细胞生物室操作规范Word下载.docx

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3、把干粉加入水中，搅拌令之溶解；

4、加NaHCO3；

5、加水至最终量；

6、必要时用1HCl或1NNaOH调节pH；

因滤过时pH可能受影响；

7、用0.22μm滤膜滤过消毒。

三、胰蛋白酶溶液的配制

（1）将D-Han液高压消灭菌，用NaHCO3液调节PH至7．2左右；

（2）称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许消毒的盐溶液调成糊状，然后再补足盐溶液，搅拌混匀，量室温4小时或冰箱内过夜，并不时搅拌振荡；

（3）次日先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为0.25％或0.125%，胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调PH至7．2左右。

星形胶质细胞的原代培养

一、药品和试剂

　　DMEM（Gibco）培养基，添加10%胎牛血清（Hyclone）、4mmol/L-谷氨酞胺（Sigma）、10万U青霉素、10万U链霉素、15mmo/LHEPES（Sigma）；

0.25%、0.1%胰蛋白酶、75%酒精。

二、仪器设备与材料

无菌手术器械、超净台、医用离心机、空气浴振荡器、5%CO2恒温培养箱、倒置相差显微镜、细胞培养瓶、75μm筛网、细胞计数器、吸管等。

三、实验对象Wistar大鼠（天津药物研究院提供）

四、操作步骤

1、出生后2d内Wistar大鼠（天津药物研究院提供），无菌条件下断

头处死，取脑，投入D—Hsnk‘s平衡盐溶液中，去除中脑、脑脊膜及大血管．皮层剪碎成l一2mm3小块，吸管吹打1min；

2、0．25％胰蛋白酶消化10min；

3、1500r／min离心10min，收集沉淀，DMEM重悬；

4、75μm筛网过筛．滤液1500r／min离心10min，收集沉淀，以培养液重悬，调整细胞至1×

106个/毫升。

接种于75cm3培养瓶、5%Co2，95%空气，37℃饱和湿度培养。

5、4h后换液，弃掉非贴壁细胞。

6、5d后将培养瓶置于水平摇床，160r/min，2h，37℃，换液弃除小胶质细胞，恢复1h后．重新置于水平摇床、160r/min,18h,37℃,换液弃除少突胶质细胞。

8、2d后以胰蛋白酶0.1%,8min）消化、传代培养，待细胞长至近80%融合时用于实验。

脑皮层神经元的原代培养

　　DMEM（Gibco）培养基，添加15％FCS（Hyclone）、4mmol/L。

L—谷氨酰胺、10万U青霉素、10万U链霉素、15mmol/LHEPES；

0．2％胰蛋白酶／0．02％EDTA、2×

10-5mol/L阿糖胞苷、75%酒精。

无菌手术器械、解剖显微镜、超净台、医用离心机、5%CO2恒温培养箱、倒置相差显微镜、细胞培养板、75μm筛网、细胞计数器、吸管等。

三、实验动物：

16d龄Wistar大鼠

1、无菌条件下。

取16d龄Wistar大鼠胚胎脑，置于含7.5mmol/L葡萄糖的DMEM中，解剖显微镜下去除嗅球、脑脊膜、海马和基底核、将皮质剪碎成1mm3小块；

2、吸除DMEM，0．2％胰蛋白酶／0．02％EDTA消化1min，10%FCS终止消化，1000r/min离心10min；

3、用培养液重悬沉淀,75μm筛网过筛，调整细胞密度至1.0×

接种于预先涂有0.005％多聚赖氨酸（ploy—L—lysine、Sigma）的培养板中、5％Co2、95％空气。

37℃、饱和湿度培养。

4、30min后换液，弃掉非贴壁细胞；

5、2d后培养液中添加2×

10-5mol/L阿糖胞苷（Arac、Sigma）。

以抑制胶质细胞生长。

6、以后每3天换液一半。

神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫组织化学染色鉴定。

心脏微血管内皮细胞原代培养

　　RPMI1640培养基、胎牛血清、0.2%胶原酶（Ⅱ型）、0.1%胰蛋白酶（1∶250）、内皮细胞生长因子（ECGF）、无钙、镁的D-Hanks液、青、链霉素、75%酒精。

无菌手术器械、超净台、医用离心机、空气浴振荡器、5%CO2恒温培养箱、倒置相差显微镜、细胞培养瓶等。

三、实验对象新生4~6天Wistar大鼠

1、取新生4~6天Wistar大鼠，浸泡于75%酒精消毒3min。

2、将鼠仰放于无菌平皿中，在无菌条件下迅速开胸取出心脏。

3、将心脏放于盛有D-Hanks缓冲液的平皿，冲洗心脏残余血液。

4、用眼科镊去除心脏顶部瓣膜、大血管及结缔组织等。

5、用眼科剪剪开左心室，将心脏组织放于另一盛有D-Hanks缓冲液的平皿。

6、收集心脏组织置于75%酒精（去离子水配制）中浸泡30s。

7、取出心脏组织于新的D-Hanks液冲洗。

8、收集组织于无菌平皿中剪碎呈肉糜状。

9、收集于三角锥中，加入等体积0.2%胶原酶和0.1%胰蛋白酶，于37℃空气浴振荡器中振摇消化。

10、10min后收集上清液于离心管，1200转/分离心10min。

11、角锥中加入等体积0.2%胶原酶和0.1%胰蛋白酶，继续振摇消化。

12、心结束后，倾倒离心管上清液，加入含10~20%胎牛血清的RPMI-1640培养液吹打，接种于75cm2培养瓶中，于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。

13、化10min后，吸取三角锥中上清液过200目网筛，收集于离心管，1200转/分离心10min。

14、重复步骤12。

15、利用上一次离心后的上清液，加入三角锥继续振摇消化。

16、重复步骤13~15约2~3次。

最后一次去除步骤15。

17、2h后，去除各培养瓶内未粘附的细胞，换含10mg/LECGF的RPMI1640完全培养液，于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。

心肌细胞原代培养

　　RPMI1640培养基、胎牛血清、0.2%胶原酶（Ⅱ型）、0.1%胰蛋白酶（1∶250）、5’-溴脱氧尿苷（Brdu）、无钙、镁的D-Hanks液、青、链霉素、75%酒精。

1.步骤1~16同心脏微血管内皮细胞原代培养的操作。

2.2h后，收集未贴壁的心肌细胞重新悬于含10~20%胎牛血清1640培养液中，接种于75cm2培养瓶中，于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。

3.前3d加用0.1mmol/LBrdu以抑制非心肌细胞生长，直至心肌细胞铺满瓶底即可传代。

4.将最后一次消化剩余的心脏组织收集入75cm2培养瓶，加入含10~20%胎牛血清的RPMI-1640培养液，于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。

缺氧损伤模型的制作

一、主要仪器

缺氧装置、5%CO2恒温培养箱。

二、操作步骤

1.将细胞标本放于缺氧装置B罐内，关紧门。

2.依次打开真空泵开关、真空泵阀门、B罐开关。

3.当真空压力指针超过600mmHg，依次关闭真空泵阀门、真空泵开关。

4.依次打开输气阀开关、氮气罐开关。

5.当真空压力指针归零，依次关闭输气阀开关、氮气罐开关。

6.依次打开真空泵开关、真空泵阀门。

7.重复步骤3~5一次。

8.重复步骤6、3~4，当真空压力指针归零，依次关闭B罐开关、输气阀开关、氮气罐开关。

9.3h后，取出细胞标本，于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养1h。

动脉平滑肌细胞原代培养

D-Hanks液L—15平衡液、胰蛋白酶（GIBCO公司）；

DMEM（Gibco公司产品）、胎牛血清（FCS，Hyclone公司）；

Hepes；

75%乙醇。

无菌手术器械、小烧杯、超净台、医用离心机、5%CO2恒温培养箱、倒置相差显微镜、25cm2培养瓶、离心管等。

三、实验对象Wistar大鼠,雌性,体重150g左右。

1、将Wistar大鼠在严格的无菌条件下,取出胸腹主动脉,放入D-Hanks液中,剥离外膜,剪开动脉,用刀片轻巧地刮除内膜,在盛有D-Hanks液的小烧杯中剪成约1mm3大小的小块；

2、吸除D-Hanks液,转入25cm2的培养瓶中,在37。

C5%CO2孵箱中帖壁1小时,加入含20%特优胎牛血清（Hyclone公司产品）的DMEM（Gibco公司产品,加入25mMHepes,青霉素100IU/ml,链霉素100IU/ml）.

3、在第7-8天细胞已自组织块边缘处长出后,去除组织块并首次换液,以后每3天换一次液.

4、待细胞生长至接近融合时开始传代,倒去含血清的DMEM,D-Hanks液洗2次,0.25%胰酶1ml消化5-10分钟，在倒置相差显微镜下观察见胞质回缩,细胞间隙增大后,加入含血清的DMEM终止消化,吹打细胞制成细胞悬液,倒入离心管,800-1000转/分钟离心10分钟,倾去上清,以含10%胎牛血清的DMEM制成细胞悬液，分别接种于3个25cm2培养瓶中.

5、鉴定:

抗actin染色（SP法）:

将细胞悬液接种于放有盖玻片的6孔培养板中,待细胞贴壁生长2-3天后,倒去培养液,TBS（0.05M,pH7.6）洗5分钟*3次,4。

C预冷丙酮固定10分钟，TBS洗5分钟*3次，加封闭血清，37。

C孵育30分钟，TBS洗5分钟*3次，加一抗，抗体浓度1:

100,4

。

C下过夜,TBS洗5分钟*3次,加二抗（生物素标记兔抗山羊Ig）,37。

C孵育30分钟,TBS洗5分钟*3次,加三抗（辣根酶标记链霉卵白素工作液）,37。

C孵育30分钟,TBS洗5分钟*3次,滴加DAB-H2O2显色,常规脱水,透明封片.

肾小球系膜细胞培养

IV型胶原酶、胰蛋白酶、（Sigma公司产品）、RPMI-1640（GIBCO公司产品）、特等优级胎牛血清（FCS，Hyclone公司产品）。

无菌手术器械、倒置显微镜、超净台、医用离心机、5%CO2恒温培养箱、培养瓶及培养板（Costar公司产品）

二、实验对象

远交系健康雄性Wistar大鼠，体重150~200g，共12只，由国家医药管理局药物研究院实验动物室提供。

1.将大鼠处死，无菌取出双肾，取皮质，将其剪碎，依次经过140目、80目、200目过筛，在200目下收集肾小球细胞。

2.将提取的肾小球细胞，用无菌的1640培养液洗一次，离心，加入0.15%的

胶原酶消化，37℃水浴8分钟，1000r/min,离心7分钟。

3.用20%FBS1640培养液悬浮细胞，分装于培养瓶，放入CO2孵箱，第6-7天首次换液，以后每2-3天换液一次，待，系膜细胞布满瓶底，进行传代。

雪旺氏细胞原代培养

L—15平衡液、胰蛋白酶和胶原酶（GIBCO公司）；

DMEM培养液、胎牛血清（FCS，Hyclone公司）；

无菌手术器械、超净台、医用离心机、5%CO2恒温培养箱、倒置相差显微镜、35Ф细胞培养皿、离心管等。

1、取新生4~6天Wistar大鼠脱臼处死，乙醇消毒，在无菌条件下取双侧坐骨神经，置L—15平衡液中。

2、解剖显微镜下仔细去神经外膜，反复冲洗几次后，用眼科剪将其剪成2mm3大小的碎块，37℃下用0.25%胰蛋白酶和0.125%胶原酶混合液消化20分钟，加少量小牛血清以终止反应；

3、消化后用吸管反复吹打。

以分散Schwaun细胞，细胞在DMEM—10％FC5培养液中培养。

4、每日观察细胞生长状况，1周换液2次。

软骨细胞分离及体外培养

胰蛋白酶，

型胶元酶，DMEM培养基，Gibco；

青霉素，链霉素，Sigma；

N-（2-羟乙基）哌嗪N’-2-乙磺酸（HEPES），Boehringer；

抗坏血酸；

谷氨酰胺，Merck；

L-脯氨酸，上海政翔化学试剂研究室；

维生素C注射液，齐齐哈尔第二制药厂；

胎牛血清，TBD生物技术发展中心。

培养液：

DMEM培养基中加入4.5g/L葡萄糖，584mg/L谷氨酰胺，15%胎牛血清，50u/ml青霉素，50g/ml链霉素，10mMHEPES，0.4mM脯氨酸与50g/ml抗坏血酸，过滤除菌

超净工作台；

隔水式电热恒温培养箱；

CO2培养箱，美国；

恒温磁力搅拌器，81-2型，上海司乐仪器厂；

离心机，北京医用离心机厂；

倒置显微镜，光学显微镜，Nikon；

血细胞计数板，上海；

24孔培养板，48孔培养板，Costar，美国；

玻璃培养瓶、培养皿、盖玻片、烧杯、试管、漏斗若干；

手术刀，止血钳，眼科齿镊，眼科剪刀若干

（一）牛软骨细胞消化分离

1、从本地屠宰场获取4小时内宰杀的成年牛膝关节，用0.9%NaCl溶液湿润的无菌纱布包裹严密，携至实验室。

2、在超净工作台上进行无菌操作，将股骨远端关节面用含有50u/ml青霉素，50μg/ml链霉素的PBS溶液清洗干净，用手术刀切取1mm厚的牛关节软骨薄片，将其浸入PBS溶液中，剪切成1mm3大小的小块，从同一头牛两个膝关节可获得软骨小块约3

cm3。

3、用PBS溶液冲洗3次，置于50ml烧杯中，加入20ml的0.25%胰蛋白酶溶液和1cm长的磁力搅拌棒，用150ml烧杯和直径10cm的培养皿将其上下盖严，放在37℃恒温培养箱内的磁力搅拌器托盘上，以60rpm搅拌消化30min。

4、去掉胰蛋白酶溶液，将软骨小块用PBS溶液冲洗3次，加入15ml的0.2%

型胶原酶溶液，用与胰蛋白酶消化过程同样的温度和搅拌条件消化4h，分离软骨细胞。

5、消化结束后，使细胞悬液通过孔径45m的尼龙网滤器，滤去未消化的组织残渣，过滤后的细胞悬液以1000rpm转速离心10min分离细胞，弃去消化液。

用配制好的DMEM培养液洗涤细胞，1000rpm转速离心7min后弃去培养液，如此反复三次，可得到较为纯净的牛软骨细胞。

6、将细胞悬浮于5ml含有4.5g/L葡萄糖，584mg/L谷酰胺，15%胎牛血清，50u/ml青霉素，50g/ml链霉素，10mMHEPES，0.4mM脯氨酸与50g/ml抗坏血酸的DMEM培养基中，制成细胞悬液，备用。

用血细胞计数板计数，从一头牛的一个膝关节股骨远端收获细胞数约为4.9×

107。

（二）骨细胞消化分离

取4周龄新西兰种幼兔，处死后手术取出膝关节，然后在超净工作台上进行无菌操作，将股骨远端与胫骨近端关节面用含有50u/ml青霉素，50μg/ml链霉素的PBS溶液清洗干净，用手术刀切取1mm厚的牛关节软骨薄片，将其浸入PBS溶液中，剪切成1mm3大小的小块，以后的操作与2.2.2.1中方法相同。

从同一只家兔两个膝关节可收获细胞数约为2.1×

（三）软骨细胞与兔软骨细胞体外培养及传代

1、按以上方法制得细胞悬液，用培养液稀释至1-2×

105细胞/ml，分别接种到25cm2培养瓶中，每瓶约4ml，塞严胶塞，置于37℃含5％CO2培养箱中恒温培养。

培养三天后更换培养液，此后3天换液一次。

每天定时在倒置显微镜下观察，并照像记录。

2、当细胞贴壁生长，分泌基质，互相连接成单层时，即可进行传代培养。

首先弃去原培养瓶内的培养液，向25cm2培养瓶内加入0.25％胰蛋白酶液4ml，置37℃培养箱内20min。

3、镜下观察细胞相互分离，间隙变大，细胞趋于变圆，部分呈游离态时，小心倒出胰蛋白酶液，然后加入培养液，用吸管轻轻吹打，将细胞悬浮于培养液内，再分瓶培养。

4、瓶后的细胞即为第一代，培养方法与原代培养相同。

此后，按同样方法可再进行传代培养，依次得到第二代、第三代及第四代体外培养的软骨细胞，定时在倒置显微镜下观察，并记录。

（四）、体外培养软骨细胞的组织化学鉴定

1、标本制备

将盖玻片裁成8×

8mm见方的小块，清洗、灭菌后置于24孔培养板的培养孔内。

每孔加入0.2ml浓度为9.8×

105细胞/ml的细胞悬液，再加入培养液0.5ml，盖上盖子，置于37℃含5％CO2培养箱中恒温培养。

2、组织化学染色

将不同种类、不同培养时间、不同代的软骨细胞标本从培养液中取出，用PBS溶液冲洗2次，以梯度乙醇溶液逐级脱水，然后用1％茜素红、1％美蓝染液染色观察软骨细胞，2％甲苯胺蓝染液染色观察细胞外基质。

细胞冰冻与复苏

1.取对数生长期的细胞，以胰蛋白酶与EDTA混合液消化分散（悬浮细胞除外），以培养液稀释。

2.取适量细胞计数，并使成为2.5×

106个细胞/ml冻存液。

冻存液的成分为：

RPMI-164080%;

DMSO10%;

小牛血清10%

3.将一毫升细胞悬液分装于安瓿中，封口，标记。

4.将安瓿置4℃冰箱数小时，再移至-40℃--60℃冰箱12-24小时，然后立即投入液氮中。

5.复苏细胞时，将安瓿迅速投入38℃-40℃水浴中，并充分摇动，使其迅速融化。

6.将细胞移入离心管，1000r/min离心5分钟，弃上清，加入培养液，置温箱培养。

总RNA抽提

1、细胞裂解或组织匀浆。

a.贴壁细胞

吸尽培养液，每10平方厘米细胞加入1mlBeyozol。

一般六孔板每孔加1ml，12孔板每孔加0.5ml。

晃动3-5下，再用枪吹打2-3下，确保全部裂解，然后吸至离心管中。

b.悬浮细胞

离心收集细胞，吸尽液体，每五百万至一千万动植物或酵母细胞，或一千万细菌，加入1mlBeyozol。

用枪吹打或适当vortex，确保全部裂解。

某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，确保全部裂解。

c.组织

先将组织剪切成小块，放入普通玻璃匀浆器内。

每50mg-80mg组织加入1mlBeyozol，匀浆。

2、对于某些蛋白，多糖或脂含量很高的细胞或组织，Beyozol裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物。

需12,000×

g4℃离心10分钟，然后吸取澄清的Beyozol裂解产物至一新的离心管中。

3、室温放置5分钟，使样品充分裂解。

4、每毫升Beyozol加入0.2ml氯仿，vortex混匀或猛烈晃动15秒，室温放置2-3分钟。

5、12,000×

g4℃离心15分钟，然后吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中，每毫升Beyozol约可吸取0.5-0.55ml。

6、按每毫升最初的Beyozol加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。

7、12,000×

g4℃离心10分钟，在管底可见胶状RNA沉淀，弃上清。

8、每毫升最初的Beyozol加入1ml75%乙醇，vortex或颠倒混匀，

9、7,500×

g4℃离心5分钟，弃上清。

再用离心机甩一下（>

5,000rpm,离心1秒），小心吸尽液体。

10、待RNA略干后，加入20mlDEPC水溶解，-70℃冻存。

注意，切勿让RNA过分干燥，否则将极难溶解，且测出的A260/280值会低于1.6。

注意事项：

1、有离心管，枪头及相关溶液都必需无RNA酶污染。

耐高温器物可150烘烤4小时以除去RNA酶，其它器物除RNA酶可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。

溶液需用DEPC水配制。

加0.01%（体积比）diethylpyrocarbonate（DEPC）至重蒸水或MiliQ级水中，处理过夜，灭菌即成DEPC水。

2、必需戴一次性手套操作，且尽量不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA酶污染。

3、Beyozol含有毒物质苯酚，避免接触皮肤或吸入。

为防止溅入眼睛，请戴防护眼镜或使用透明保护屏。

如皮肤接触Beyozol，请立即用大量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。

PCR实验操作规范

由于PCR实验技术要求高，影响因素很多，因此要想得到较好的实验结果，应注意以下几个问题。

1、标本模板的处理

单、双链DNA或RNA都可以进行PCR，但临床检测标本往往是粗提物，

此对标本的要求不能混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂，以及能结合DNA的蛋白质，如果在标本处理完全的情况下，扩增带不理想，则要考虑核酸解链是否完全。

有时还可以考虑用SephadexC-50柱处理标本，得到满意的结果。

2、引物

引物的设计与合成纯化是PCR特异性反应的根本所在，若引物的纯度低（提纯及降解因素），实验结果就无法解释。

3、试剂的均匀性

保证试剂的溶解均匀性，打开使用时，每管试剂使用前应低速离心，使其沉入管底。

4、缓冲液

缓冲液、酶等反复冻融使用后，使PCR效果下降，甚至无效。

不同厂家的缓冲液中Mg2+浓度不同，因此不能互换各厂家的缓冲液，否则影响测试结果。

5、循环参数

解链不完全是导致PCR失败的主要因素之一，因此严格按试剂盒操作说明书设置的温度时间参数执行，否则使实验结果出现问题。

6、在分析电泳结果时，阳性标本没有得到扩增产物原因如下：

（1）、是否严格按照说明书操作

（2）、试剂使用前是否充分混匀

（3）、Taq酶因贮运不当而失活

（4）、变性温度是否准确，PCR仪指示温度与实验温度是否相符，过高则酶在前几个循环就迅速失活，过低则模板变性不彻底。

（5）、模板中含有抑制物，如陈旧甲醛固定及石蜡包埋组织常含甲酸，应抽取及纯化DNA，若脓液、分泌物中含抑制物过多时裂解前应用生理盐水反复洗涤。

（6）、反应系统中污染了核酸酶及蛋白酶，加Taq酶前将反应体系95℃加热5—10分钟。

（7）、试剂贮藏过久或不当而失效。

7、扩增产物在凝胶中涂布或成片状

（1）|酶量过高，减少用量

（2）复性温度（低温）过低

（3）电泳体系有问题

a、凝胶中缓冲液与电泳缓冲液浓度相差过大

b、凝胶没有凝固好

c、琼脂糖是否为电泳级的

8、扩增产物多带

（1）、复性温度过低

（2）、循环次数太多

（3）、样品处理不当

9、PCR污染导致假阳性

（1）、应隔离不同操作区

（2）、电泳点样加样器应专用，不带入扩增前操作区

（3）、使用一