消毒剂消毒效果验证报告.docx

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消毒剂消毒效果验证报告

消毒剂消毒效果的验证

组长：

***

组员：

******

******

******

******

***

编号：

201412151135

版次：

2014年第1版

目录

1．概述3

1.1消毒剂3

1.2消毒剂使用说明3

2．验证目的3

3．验证内容4

4．验证组织4

4.1验证小组4

4.2验证委员会4

5．验证实施步骤5

5.1验证前准备5

5.2验证所需文件资料5

5.3悬液法定量杀灭试验6

5.4对裸手消毒效果试验7

5.5消毒剂对佩戴手套后的消毒效果验证9

5.6消毒剂对物体表面消毒效果验证11

5.7消毒剂消毒效果验证结论15

6．验证主要依据15

7．验证合格标准15

7.1判断标准15

7.2现场考察试验合格标准15

8.再验证周期15

附录16

附录一验证方案会审记录16

附录二验证方案修改申请及批准书17

附录三漏项和偏差处理记录18

附录四悬液法定量杀灭试验记录19

附录五消毒剂对佩戴手套后人员手现场试验记录22

1．概述

1.1消毒剂

消毒剂的作用原理：

破坏细胞膜类，阻断细胞食物摄取和废物排泄，钝化关键酶。

以下是几种常用的消毒剂：

（1）新洁尔灭（苯扎溴铵）：

是一种常用的季铵盐类消毒剂，在浓度较低时即可有抑菌的作用；当浓度较高时，可以杀灭多种细菌繁殖体和部分的病毒，但是不能杀灭细菌芽孢，属于低效消毒剂。

（2）75%乙醇：

适用于一般物体表面消毒以及手和皮肤的消毒，它无法杀灭细菌芽孢和病毒。

（3）优洁：

属于长效、强效、广谱杀菌剂，是一种新型消毒剂，其有效成分为复合季铵盐和六亚甲基四胺，可有效快速地杀灭细菌繁殖体、芽孢、真菌和部分病毒等，各种微生物对其均无抗药性，抑菌时间较长，可用于一般物体表面消毒，稳定性好，无腐蚀性，无毒无害，并且由于杀菌时不受蛋白质及有机物的干扰，故使用衰减周期长，可循环使用，相对使用成本低。

本次验证以优洁消毒剂的杀灭效果为主，同时也可根据此验证方案对75%乙醇、新洁尔灭等消毒剂的杀灭效果进行评价。

1.2消毒剂使用说明

对于不同的消毒对象，应使用不同的消毒剂，并制订消毒程序，消毒程序中应明确规定：

（1）消毒剂的浓度及配制方法；

（2）消毒剂使用的条件；

（3）消毒使用的设备、设施；

（4）消毒操作的详细步骤；

（5）消毒周期；

（5）消毒效果的监测方法。

制订的消毒程序的消毒效果应经过验证后，才能批准使用。

本验证具体规定了评价消毒剂消毒效力的生物学检测方法及其效果评价方法。

2．验证目的

药品在生产过程中会遭到来自微生物的污染，因此必须要采取一定措施使微生物污染处于受控状态或者完全被消除，这就需要对消毒剂消毒效果进行验证以确定相应的方案来处理这些问题。

在对消毒剂进行消毒效果验证的过程中，主要是要用特定的微生物与消毒剂在规定的使用浓度下接触规定的时间后，对微生物进行培养计数，考察该消毒剂的消毒效果，确定消毒剂消毒后的最长有效时间，并对消毒剂对微生物的杀灭效果进行评价。

确认洁净区按照规定的清洁、消毒程序进行清洁消毒后，能够达到防止交叉污染的目的，并在消毒有效期内能确保达到生产工艺所需要的效果。

本次验证以优洁消毒剂的杀灭效果为主，同时也可根据此验证方案对75%乙醇、新洁尔灭等消毒剂的杀灭效果进行评价。

3．验证内容

消毒剂消毒效果验证包括两项考察：

实验室考察和现场考察。

实验室考察通常以悬液定量法为主，且试验须重复3次，而现场考察可用来评估消毒剂对相应设施的实际消毒效果。

在消毒剂消毒效果试验中，消毒方法和消毒对象有很多。

常用的方法有：

喷洒法，浸泡法，擦拭法等。

常见的对象有：

皮肤，洁净区的地面、墙面，设备表面等。

此次试验我们采用的消毒方法为喷洒法，消毒对象为人员裸手皮肤、人员佩戴无菌手套后的手套表面和物体表面。

根据消毒对象所制定相应的试验方案有：

悬液法定量杀灭试验、消毒剂对裸手消毒现场试验、载体喷雾定量杀菌试验、消毒剂对佩戴手套后的手消毒现场试验以及消毒剂对物体表面现场鉴定试验。

通过以上几种试验来对消毒剂消毒的效果进行验证。

4．验证组织

4.1验证小组

表4-1验证小组及职责

人员

部门

职务

职责

组

长

质保部

部门负责人

（1）负责成立验证小组，明确各验证成员职责

（2）负责组织起草验证方案、验证记录和验证报告

（3）负责验证方案、验证记录和验证报告的审核工作

组

员

质保部

验证管理员

（1）负责起草验证方案

（2）负责对试验结果进行统计分析

（3）负责起草验证报告

质保员

（1）负责现场取样

（2）负责验证过程在线监督

质检部

部门经理

（1）负责组织对样品的检验

（2）负责验证所需试剂、试液等的准备。

质检部

质检员

（1）负责样品的检验

（2）负责检验数据的收集、整理。

生产部

部门经理

负责组织现场操作，确保验证按进度进行。

卫生员

负责消毒液的配制和发放。

各工序

操作人员

（1）负责洁净厂房的清洁

（2）负责按消毒程序进行消毒。

设备部

部门经理

（1）负责仪器、仪表、量具的校正

（2）负责验证所用仪器、设备的安装、调试，并做好相应的记录

（3）负责纯化水的供给。

4.2验证委员会

4.2.1人员组成：

由企业质量副总、生产副总及生产部、质量保证部、质量检验部、设备动力部经理或主管组成。

4.2.2职责：

负责验证方案的审批；

负责验证的协调工作，以保证验证方案的顺利实施；

负责验证数据及结果的审核；

负责验证报告的审核；

负责确定该项验证的再验证周期；

负责验证证书的发放。

5．验证实施步骤

5.1验证前准备

在进行消毒剂消毒效果验证前，洁净厂房空气净化系统应经验证合格并正常运行，设备动力部应提供洁净厂房空气净化系统的验证报告、空气净化系统操作程序；与验证相关的各种设备、仪器均需通过相应验证，所需仪表、计量器具均需校验合格并具备校验证书。

5.2验证所需文件资料

表5-1验证所需的文件资料及存放处

资料名称

编号

存放处

活菌数检测操作规程

ZL-03-066

GMP办公室

菌落计数操作规程

ZL-03-070

GMP办公室

培养基配制操作规程

ZL-03-073

GMP办公室

培养基配制、使用管理规程

ZL-03-110

GMP办公室

消毒剂配制操作规程

WS-04-029

GMP办公室

消毒剂的使用操作规程

WS-04-030

GMP办公室

致病菌阳性菌株传代操作规程

ZL-03-075

GMP办公室

实验器具清洗操作规程

ZL-03-087

GMP办公室

实验器具灭菌、消毒及使用操作规程

ZL-03-088

GMP办公室

进出微生物限度实验室操作规程

ZL-03-259

GMP办公室

CHK型显微镜操作规程

SB-03-153

GMP办公室

厌氧罐操作规程

SB-03-156

GMP办公室

MS1型振荡器操作规程

SB-03-381

GMP办公室

BL610型电子天平操作规程

SB-03-324

GMP办公室

SKP-02B型电热恒温箱操作规程

SB-03-375

GMP办公室

SKP-02B型电热恒温箱清洁规程

SB-03-376

GMP办公室

微生物实验室清场操作规程

ZL-03-064

GMP办公室

破伤风杆菌检测操作规程

ZL-03-220

GMP办公室

DELTA-320PH计操作规程

SB-03-234

GMP办公室

致病菌阳性菌管理规程

ZL-03-112

GMP办公室

微波炉的操作规程

SB-03-177

GMP办公室

洁净区情场操作规程

ZL-03-112

GMP办公室

设备清洁操作规程

SB-03-187

GMP办公室

5.3悬液法定量杀灭试验

5.3.1试验所需要用的试剂

中和剂：

0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液（0.9%N.S）

活菌计数用培养基：

TSA培养基

稀释液：

磷酸盐缓冲液（PBS0.03mol/L

消毒剂配制用水：

纯化水

有机干扰物质

5.3.2试验所需要用的仪器

移液器、电动混匀器、计时器、生化培养箱

5.3.3试验所需要用的菌种

可根据《消毒技术规范》2008年版[4]“细菌定量杀灭试验”中指导，本次试验选择金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉。

再增加车间常见的菌：

洋葱伯克霍尔德菌。

5.3.4试验所需要用的消毒液的浓度及作用时间

根据优洁消毒液说明书建议浓度为1%-3%，作用时间为1-2min，但根据厂家验证报告0.1%及0.2%的浓度作用5min和15min也能符合规定，因此本次试验浓度选择0.2%，作用时间选择2.5min、5min以及7.5min的条件进行确认，又因车间裸手消毒作用时间可能只有30s，故本次试验同时对0.2%消毒剂作用15s、30s以及45s的条件进行确认。

5.3.5试验所需要用到的场所

微生物实验室阳性间

5.3.6悬液定量杀菌试验操作程序

（1）菌悬液：

浓度为1×108cfu/ml-5×108cfu/ml

（2）消毒液的配制：

用纯化水按体积比配制浓度为0.2%的消毒液500ml

（3）磷酸盐缓冲液的配制：

磷酸盐缓冲液（PBS0.03mol/L）称取无水磷酸氢二钠2.83g、磷酸二氢钾1.36g加入到1000ml蒸馏水中，待完全溶解后，调PH至7.2-7.4，灭菌后使用。

（4）有机干扰物质的配制：

按30g牛血清白蛋白中加入1000ml蒸馏水的比例配制约100ml，溶解后用0.45um的无菌滤膜进行过滤除菌后使用，未用完的可于2-8℃冰箱中保存。

（5）试验过程（以浓度为0.2%优洁消毒剂对金黄色葡萄球菌作用2.5min为例）

试验组：

取无菌大试管加入0.5ml金黄色葡萄球菌菌悬液，再加入0.5ml的有机干扰物质，分别用无菌吸管吸取0.2%的优洁消毒液4.0ml，加入试管中，迅速混匀并立即计时。

待金黄色葡萄球菌与0.2%的优洁消毒液相互作用2.5min时，吸取0.5ml试验菌与消毒剂的混合液，加于4.5ml经灭菌的0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液中，混匀。

金黄色葡萄球菌与消毒剂混合液经硫代硫酸钠-生理盐水溶液作用10min后，吸取1.0ml样液，按活菌培养计数测定方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿即可。

如果菌液浓度较高时，可进行10倍系列稀释后，在进行活菌培养计数，作为试验组，其计数结果为CX。

阳性对照组：

用4.0ml磷酸盐缓冲液代替4.0ml0.2%的优洁消毒液与0.5ml金黄色葡萄球菌菌悬液、0.5ml有机干扰物质混合2.5min后，取0.5ml混合液与4.5ml0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液反应，作用10min后。

计数方法同试验组，计数结果为C0。

阴性对照组：

吸取此次试验用的纯化水0.5ml、0.5ml有机干扰物质、4.0ml磷酸盐缓冲液混匀，混匀后取0.5ml混合液与4.5ml0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液作用10min后，吸取1.0ml混合液，按活菌培养计数测定方法测定存活菌数，作为阴性对照。

培养：

所有用细菌试验的样品均放入30-35℃培养箱中培养，培养48小时观察结果；用真菌试验的样品放入23-28℃培养箱中培养，培养72小时观察结果。

5.3.7试验要求

作用于不同试验菌不同作用时间后的消毒效果试验均须进行3次，每次进行时应注意所用的试剂等物品均应重新配制，防止系统误差的发生。

5.3.8活菌计数结果应换算为对数值（N）

按计算公式杀灭对数值KL=阳性对照组平均浓度对数值（N0）-试验组活菌浓度对数值（NX）。

计算杀灭对数值的时候，取小数点后两位值，可以进行数字修约。

如果消毒试验组消毒处理后平均生产菌落数小于等于1时，其杀灭对数值，即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值。

5.3.9判断标准

阴性对照应无菌生长；细菌各次试验的杀灭对数值均应≥5.00，可判断为对细菌消毒合格；真菌各次试验的杀灭对数值为≥4.00，可判定该产品对真菌污染物消毒合格。

5.3.10试验记录

附件四悬液法定量杀灭试验记录第一次表5-2

第二次表5-3

第三次表5-4

5.3.11试验结

作用于不同试验菌不同作用时间后的消毒效果试验进行了3次，且每次试验结果均符合标准，所以判定0.2%优洁消毒剂通过悬液定量杀灭试验，对细菌、真菌消毒合格。

5.4对裸手消毒效果试验

5.4.1试验所需要用的试剂

Rodac碟培养基平板

5.4.2试验所需要用的仪器

计时器、生化培养箱

5.4.3试验所需要用的消毒液

浓度为0.2%的优洁消毒剂作用0.5min

5.4.4试验所需要用到的场所

抗肿瘤粉针车间

5.4.5试验的操作程序

从车间抽取6名生产人员，均按照标准洗手操作规程进行洗手，将手烘干，用0.2%的优洁消毒剂对双手进行喷洒消毒，自然晾干，于消毒后的0.5min将一手五指尖在Rodac平板上按压取样，于30-35℃培养箱中培养三天，观察最终结果。

5.4.6试验的判断标准

在消毒剂作用0.5min后6份样品的菌落数均须≤5cfu/皿，可判为合格，本次试验应重复进行三次，用来判断该方法是否稳定。

5.4.7试验记录

表5-5对裸手消毒效果试验第一次试验记录

试验人员

培养时间（cfu/皿）

可接受标准（cfu/皿）

结果判断

第一天

第二天

第三天

8001

0

2

9

≤5

不合格

8002

0

39

39

≤5

不合格

8003

0

1

3

≤5

合格

8004

0

40

40

≤5

不合格

8005

0

16

14

≤5

不合格

8006

0

2

4

≤5

合格

QA左手

0

0

0

0

合格

QA右手

0

0

0

0

合格

表5-6对裸手消毒效果试验第二次试验记录

试验人员

培养时间（cfu/皿）

可接受标准（cfu/皿）

结果判断

第一天

第二天

第三天

8001

0

33

31

≤5

不合格

8002

0

8

6

≤5

不合格

8003

0

100

105

≤5

不合格

8004

0

55

51

≤5

不合格

8005

0

33

36

≤5

不合格

8006

0

4

3

≤5

合格

QA左手

0

0

0

0

合格

QA右手

0

0

0

0

合格

表5-7对裸手消毒效果试验第三次试验记录

试验人员

培养时间（cfu/皿）

可接受标准（cfu/皿）

结果判断

第一天

第二天

第三天

8001

0

107

105

≤5

不合格

8002

0

60

60

≤5

不合格

8003

0

4

5

≤5

合格

8004

0

63

61

≤5

不合格

8005

0

36

36

≤5

不合格

8006

0

28

32

≤5

不合格

QA左手

0

0

0

0

合格

QA右手

0

0

0

0

合格

5.4.8试验结论

对车间人员进行了三次（每次6名）裸手消毒试验，试验结果显示基本不符合标准，因此判定0.2%浓度优洁消毒剂对人员裸手消毒0.5min试验不合格。

5.5消毒剂对佩戴手套后的消毒效果验证

5.5.1无菌手套载体喷雾定量杀菌试验

（1）试验所需要用的试剂

中和剂：

0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液（0.9%N.S）；

活菌计数用培养基：

TSA培养基；

稀释液：

磷酸盐缓冲液（PBS0.03mol/L）；

消毒剂配制用水：

纯化水

（2）试验所需要用的仪器

刻度吸管、数字可调移液器、电动混匀器、计时器、培养箱、无菌手套及无菌剪刀

（3）试验所需要用的菌种

本次试验主要是验证该消毒剂对手部微生物的消毒效果，故选择金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌作为试验菌。

（4）试验所需要用的消毒液的浓度及作用时间

浓度为0.2%优洁消毒剂作用0.5min

（5）试验所需要用到的场所

微生物实验室阳性间

（6）试验的操作步骤

①菌悬液：

浓度为1×108cfu/ml-5×108cfu/ml

②消毒液：

用纯化水按体积比配制浓度为0.2%的消毒液500ml

③稀释液：

磷酸盐缓冲液（PBS0.03mol/L）

试验组:

取无菌剪刀从无菌手套上剪取三个手指样品，大小为10mm×10mm以三角形阵列，均匀排布于一块未沾有任何消毒剂的无菌平皿内，逐片滴加10d的金黄色葡萄球菌，必要时用无菌接种环涂布均匀。

使制备后样品上的菌片浓度在5×105cfu/片-5×106cfu/片，用0.2%的优洁消毒剂对制备好含有金黄色葡萄球菌的样本进行均匀喷雾，喷雾的距离约为10cm，以尽量使喷到样本上的雾粒大小和数量一致。

喷雾量以不使样本湿透、流液为度，计时。

待金黄色葡萄球菌与消毒剂相互作用至0.5min，取出样本1片，放入一含有5.0ml0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液的无菌试管中。

将试管用电动混匀器混合20s，使菌片上的细菌被洗脱进入0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液中。

吸取1.0ml上述洗液，按活菌培养计数法测定存活菌数，每管接种2个平皿。

阳性对照组：

取无菌剪刀从无菌手套上剪取3个大小为10mm×10mm的手指样品，均匀排布于一块未沾有任何消毒剂的无菌平皿内，用制备好的符合菌液浓度的金黄色葡萄球菌滴加进去，必要时用涂布棒涂布均匀。

用磷酸盐缓冲液代替0.2%的优洁消毒剂对制备好的金黄色葡萄球菌的样本进行均匀喷雾，喷雾的距离约为10cm，以尽量使喷到样本上的雾粒大小和数量一致。

喷雾量以不使样本湿透、流液为度，计时。

待金黄色葡萄球菌与磷酸盐缓冲液相互作用至0.5min，取出样本1片，放入一含有5.0ml0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液的无菌试管中。

将试管用电动混匀器混合20s，使菌片上细菌被洗脱进入0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液中。

吸取1.0ml上述洗液，按活菌培养计数法测定存活菌数，每管接种2个平皿。

阴性对照组：

取无菌剪刀从同批无菌手套上剪取三个手指样品，大小为10mm×10mm均匀排布于一块未沾有任何消毒剂的无菌平皿内用。

用纯化水代替0.2%的优洁消毒剂对手套样本进行均匀喷雾，喷雾的距离约为10cm，以尽量使喷到样本上的雾粒大小和数量一致。

喷雾量以不使样本湿透、流液为度，计时。

0.5min后取出样本一片，放入一含5.0ml0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液的无菌试管中。

将试管用电动混匀器混合20s。

吸取1.0ml上述洗液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管接种2个平皿，作为阴性对照。

培养：

所有细菌试验用样本均在30-35℃培养箱中培养，培养至48h，观察最终结果；真菌试验用样本在23-28℃培养箱中培养，培养至72h，观察最终结果。

（7）试验要求及计算

试验重复3次，计算各组的活菌数（cfu/片），并换算为对数值（N），然后按计算公式杀灭对数值KL=阳性对照组平均浓度的对数值（N0）-试验组活菌浓度的对数值（NX）

（8）试验的判断标准

阴性对照组应无菌生长，消毒剂作用于各菌的不同作用时间的杀灭对数值≥3.00，即判定结果合格。

（9）试验的记录

表5-8无菌手套载体喷雾定量杀菌试验第一次试验记录

验证菌种

C0（cfu/片）

N0

CX（cfu/片）

NX

KL（N0-NX）

接受标准

结果判断

金黄色葡萄球菌

5.8×105

5.76

0

0

5.76

≥3.00

合格

大肠埃希菌

1.1×106

6.04

22

1.34

4.70

≥3.00

合格

白色念珠菌

5.4×104

4.73

0

0

4.73

≥3.00

合格

表5-9无菌手套载体喷雾定量杀菌试验第二次试验记录

验证菌种

C0（cfu/片）

N0

CX（cfu/片）

NX

KL（N0-NX）

接受标准

结果判断

金黄色葡萄球菌

5.8×105

5.76

0

0

5.76

≥3.00

合格

大肠埃希菌

1.1×106

6.04

11

1.04

5.00

≥3.00

合格

白色念珠菌

5.4×104

4.73

0

0

4.73

≥3.00

合格

表5-10无菌手套载体喷雾定量杀菌试验第三次试验记录

验证菌种

C0（cfu/片）

N0

CX（cfu/片）

NX

KL（N0-NX）

接受标准

结果判断

金黄色葡萄球菌

6.2×104

4.79

0

0

4.79

≥3.00

合格

大肠埃希菌

2.0×105

5.30

12

1.08

4.22

≥3.00

合格

白色念珠菌

2.7×104

4.43

0

0

4.43

≥3.00

合格

（10）试验的结论

浓度为0.2%优洁消毒剂，三次对无菌手套载体喷雾定量杀菌试验均符合标准，判定手套载体喷雾定量杀菌试验合格。

5.5.2消毒剂对佩戴手套后人员手现场消毒试验

（1）试验所需要用的试剂

Rodac碟培养基平板

（2）试验所需要用的仪器

计时器、生化培养箱

（3）试验所需要用的消毒液的浓度及取样时间

取5.5.1中符合规定的消毒剂浓度对人员手套消毒后0.5min、15min、35min分别取样

（4）试验所需要用到的场所

抗肿瘤分针车间或普通分针车间

（5）试验的操作步骤

从车间抽取12名生产人员，分别在A级区安排6名，B级区安排6名。

各自按照标准洗手操作规程进行洗手，将手烘干。

用试验浓度的优洁消毒剂对双手进行喷洒消毒，自然晾干，分别于消毒后0.5min、15min、35min将五指手指尖在Rodac平板上按压取样，取样后于30-35℃培养箱中培养三天，观察最终结果（0.5min取样后生产人员对双手重新进行消毒，之后应尽量模拟生产时的动作进行手部活动。

15min取样后无需重新消毒）

（6）试验的判断标准

在消毒剂作用不同时间后的菌落数的合格标准见下表5-11，每个时间段的6份样品必须全部符合标准，才可判断合格，本次试验应重复进行三次，用来判断该方法是否稳定。

表5-11菌落数的合格标准

洁净度级别

5指手套

A

<1cfu/皿

B

≤5cfu/皿

（7）试验的记录

附件五消毒剂对佩戴手套后人员手现场消毒试验记录A区第一次表5-12

B区第一次表5-13

（8）试验结论

0.2%优洁消毒剂于三次每个时间段的6份样品全部符合标准，可判断合格。

5.6消毒剂对物体表面消毒效果验证

5.6.1消毒剂对物体表面模拟现场鉴定试验

车间用于该消毒剂消毒的物体表面主要有不锈钢设备表面、地面、墙面以及呼吸袋，经过小试，将高浓度菌液（>104cfu/ml）涂抹于不锈钢设备表面、地面、墙面及呼吸袋，选择回收率较高的载体作为物体表面消毒效果试验室部分的试验载体。

判断标准：

回收菌液浓度：

>103cfu/ml。

（1）试验所需要用的试剂

中和剂：

0.1M硫代硫酸钠-生理盐水溶液（0.9%N.S）

活菌计数用培养基：

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