50mL，100mL），吸量管（0.5mL，0.1mL）
3.1.000g/L的Ca标准贮备溶液；1.000g/L的Na标准贮备溶液；1.000g/L的K标准贮备溶液；
五、实验内容
1.标准系列溶液的配制
在两个干净的100mL容量瓶中，分别加入0.5mL的Ca、Na、K标准贮备溶液，加去离子水稀释至刻度，摇匀。
在两个干净的50mL容量瓶中，分别加入0.1mL的Ca、Na、K标准贮备溶液，加去离子水稀释至刻度，摇匀。
2.未知试样溶液的配制
取2mL自来水于25mL容量瓶中，加去离子水稀释至刻度，摇匀。
3.测试步骤
A、开机程序
（1）打开室内排气装置。
（2）打开PolyscienceChiller电源，将Power打到ON，温度调节到20℃，压力调到45－80psig。
（3）打开空压机，切割气的输出压力为40－120psig。
打开氩气，输出压力为80－120psig。
（4）打开ICP主机电源。
打开计算机，运行ICPWinlabSoftware，击PlasmaControl，点火。
（5）进入到方法编辑页面。
在方法编辑页面里分别输入被测元素的各种参数。
（6）按下述操作进行分析测试。
B、工作曲线和试样分析
（1）吸入空白溶液，得到空白溶液中Ca、Na、K的发射信号强度。
（2）由低浓度至高浓度分别吸入混合标准溶液，得到不同浓度所对应的Ca、Na、K的发射信号强度。
（3）吸入样品溶液，分别得到Ca、Na、K的发射信号强度。
C、关机程序
（1）吸入蒸馏水冲洗进样系统5min，排空进样系统，停火，退出Winlab操作界面。
（2）依次关闭ICP，PolyscienceChiller，真空泵，氩气，及排气装置。
（3）排空空压机内的水，将空气过滤器倒转过来，排出内部水气。
六、结果处理
1.工作曲线和结果分析
（1）调出工作曲线，查看线性系数。
（2）打开ExaminSpectra窗口，观察光谱干扰并进行校正。
2.结果打印
从DataManager里调出结果信息，应用软件设置编辑合适的输出格式，打印结果。
七、思考题
1.简述等离子体焰炬形成的过程。
2.通过实验，你体会到ICP-AES分析法有哪些优点？
附：
AA-6300型原子吸收分光光度计
一、送样要求
1.现有12个空心阴极灯，可定量测定Zn，Mg，Cu，Na，K，Fe，Cr，Pb，Bi，Co，Ni，Mn元素的含量。
2.可测定矿物、金属、玻璃、陶瓷、水泥、土壤、河水、地下水、饮用水、污水、食品、生物等试样中的金属元素含量。
3.送检样品应为液体，溶液体积不少于10mL；送样者应提供样品主要成分组成及大概浓度范围。
4.若对样品检测有特殊要求，送样者应提供相关检测标准。
5.样品应标识清楚。
二、仪器的结构
着重讲解光源、原子化器的结构
三、标准曲线的浓度范围
制备标准样品溶液时，要使未知样品溶液的浓度落在标准系列的浓度范围内。
通常在原子吸收光谱法中，吸收在0.5以下校准曲线呈现线性，因此最好校准曲线的吸收在0.3左右。
原子吸收光谱法中吸收灵敏度一般用1%吸收值（0.0044Abs。
）或检测限值表示。
1%吸收值是给出0.0044吸收的样品的浓度；检测限值是相对于2倍噪声高度的样品浓度。
因为1%吸收灵敏度相当于0.004Abs。
校准曲线的浓度设置，低限样品的浓度应该相当于10倍的1%吸收值的浓度，上限相当于70~80倍的1%吸收值的浓度，则吸收在0.04~0.3之间，可认为是最优的校准曲线的浓度范围。
如从检测限值决定校准曲线的浓度范围，校准曲线的最高浓度应该约1000倍检测限值，因为检测限值相当于1/10~1/20的1%吸收值。
实验三分子荧光法测定维生素B2
一、实验目的
1.学习选择荧光激发和发射波长的方法
2.掌握荧光定量分析方法
3.掌握荧光光度计的基本构造和使用方法
二、基本原理
某些物质受到一定波长的光照射时，可发射出较长波长的光，而停止照射时，这种光随之消失，这种光称为荧光。
根据分子荧光强度与待测物质浓度成正比的关系，可对待测物进行定量分析。
这种分析方法称为荧光分析法，它具有极高的灵敏度，在生物分析、食品分析与环境分析等方面是十分有用的分析手段。
在稀溶液中，荧光强度人与人射光的强度I0、荧光量子效率φF以及荧光物质的浓度C等有关，可表示为
式中K为比例常数，与仪器性能有关，ε为摩尔吸光系数，b为液层厚度。
所以，当仪器的参数固定后，以最大激发波长的光为人射光，测定最大发射波长光的强度时，荧光强度I。
与荧光物质的浓度C成正比。
维生素B2即核黄素，它是一种典型的芳香族荧光物质，结构式、激发光谱与发射光谱如上图。
VB2在430~440nm蓝光照射下，维生素B2就会发生绿色荧光，荧光峰值波长为535nm。
在pH=6~7的溶液中其荧光最强，在pH=11时其荧光消失。
维生素B2在碱溶液中经光线照射后，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比核黄素的荧光强的多，因此测定维生素Ｂ2的荧光时，溶液要控制在酸性范围内，切必须在避光条件下进行。
YPO4:
Eu3+的激发光谱和荧光光谱见下图。
YPO4:
Eu3+纳米晶的激发光谱（λem=593nm）YPO4:
Eu3+纳米晶的发射光谱（λex=393nm）
三、仪器及试剂
1.仪器：
HITACHIF－4500型荧光光度计，配1cm石英比色皿。
100mL棕色容量瓶2个，50mL棕色容量瓶6个，1mL、5ml移液管各1支
2.试剂：
10.0μg·mL-1VB2标准溶液，由100μg·mL-1VB2贮备液稀释。
未知水样；YBO4:
Eu3+固体粉末。
四、操作步骤
1.开启计算机和主机，联机、调节参数（方法如下）：
（1）按顺序打开荧光光度计poweron、Xelampstart（按下后Xe指示灯亮）、Mainon开关，然后启动FLsolution2.0，联机自检。
（2）自检完毕后，点击method，选择instrument，在此窗口输入适当的参数（输入激发波长、发射波长、扫描速度、狭缝、灯，扫描模式选择波长扫描，数据方式选择荧光），点击确定，在绿色ready出现后即可进行测试。
（3）实验结束，先关闭FLsolution，然后依次关闭Mainon、Poweron开关。
2.VB2溶液的激发光谱和发射光谱的绘制
取已稀释的维生素B2溶液绘制其激发光谱和发射光谱曲线，并确定其最大激发波长和最大发射波长。
3.标准曲线的绘制
取五个50毫升容量瓶，分别加入1.00，2.00，3.00，4.00及5.00毫升VB2标准溶液，用水稀释至刻度，摇匀，配制标准系列溶液。
根据维生素B2的激发光谱和发射光谱，测量上述标准溶液的荧光强度。
绘制标准曲线。
4.未知水样的分析
将未知样品溶液置于50毫升容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
用绘制标准曲线时相同的条件，测量荧光强度。
5.YBO4:
Eu3+固体粉末的激发光谱和发射光谱的绘制
五、数据记录及处理
1．VB2的最大激发波长λexnm,最大发射波长λemnm。
2.记录未知样品的荧光强度，并从标准曲线上求得其原始浓度。
加入试剂量（mL）
1
2
3
4
5
回归方程
VB2标准溶液浓度（μg·mL-1）
VB2标准溶液相对荧光强度
未知水样的相对荧光强度
未知水样的VB2含量（μg·mL-1）
3.YBO4:
Eu3+的最大激发波长λexnm,最大发射波长λemnm。
六、注意事项
1.荧光光度计要按操作规程使用。
2.绘制吸收曲线或标准曲线应使用方格坐标纸或作图软件。
七、思考题
1.在荧光测量时，为什么激发光的入射与荧光的接收不在一直线上，而呈一定角度？
2.如何绘制激发光谱和发射光谱？
3.哪些因素可能会对VB2荧光产生影响？
实验四高效液相色谱定性定量分析
一、实验内容
（一）实验目的：
1.了解高效液相色谱仪的结构并熟悉用微机控制实验参数的方法。
2.掌握用数据微处理机计算色谱参数和测定各组分含量的方法。
3.了解反相键合相高效液相色谱法的基本原理以及操作条件的选择，进行实际样品的测定。
4．掌握液相色谱仪定量测量的方法和基本的谱图定性定量分析。
（二）实验原理
液相色谱仪的结构和操作原理
外标法线形拟合曲线拟合值得的计算方法以及意义，如何利用拟合公式求得未知浓度
（三）实验仪器与试剂
1.仪器
高效液相色谱仪LC-10ATvpSPD-10Avp超声波清洗器l台色谱柱微量注射（25μL）1只真空过滤器1台
2.试剂
甲醇（色谱纯）超纯水甲硝唑（分析纯）
3.实验步骤
色谱条件：
色谱柱150mm×4.6mm（i.d.）,VP-ODS
柱温室温进样体积20μL
流动相甲醇:
水=20:
80
流动相流速1.0（mL/min）
检测器UV，检测波长310nm
（1）标准溶液的配制
准确称取甲硝唑，先用少量甲醇溶解，然后移入25mL容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，得到标准溶液，浓度为0.15（mg/mL）。
然后稀释标准溶液，得到5组不同浓度梯度溶液。
另配一组未知浓度。
（2）HPLC仪器操作
开机运行
1.打开色谱仪的泵开关，稳定仪器，设定流速。
2.打开色谱仪的紫外检测器开关，稳定后，设定检测波长。
3.打开电脑电源开关，打开N2000在线工作站，选择通道1接受数据，设定实验平台选项以及数据保存路径（保存路径更改后，需要重起工作站，使新的设置生效）。
4.逆时针旋动泵上drain旋钮180度，按purge键，排除前面管道里的气泡。
排除后，再按purge键，然后顺时针旋转drain按钮至原位置。
5.按pump键，将处理好的流通相送液，稳定柱子30分钟。
在工作站中点开查看基线，并归零，待基线稳定后再进样。
6.进样最多20μl进样前，注意检查，使针管中不要有气泡。
进样时，扳起进样阀，将针头水平推到底，进样，扳下进样阀，工作站自动开始检测样品。
7.检测完毕后应用纯甲醇冲洗柱子，流速0.5ml/min，30分钟（如使用缓冲盐流动相请先用水冲洗流路10分钟），至柱压稳定。
8.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。
设定前述色谱操作条件和合适的色谱微处理机参数，待HPLC运行稳定、基线平直并测定斜率后，注入最低浓度样品20μL。
并依次进行其他4个梯度浓度的样品。
（3）数据处理
观察记录5组不同浓度甲硝唑的保留时间、峰高、峰面积，对峰高和峰面积分别进行线形分析，得出拟合线形方程和R值。
由拟和公式求出未知浓度。
（四）思考题
1．液相色谱操作过程中需要注意哪些问题会影响你的实验结果，如何影响？
2．在你专业中举出一个液相色谱实例并附色谱实验条件。
二、实验总结——你需要知道的问题
1、高效液相色谱法的应用范围
（1）液相能做的事情——定性、定量、分离制备
（2）液相应用的范围
2、来实验条件
（1）我的实验目的是什么
（2）所需要液相仪器的类型：
流动相，色谱柱，检测器，标准品的准备以及其他条件
3、样品预处理
（1）为什么要进行样品预处理，去除杂质，提高检测灵敏度，提高与流动相的兼容性
（2）液液萃取，液固萃取，膜技术，衍生化和柱浓缩
色谱图分析和调整
（1）定性分析：
利用已知标准样，检测器的选择性，紫外检测器的全波长扫描，盖面流动相组成时被测组分的保留值变化规律，收集之后用别的方法检测
（2）定量分析:
：
峰面积的测量，定量计算的几种方法。
（3）如何修改色谱图
4、液相实验中应注意的问题
可分析挥发性查，极性强，具有生物活性，热稳定性差的大分子量有机化合物，样品要求俄可以溶于有机溶剂。
（1）样品要求：
送样量，完全溶于溶剂并过滤，不含金属离子、表面活性剂、磷酸盐等不挥发盐，pH值：
5~7，标明内容物的大致成分和相对含量，样品标识清楚
（2）送样写清自己的要求，提供检测标准和实验条件
（3）易燃易爆毒害腐蚀样品必须注明
5、制备药品和流动相
（1）制备药品所需溶剂以及流动相所需药品应采用色谱纯级别的药品，其中水应采用双蒸水以上级别的水，以免影响分析结果或者损伤以其性能。
（2）流通相在配制应遵循以下步骤，以免影响实验结果或者缩短色谱柱寿命。
流动相配好后应先过滤（使用0.45um或更细的膜过滤），并针对流动相性质，选择水相或者有机相的过滤膜；然后在超声波仪中脱气20-30分钟，排除液体内气泡，；最后在室温下静置流通相15分钟，使其温度与室温平衡。
（3）相同配比流动相不同配制顺序和方法都会对实验产生影响
（4）相同类型色谱柱不同型号对实验产生的影响
所检测药品应根据药品溶剂的性质采用水相或者流动相的过滤膜用针筒进行过滤。
6、维护保养
1）平时用纯甲醇保持柱子。
2）不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。
3）使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子（一小时），然后用甲醇（或甲醇水溶液）冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。
对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。
4）长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相（如甲醇等），因为纯水易长霉。
再上柱子的时候注意仪器柱子两头管子应伸出堵头并旋紧，防止漏液。
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